JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, intraluminal fizyolojinin uzay-zamansal karakterizasyonu için mikroelektrotlar kullanılarak insan dokusundan türetilmiş mide organoidlerinde pH ölçümlerini açıklamaktadır.

Özet

Gastrointestinal organoid modellerin optimizasyonu ve ayrıntılı karakterizasyonu, luminal ortamlarını analiz etmek için gelişmiş yöntemler gerektirir. Bu makale, mikromanipülatör kontrollü mikroelektrotlar aracılığıyla 3D insan mide organoidlerinin lümeni içindeki pH'ın hassas ölçümü için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. pH mikroelektrotları ticari olarak temin edilebilir ve 25 μm çapında eğimli cam uçlardan oluşur. Ölçümler için, pH mikroelektrodu, Matrigel içinde süspanse edilmiş bir organoidin (>200 μm) lümenine ilerletilirken, bir referans elektrot kültür plakasındaki çevreleyen ortama daldırılır.

İnsan mide vücudundan türetilen organoidlerin profilini çıkarmak için bu tür mikroelektrotları kullanarak, luminal pH'ın her kültür kuyusu içinde ~ 7.7 ± 0.037'de nispeten tutarlı olduğunu ve en az 15 dakika boyunca sürekli ölçümlerin elde edilebileceğini gösteriyoruz. Bazı büyük organoidlerde, ölçümler epitel yüzeyi ile lümen arasında bir pH gradyanı ortaya çıkardı, bu da organoidlerdeki pH ölçümlerinin yüksek uzamsal çözünürlükle elde edilebileceğini düşündürdü. Önceki bir çalışmada, organoidlerdeki luminal oksijen konsantrasyonlarını ölçmek için mikroelektrotlar başarıyla kullanıldı ve bu da organoid analizleri için bu yöntemin çok yönlülüğünü gösterdi. Özetle, bu protokol, 3D organoidler içindeki karmaşık luminal boşluğun işlevsel karakterizasyonu için önemli bir aracı tanımlar.

Giriş

Organoidler - kök hücrelerden türetilen minyatür çok hücreli yapılar - insan fizyolojisini inceleme yeteneğimizde devrim yarattı ve düzenleyici ortamlarda bile hayvan modellerinin yerini almaya başladı1. 2009 yılında Sato ve arkadaşları tarafından bağırsak organoidlerinin ilk tanımından bu yana, organoid teknolojisi son derece popüler hale geldi2. Çok sayıda çalışma, organoid modellerin hücresel bileşimini ve işlevini ayrıntılı olarak karakterize etmiştir 3,4,5,6. Bununla birlikte, bu 3D çok hücreli yapıların luminal alanı büyük ölçüde tanımsız kalmaktadır 7,8. Lümen, polarize epitel hücrelerinin apikal kısımları ile çevrili mukozal dokulardan türetilen organoidlerin merkezi boşluğudur. Hücresel sekresyon ve emilim ağırlıklı olarak apikal epitel yüzeyinde meydana geldiğinden, organoidlerin luminal mikro çevresi bu önemli fizyolojik süreçler tarafından kontrol edilir. Şu anda kullanılan organoid modeller, hücre sinyal modellerinde, genel gövdede, metabolit konsantrasyon gradyanlarında ve çevresel koşullarda farklılıklar göstermektedir9. Bu nedenle organoid luminal fizyolojiyi anlamak, organ fonksiyonunun ve patolojisinin doğru modellenmesi için gereklidir. Ne yazık ki, lümenin göreceli olarak erişilemezliği, 3D organoidlerde luminal fizyolojinin fonksiyonel analizlerini önemli ölçüde engellemektedir10.

PH profillerini inceleme yeteneği, lümende yaklaşık 1-3 arasında değişen, 11,12,13 epitelinde nötre yakın olana kadar vücuttaki en dik proton gradyanına sahip olmasıyla ünlü midede özellikle önemlidir. Gastrik pH gradyanının mikro ölçekte sürdürülmesi ve organoid modellerin gastrik mukus tabakası boyunca bu dinamik ortamın özetlenmesindeki önemi hakkındaki anlayışımızda önemli bir boşluk bulunmaktadır. Organoid pH analizi için geleneksel yaklaşımlar, floresan veya kolorimetrik indikatörler olabilen pH'a duyarlı boyaların kullanımını içermektedir. McCracken ve ark. histamin tedavisine yanıt olarak luminal pH'daki bir düşüşü analiz etmek için organoidlere SNARF-5F-bir oransal pH indikatörünün luminal enjeksiyonunu kullandı. Bu tür boyalar, pH'ın gerçek zamanlı, invaziv olmayan izlenmesine izin verecek şekilde kültür ortamına dahil edilebilir. pH'a duyarlı boyalar, ölçümlerde düşük güvenilirlik ve doğruluğa katkıda bulunan karmaşık kalibrasyon adımları gerektirmekle kalmaz, aynı zamanda bu tür boyalar, ilgilenilen mikro ortam14,15 içindeki tam pH aralığını temsil etmeyebilecek belirli algılama aralıkları içinde çalışma eğilimindedir. Bununla birlikte, doğrulayıcı deneyler için gösterge boyalarının kullanılması makul kabul edilebilir. Floresan optod bazlı, pH algılama yaklaşımlarını kullanan optik nanosensörler de geliştirilmiştir; Bununla birlikte, bu tür algılama teknikleri mikroskobik görüntüleme gerektirir ve ayrıca fotoağartma, fototoksisite ve görüntüleme yanlılığına karşı hassastır16,17. Ek olarak, Brooks ve ark. üzerine organoidlerin kaplanabileceği mikroelektrotlar içeren 3D baskılı çok kuyulu plakalar18. Ancak bu yaklaşım, doğrudan organoid lümen içinde ölçümlere izin vermez.

Elektrot bazlı pH ölçümleri, diğer yöntemlere kıyasla daha fazla doğruluk sağlayabilir ve gerçek zamanlı pH izleme sağlayabilir. Ek olarak, mikromanipülatörlere monte edilen pH elektrotları, elektrot ucunun hassas konumu hassas bir şekilde kontrol edilebildiğinden, pH ölçümlerinin üstün uzamsal çözünürlüğüne izin verir. Bu, organoid modellerin analizlerinde mümkün olan en yüksek esnekliği ve tekrarlanabilirliği sağlar. Burada kullanılan elektrotlar, ince bir platin teli çevreleyen seçici pH camından protonların difüzyonuna dayalı olarak çalışan minyatür pH mikroelektrotlarıdır. Mikroelektrot, harici bir Ag-AgCl referans elektroduna bağlanır ve daha sonra yüksek empedanslı bir milivolt metreye bağlanır. Aynı çözeltiye daldırıldığında iki elektrot ucu arasındaki elektrik potansiyeli, çözeltinin19 pH'ını yansıtacaktır. Bu tür mikroprofil oluşturma sistemleri, biyofilmlerin20,21, planktonik alglerin22, insan balgam örneklerinin23 ve hatta mezenkimal kök hücre sferoidlerinin24 metabolik analizinde kullanılmıştır. Hem laboratuvarımız hem de Murphy ve ark. daha önce organoidlerin lümen boşluklarındaki oksijen konsantrasyonlarını değerlendirmek için mikromanipülatör kontrollü O2 mikroelektrotları kullanmışlardır. Murphy ve ark. bu yöntemi matematiksel modelleme ile eşleştirerek sferoidleri içinde bir oksijen gradyanı ortaya çıkardı. Grubumuz, çevredeki hücre dışı matriks25 ile karşılaştırıldığında, doku kaynaklı mide organoidlerinde azalmış luminal oksijen seviyeleri bulabildi.

Burada, karmaşık luminal mikro çevrelerinin daha iyi fizyolojik olarak anlaşılmasını sağlayacak küresel gastrointestinal sistem organoidlerinde luminal pH'ın manuel mikroelektrot profili için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniğin, mikro ölçekte pH seviyelerinin gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü ölçümleri yoluyla organoid fizyolojisinin araştırılmasına yeni bir boyut katacağını tahmin ediyoruz. Ayrıca, aşağıdaki protokol, çeşitli organoid model türlerindeO2, N2O, H2, NO, H2S, redoks ve sıcaklık analizi için kolayca uyarlanabilir. Fizyolojik profilleme, in vivo ortamları daha iyi taklit etmek için organoid kültür koşullarını optimize etmek için değerli bir araç olarak hizmet eder, böylece biyomedikal araştırmalarda organoid modellerin alaka düzeyini ve faydasını artırır.

Protokol

Bu protokol, farklı bir lümene sahip ve yapay bir hücre dışı matrise (ECM, örneğin Matrigel) gömülü olan en az 200 μm çapında 3D organoidler gerektirir. Organoid türevi için insan mide dokuları, Montana Eyalet Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayı ve Bozeman Health'te üst endoskopi yapılan hastalardan bilgilendirilmiş onam (protokol # 2023-48-FCR, D.B.'ye) veya Ulusal Hastalık Araştırma Değişimi'nden (protokol #DB062615-EX) muaf tam mide veya sleeve gastrektomi örnekleri olarak alındı. Bu çalışma için kullanılan organoid çizgileri ve geçiş numaraları hakkında bilgi Tablo 1'de verilmiştir ve ortam bileşimi Tablo 2'de listelenmiştir. Gastrointestinal organoid hatların oluşturulması ve bakımı için daha önce yayınlanmış protokollerebakın 6,26,27.

1. pH profili oluşturma için insan mide organoidlerinin hazırlanması

  1. Standart protokolleri kullanarak mide organoid kültürlerini başlatın ve sürdürün. Organoidleri, oyuk başına 500 μL genleşme ortamında 24 oyuklu plakalarda tutun (Tablo 2). Passage, pH profilleme deneylerine hazırlık olarak her 5-7 günde bir organoid hatları kurdu ve 35 mm'lik bir cam tabanlı tabağa aktardı.
    NOT: Deneylerimiz için organoid kültürler, yukarıda tarif edildiği gibi yetişkin dokusundan elde edilen mide bezi preparatlarından türetilmiştir. Daha önce tarif edildiği gibi, bu bezleri ECM'de askıya alınmadan önce izole etmek için bir kollajenaz doku sindirim yöntemi kullanıyoruz 25,28,29.
  2. 1-15 pasajlarında aktif olarak büyüyen organoid kültürlerden, 3,5 mm'lik Petri kaplarında transfer ve genişleme için çapları 200 ila 700 μm arasında olan en az 100 organoid (yaklaşık 2 milyon hücre) içeren kuyucukları seçin.
  3. Organoidleri kaplama için hazırlarken (aşama 1.4-1.8), hücre dışı matris (ECM) alikotlarının buz üzerinde en az 45 dakika çözülmesine izin verin. Jelleşmeyi önlemek için ECM'yi bu protokol boyunca buz üzerinde tutun. Hücre kültürü plakalarını 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirerek önceden ısıtın.
  4. Ortamı kuyucuklardan çıkarın ve buz gibi PBS'yi her bir ECM damlacığına pipetleyerek ve jeli bir P1000 pipetinin ucuyla çizerek mide organoid kültürlerini hasat edin. PBS'yi organoidler içeren ECM parçalarıyla 15 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin.
  5. Tüpü 200 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Organoidleri içeren ECM parçaları, tüpün dibinde bir tabaka olarak görünecektir. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve her tüpe 350 μL% 0.25 tripsin-EDTA pipetleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Tüpleri 37 ° C'lik bir su banyosunda 2-5 dakika inkübe edin.
  6. Tripsin-EDTA ile inkübasyonun ardından, her tüpe penisilin / streptomisin içeren 600 μL buz gibi soğuk DMEM ekleyin ve en az 40 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. 200 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. pH ölçümleri için kültürler oluşturmak için, hücre peletini buz gibi, sıvı ECM'de kaplama için organoid peletin ECM'ye 1:4 v/v oranında yeniden süspanse edin.
  7. Her numune için, 35 mm'lik cam tabanlı bir kabın çapı boyunca ince bir yatay çizgi halinde organoidler/organoid parçaları içeren 40 μL sıvı ECM plakalayın.
    NOT: Jeli yuvarlak bir damlacık yerine bir çizgi halinde plakaya dağıtmak, kültürü incelterek tek tek organoidlere daha kolay erişim sağlar.
  8. Jelin 15-30 dakika polimerize olmasına izin verin; daha sonra, jeli bozmamak için kuyunun kenarı boyunca pipetleyerek plakaya dikkatlice 2 mL organoid genleşme ortamı ekleyin.
  9. Medyayı iki günde bir değiştirin. En az 10 organoidin minimum 400 μm çapa ulaşması için 4-8 gün bekleyin.
  10. Bir pH profili oluşturma deneyine devam etmek için, her kültürün aşağıdaki kriterleri karşılayan en az 10 organoid içerdiğinden emin olun: >200 μm çap, sağlıklı görünüm (parlak alan mikroskobu ile gözlemlenen organoidler içinde çok az veya hiç koyu renkli materyal görünmez) ve diğer organoidler tarafından aşırı kalabalık değil.

2. Mikroelektrotların ambalajından çıkarılması ve kalibrasyonu

NOT: Mikro ölçekli ölçümleri etkinleştirmek için, entegre (ve dolayısıyla daha hantal) bir tasarım kullanmak yerine pH sensörü mikro elektroduna ek olarak ayrı bir referans elektrodu kullanılır. Hem pH mikroelektrodu hem de referans elektrodu ıslak olarak saklanmalıdır. Bir seferde 10 dakikadan fazla havaya maruz kalmasına izin vermeyin. Uygulama için uygun uç boyutunu belirleyin. Burada, eğimli uç çapı 25 μm olan potansiyometrik bir pH mikroelektrodu kullandık.

  1. Mikroelektrot hala koruma tüpündeyken, uçta herhangi bir hasar olup olmadığını görsel olarak inceleyin.
  2. Referans elektrodu, konektör aracılığıyla pH elektrot kablosuna bağlayın. Ardından, mikroelektrodu amplifikatöre ve amplifikatörü bir USB kablosu aracılığıyla yazılımla birlikte topraklanmış bir PC'ye bağlayın (Şekil 1A).
  3. İki adet 50 mL konik tüpü 2/3 %70 etanol ve deiyonize H2O (diH2O) ile doldurun. Mikroelektrodu ve referans elektrodu diH2O tüpüne yerleştirin ve her iki ucun da sıvıya en az 1 cm batırılmış göründüğünden emin olun.
    NOT: Bu ve benzeri adımlar için uzun beherler de kullanılabilir.
  4. Elektrotların ~ 10 dakika dengelenmesine izin verin.
    NOT: Prosedür bu adımda da duraklatılabilir ve elektrotlar diH2O'da saklanabileceğinden daha sonra devam ettirilebilir.
  5. Elektrotlar dengelenirken, bilgisayar iş istasyonundaki yazılımı (kırmızı simge) açın. Ayarlar sekmesi altında, mikroelektrotun yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun, bu da elektrotun doğru şekilde bağlandığını ve yazılım tarafından tanındığını gösterir. Pencerenin sol üst köşesindeki Denemeyi Başlat'a tıklayın ve istediğiniz dosya adını ve hedefini girin. Sensör kalibrasyonu ve deney ayarları penceresinde, yazılımı yeni bir kalibrasyona hazırlamak için Tüm noktaları temizle'ye tıklayın.
  6. İki adet 50 mL konik tüpü 2/3 oranında pH 4.01 ve pH 9.21 kalibrasyon tamponları ile doldurun. Koruyucu hortumu ve referans elektrodu hassas bir laboratuvar mendiliyle nazikçe kurulayın.
  7. pH 4.01 tamponundaki elektrotlardan başlayarak, bilinen pH değeri olarak 4.01'i girin. MV okuması stabilize olduğunda, nokta ekle'yi seçin. Sinyalin ~380 mV'de sabit olduğunu onaylayın. Nokta eklendikten sonra, durulamak için her iki elektrodu da diH2O'ya geri yerleştirin, ardından tekrar kurulayın.
  8. Önceki adımı 9.21 arabelleği ile tekrarlayın ve sinyal sabit olduğunda (~83 mV) nokta ekle'ye tıklayın. Mikroelektrotların pH 4.01 ile 9.21 arasında doğrusal olarak yanıt verdiğini kontrol edin; Bu nedenle, sadece iki noktalı bir kalibrasyon eğrisi gereklidir. Bu noktalar arasında ortaya çıkan çizginin 50-70 mV/pH biriminde negatif bir eğime sahip olduğundan emin olun. Kalibrasyonu kaydet ve kullan'a tıklayın.
    NOT: Artık ölçümleri kaydetmeye başlamaya hazırsınız30.

3. İnsan mide organoidlerinin pH profili

NOT: Sağ elini kullanan bir kullanıcı için aşağıdaki protokol açıklanmıştır. DİKKAT: PC'niz uyku moduna girerse devam eden ölçümler kesintiye uğrayacağından, PC'nizdeki tüm güç tasarrufu seçeneklerini devre dışı bırakın.

  1. Referans elektrodunu tutmak için stereomikroskobun sol tarafına bir kelepçe ile bir halka standı monte edin. Mikroskobun sağ tarafına ağır bir laboratuvar standına bağlı bir mikromanipülatör yerleştirin (Şekil 1A).
  2. Mikroelektrodu bankın üzerine düz bir şekilde koyarak ve kasayı hızlı, hızlı bir hareketle çekerek koruma kılıfından dikkatlice çıkarın.
    DİKKAT: Mikroelektrotlar inanılmaz derecede kırılgandır ve ucun sert, katı malzeme ile temas etmemesine dikkat edilmelidir. En iyi sonuçları elde etmek için, tezgahın titremesine veya elektrotların istenmeyen hareketine neden olabilecek ekipmandan arındırılmış sağlam bir tezgah üzerinde ölçümler yapın.
  3. Mikroelektrodu bir mikromanipülatör üzerine monte edin ve stereoskop ve mikromanipülatörü, mikroelektrot objektife veya mikroskobun diğer kısımlarına çarpmadan kültür kabına doğru ilerleyebilecek şekilde düzenleyin.
  4. Organoidleri içeren kültür kabını, profili oluşturulacak ilk organoidin yeterli görselleştirmesine sahip olacak şekilde konumlandırın (Şekil 1B).
  5. Referans elektrodu, stereoskopun solundaki halka standı üzerindeki cl'ye hafifçe sabitleyin. Referans elektrodu, ECM'yi çevreleyen ortamda duracak şekilde konumlandırın. Sahne ölçümler arasında hareket ettirilirken organoidleri bozmayacağından emin olun.
  6. Doğrudan kültür plakasına bakarak (mikroskoba değil), mikroelektrotun ucunu ortama yeterince daldırılana kadar ilerletin. Yazılımdaki Veri kaydedici sekmesi altında, kayda başlamak için Başlat düğmesine (sağa bakan tek üçgen) tıklayın. Ekranın sağ tarafında Kalibre Edildi onay kutusunun seçili olduğundan emin olun.
    NOT: Bir sonraki bölgeye ilerlemeden önce her okumanın stabilize olması için ~10 saniye bekleyin.
  7. ECM'ye girmeden önce, elektrot ucunun mikroskop altında görünür olduğundan ve ilgilenilen ilk organoide doğru doğrusal olarak ilerleyecek şekilde konumlandırıldığından emin olun. Elektrodu, herhangi bir organoid ile temas etmeden yavaşça jelin içine ilerletin. En az üç pH okuması kaydedin ve ortalamayı hesaplayın.
  8. Mikroelektrodu, yüzeye dik eksen boyunca ilgilenilen ilk organoide doğru ilerlemeye hazır olacak şekilde konumlandırın. Elektrotun epitel yüzeyine nüfuz etmeden küçük bir girinti yapmasına izin verin (Şekil 1C).
    NOT: Bu adım aynı zamanda organoidin yerinde kalıp kalmayacağı veya ECM'de daha serbestçe hareket edip edemeyeceği konusunda da fikir verecektir.
  9. Tek bir hızlı hareketle mikroelektrodu organoidin içine ilerletin. Organoid mikroelektrotun etrafında hareket ederse veya uzaklaşırsa, biraz farklı bir açı deneyin veya başka bir organoide veya tabağın kapak camı tabanını çevreleyen plastik kenara karşı yedekleyin. Her deneysel koşul için 10 farklı organoidin lümen pH'ını (üç ayrı kez) ölçün. Ölçümleri kaydetmeyi bitirdiğinizde, kare dur düğmesine tıklayın.
    DİKKAT: Elektrodu organoid lümene ne kadar ilerleteceğinize karar vermek için organoidin çapını tahmin edin ve onu delmemeye dikkat edin. Daha fazla doğruluk için, varsa mikroskobunuzun kamera yazılımıyla çapı ölçün. NOT: Mikroelektrotun ucu bir veya birden fazla ölçümden sonra gözle görülür şekilde kalıntılarla kaplanırsa, devam etmeden önce mikroelektrodu hücre ayrışma solüsyonu, PBS, EtOH ve ardından diH2O içinde yıkayın.

4. Motorlu profil oluşturma (isteğe bağlı)

NOT: Bu seçenek, nihai olarak bir motor kontrolörü31 aracılığıyla bilgisayar yazılımı tarafından kontrol edilen mekanik bir motor aşamasına monte edilmiş bir mikromanipülatör gerektirir.

  1. Profil oluşturma yazılımını (kahverengi simge) açın ve Profil Oluşturma sekmesi altında yeni bir deneme başlatın.
  2. Z ekseni ayarları, bir motor aparatı düzgün şekilde bağlandığında Motoru otomatik olarak tanıyacaktır.
    NOT: Bu kurulumda x ve y yönlerindeki hareket hala manuel olarak kontrol edilir.
  3. Profil etkileşimi sekmesinibulun 30. Başlatmaya basmadan önce, istenen mesafeden organoid girişini sağlamak için mikroskop merceğine hızlı bir şekilde bakmaya geçmenin mümkün olduğundan emin olun. Profil ayarları'na gidin ve aşağıdakileri yapın:
    1. Başlangıç mesafesinin 0 μm olduğunu belirtin.
      DİKKAT: Epitel kabuğu belirli bir organoid üzerinde özellikle sertse, organoid nüfuz etmek yerine itilebilir veya deforme olabilir. İtme söz konusuysa, elektrodu ilerletmeye devam edin, ancak yazılım bunu otomatik olarak kaydedemediği için girişin gerçekleştiği noktaya dikkat edin.
    2. Profili çıkarılan organoidin boyutuna bakarak, bir organoidin tahmini çapından en fazla 3/4 oranında bir Bitiş mesafesi belirtin.
      NOT: Bu özel adım, elektrot ucunun hasar görmesini önlemek için tasarlanmıştır.
    3. Şekil 2E'de gösterildiği gibi istenen adım boyutunu (100 μm) belirtin. Minimum adım boyutunun elektrot ucunun boyutuyla eşleştiğinden emin olun (örneğin, 25 μm pH-25 elektrot ucu için 25 μm).
    4. Motorun elektrot ucunu profiller arasına geri döndüreceği güvenli bir konumu belirtin.
      NOT: Bu, sensörün manuel mikromanipülatör ile x ve y yönlerinde güvenli bir şekilde yanlara doğru hareket ettirilebileceği numunenin üzerinde (organoidin dışında) rahat bir yükseklik olmalıdır. Sensör açısını varsayılan ayarında bırakın.
    5. Elektrotun dengelenmesini sağlamak için, Ölçüm(ler)den önce bekleyin altında en az 3 saniye belirtin.
    6. Hesaplama dönemlerini en az 1 sn olarak ayarlayın. Bu dönemdeki ölçümlerin ortalaması alınacaktır.
      NOT: Elektriksel gürültünün yüksek olduğu bir ortamda ölçüm yapıyorsanız, daha uzun bir süre belirtmek yardımcı olabilir.
    7. Arasındaki Gecikme(ler)i en az 1 sn olarak ayarlayın.
    8. Her derinlikte ölçülecek tercih edilen Çoğaltma sayısını ayarlayın.
    9. Başlat düğmesine basarak ölçümleri kaydetmeye başlayın.

5. Elektrotların temizlenmesi

  1. Temizlenecek elektrodu tekrar koruma tüpüne yerleştirin.
  2. Ölçümlerden sonra elektrotları diH2O ile yıkayın.
  3. Elektrotları birkaç dakika boyunca %70 etanol ile yıkayın.
  4. Elektrotları pH 4.01 tamponu ile durulayın.
  5. Ölçümlere devam etmeden önce elektrotları diH2O ile bir kez daha durulayın.

6. Elektrotların saklanması

NOT: Her iki elektrot da oda sıcaklığında, kazara hasara karşı güvenli, düşük aktiviteli bir yerde saklanmalıdır.

  1. pH mikroelektrodunu kullandıktan sonra, dikkatlice yatay olarak koruma tüpüne geri kaydırın (yatay destek için laboratuvar tezgahı boyunca kaydırın).
  2. Mikroelektrodu dik tutarak (uç yukarı bakacak şekilde), koruma tüpünü nazikçe steril suyla doldurun. Koruma tüpünü, elektrotla birlikte gelen tıpa ile tıka. Koruma borusundaki tüm deliklerin elektrik bandı ile kapatıldığından emin olun. Bir sonraki kullanıma kadar kırılmaz bir kutuda saklayın.
    NOT: Saklandığında elektrotları yerinde tutmak için tasarlanmış koruyucu ekler içereceğinden, elektrotların geldiği orijinal kutunun kullanılması önerilir.
  3. Referans elektrodu, 3M KCl çözeltisi ile doldurulmuş bir beher veya dereceli silindirde saklayın. Çözeltinin buharlaşmasını önlemek için beher/dereceli silindiri parafilm ile örtün.
    NOT: Dereceli bir silindir kullanılıyorsa, kazara hareket etmesini önlemek için laboratuvar tezgahına bantla sabitlenmesi önerilir.

7. Metil kırmızı enjeksiyon (isteğe bağlı)

NOT: Metil kırmızısı, mikroelektrot ölçümlerini doğrulamak için kullanılabilen kolorimetrik bir indikatör boyadır.

  1. 2 μL'lik bir cam kılcal damarı steril mineral yağ ile doldurun, mikromanipülatör kontrollü bir nL otomatik enjektöre yükleyin ve ardından %0.02 metil kırmızısı ve 150 mM HCl içeren bir çözelti ile doldurun.
    NOT: HCl'nin asitliği nedeniyle çözelti kılcal damar içindeyken kırmızı/pembe görünmelidir.
  2. Çapı en az 300 μm olan organoidleri 9.2 μL çözelti25 ile enjekte edin.
  3. Stereomikroskoba uyarlanmış bir kamera kullanarak görüntü veya video çekin (Şekil 2G).

Sonuçlar

Asit salgılanması insan midesinin çok önemli bir işlevidir. Bununla birlikte, organoidlerde asit salgılanmasının ne ölçüde modellenebileceği hala bir tartışma konusudur6,32,33,34. Bu nedenle, mide organoidlerinde asit üretimini doğru bir şekilde ölçmek için yukarıda ayrıntıları verilen protokolü geliştirdik. Özellikle, birkaç kez geçilen standart genişleme koşulla...

Tartışmalar

Organoidlerin luminal boşluğuna sınırlı erişim, bu mikro çevrenin fizyolojik dinamikleri hakkındaki anlayışımızı ciddi şekilde kısıtlamıştır. Luminal fizyolojinin fonksiyonel analizleri için güvenilir bir araç, fizyoloji, farmakoloji ve hastalık araştırmaları için in vitro modeller olarak organoidlerden yararlanma yeteneğimizi artıracaktır. Organoidler, insan popülasyonu içindeki genetik değişkenliği çoğaltma potansiyeline sahip, son derece ayarlanabilir, fizyolojik olarak il...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart ve Bengisu Kılıç'a önceki çalışmaları ve O2 mikrosensörleri ile ilgili yardımları için teşekkür eder; Organoid kültür ve mikromanipülasyon eğitimi için Andy Sebrell; Organoid kültürü, medya hazırlama, veri kaydı ve organizasyon konularında yardım için Lexi Burcham; ve elektrofizyoloji konusunda genel tavsiyeler için Dr. Susy Kohout. Görüntüleme konusundaki yardımları için Dr. Heidi Smith'e teşekkür eder ve Ulusal Bilim Vakfı MRI Programı (2018562), MJ Murdock Charitable Trust (202016116), ABD Savunma Bakanlığı (77369LSRIP & W911NF1910288) ve Montana Nanoteknoloji Tesisi (NSF Grant ECCS-2025391 tarafından desteklenen bir NNCI üyesi) tarafından sağlanan fonlarla desteklenen Montana Eyalet Üniversitesi'ndeki Biyofilm Mühendisliği Biyogörüntüleme Tesisi'ne teşekkür ederiz.

Bu çalışmayı mümkün kılan tüm Unisense ekibine, özellikle Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard ve Mette Gammelgaard'a özel teşekkürler. Çalışmamızın finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri R01 GM13140801 (DB, RB) ve UL1 TR002319 (KNL) ve Montana Eyalet Üniversitesi Araştırma ve Ekonomik Kalkınma Ofisi'nden (DB) bir Araştırma Genişletme Ödülü tarafından sağlandı. Şekil 1A , BioRender ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3 M KClUnisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229412
24 Well Tissue Culture Plate, SterileCellTreat229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229422
70% EthanolBP82031GALBP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, SterileCellTreat229483 
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, SterileCellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) SolutionHyClone Laboratories, IncSV30078.01
Biosafety CabinetNuaire NU-425-600Class II Type A/B3
Bovine Serum AlbuminFisher BioreagentsBP1605-100
Cell recovery solutionCorning354253Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Fetal Bovine SerumHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfateCorning30-234-CR
Gentamycin sulfateIBI ScientificIB02030
HEPES, Free AcidCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
Hydrochloric acidFisher ScientificA144C-212
IncubatorFisher Scientific11676604
iPhone 12 cameraApple
L-glutamineCytivaSH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyFisher Scientific34133
M 205 FA StereomicroscopeLeica
Matrigel Membrane Matrix 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControllerUnisense
Methyl red
MM33 MicromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Right handed
MS-15 Motorized StageUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH MicroelectrodesUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference ElectrodeUnisenseREF-RM-001652SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Smartphone Camera AdapterGosky
Specifications Laboratory Stand LSUnisenseLS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol redGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience12-541-0
µSensor Calibration KitUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets

Referanslar

  1. Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
  2. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  5. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188 (2019).
  6. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  9. Davies, J. A., Davies, J. A., Lawrence, M. L. . Organoids and Mini-organs. , 3-40 (2018).
  10. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423 (2020).
  11. Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
  12. Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
  13. Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
  14. Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801 (2020).
  15. Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  16. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  17. Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
  18. Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
  19. pH and reference electrode manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023)
  20. Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096 (2016).
  21. Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
  22. Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
  23. Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353 (2014).
  24. Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851 (2017).
  25. Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 157-171 (2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219 (2023).
  28. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).
  29. Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
  30. Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023)
  31. Microprofiling system user manual. Unisense Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023)
  32. Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), 623-636 (2021).
  33. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  34. Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  35. Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  36. . Unisense Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024)
  37. Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  38. Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
  39. Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
  40. Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
  41. Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
  42. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420 (2020).
  43. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106 (2020).
  44. Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 209Luminal PHMikromanip lat rPH GradyanFonksiyonel Karakterizasyon3D Organoidler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır