Profilage du pH luminal dans des organoïdes gastro-intestinaux tridimensionnels à l’aide de microélectrodes

Résumé

Le présent protocole décrit les mesures du pH dans les organoïdes gastriques dérivés de tissus humains à l’aide de microélectrodes pour la caractérisation spatio-temporelle de la physiologie intraluminale.

Résumé

L’optimisation et la caractérisation détaillée des modèles d’organoïdes gastro-intestinaux nécessitent des méthodes avancées d’analyse de leurs environnements luminaux. Cet article présente une méthode hautement reproductible pour la mesure précise du pH dans la lumière d’organoïdes gastriques humains 3D via des microélectrodes contrôlées par micromanipulateur. Les microélectrodes de pH sont disponibles dans le commerce et se composent d’embouts en verre biseautés de 25 m de diamètre. Pour les mesures, la microélectrode de pH est avancée dans la lumière d’un organoïde (>200 μm) qui est suspendu dans Matrigel, tandis qu’une électrode de référence repose immergée dans le milieu environnant dans la plaque de culture.

En utilisant de telles microélectrodes pour profiler les organoïdes dérivés du corps gastrique humain, nous démontrons que le pH luminal est relativement constant dans chaque puits de culture à ~7,7 ± 0,037 et que des mesures continues peuvent être obtenues pendant un minimum de 15 min. Dans certains organoïdes plus grands, les mesures ont révélé un gradient de pH entre la surface épithéliale et la lumière, ce qui suggère que les mesures de pH dans les organoïdes peuvent être réalisées avec une haute résolution spatiale. Dans une étude précédente, des microélectrodes ont été utilisées avec succès pour mesurer les concentrations d’oxygène luminal dans les organoïdes, démontrant la polyvalence de cette méthode pour l’analyse des organoïdes. En résumé, ce protocole décrit un outil important pour la caractérisation fonctionnelle de l’espace luminal complexe au sein des organoïdes 3D.

Introduction

Les organoïdes, c’est-à-dire des structures multicellulaires miniatures dérivées de cellules souches, ont révolutionné notre capacité à étudier la physiologie humaine et commencent à remplacer les modèles animaux, même dans les contextes réglementaires¹. Depuis la description initiale des organoïdes intestinaux par Sato et al. en 2009, la technologie des organoïdes est devenue immensément populaire². Un grand nombre d’études ont caractérisé en détail la composition cellulaire et la fonction de modèles d’organoïdes 3,4,5,6.^<....

Protocole

Ce protocole nécessite des organoïdes 3D d’au moins 200 μm de diamètre qui ont une lumière distincte et qui sont intégrés dans une matrice extracellulaire artificielle (ECM, par exemple, Matrigel). Des tissus gastriques humains pour la dérivation d’organoïdes ont été obtenus avec l’approbation du Conseil d’examen institutionnel de l’Université d’État du Montana et le consentement éclairé de patients subissant une endoscopie supérieure à Bozeman Health (protocole # 2023-48-FCR, à D.B.) ou en tant qu’échantillons exemptés d’estomac entier ou de gastrectomie en manchon du National Disease Research Interchange (protocole #DB062615-EX). Le tableau 1 fourni....

Discussion

L’accès limité à l’espace luminal des organoïdes a sévèrement limité notre compréhension de la dynamique physiologique de ce microenvironnement. Un outil fiable pour les analyses fonctionnelles de la physiologie luminale élargira notre capacité à exploiter les organoïdes comme modèles in vitro pour la physiologie, la pharmacologie et la recherche sur les maladies. Les organoïdes sont des modèles physiologiquement pertinents qui offrent un potentiel supplémentaire de reproduction de la variabi.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile	CellTreat	229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229422
70% Ethanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile	CellTreat	229483
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605-100
Cell recovery solution	Corning	354253	Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Bovine Serum	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfate	Corning	30-234-CR
Gentamycin sulfate	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144C-212
Incubator	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 camera	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscope	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Right handed
MS-15 Motorized Stage	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microelectrodes	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Smartphone Camera Adapter	Gosky
Specifications Laboratory Stand LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µSensor Calibration Kit	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets