Profilage du pH luminal dans des organoïdes gastro-intestinaux tridimensionnels à l’aide de microélectrodes

Résumé

Le présent protocole décrit les mesures du pH dans les organoïdes gastriques dérivés de tissus humains à l’aide de microélectrodes pour la caractérisation spatio-temporelle de la physiologie intraluminale.

Résumé

L’optimisation et la caractérisation détaillée des modèles d’organoïdes gastro-intestinaux nécessitent des méthodes avancées d’analyse de leurs environnements luminaux. Cet article présente une méthode hautement reproductible pour la mesure précise du pH dans la lumière d’organoïdes gastriques humains 3D via des microélectrodes contrôlées par micromanipulateur. Les microélectrodes de pH sont disponibles dans le commerce et se composent d’embouts en verre biseautés de 25 m de diamètre. Pour les mesures, la microélectrode de pH est avancée dans la lumière d’un organoïde (>200 μm) qui est suspendu dans Matrigel, tandis qu’une électrode de référence repose immergée dans le milieu environnant dans la plaque de culture.

En utilisant de telles microélectrodes pour profiler les organoïdes dérivés du corps gastrique humain, nous démontrons que le pH luminal est relativement constant dans chaque puits de culture à ~7,7 ± 0,037 et que des mesures continues peuvent être obtenues pendant un minimum de 15 min. Dans certains organoïdes plus grands, les mesures ont révélé un gradient de pH entre la surface épithéliale et la lumière, ce qui suggère que les mesures de pH dans les organoïdes peuvent être réalisées avec une haute résolution spatiale. Dans une étude précédente, des microélectrodes ont été utilisées avec succès pour mesurer les concentrations d’oxygène luminal dans les organoïdes, démontrant la polyvalence de cette méthode pour l’analyse des organoïdes. En résumé, ce protocole décrit un outil important pour la caractérisation fonctionnelle de l’espace luminal complexe au sein des organoïdes 3D.

Introduction

Les organoïdes, c’est-à-dire des structures multicellulaires miniatures dérivées de cellules souches, ont révolutionné notre capacité à étudier la physiologie humaine et commencent à remplacer les modèles animaux, même dans les contextes réglementaires¹. Depuis la description initiale des organoïdes intestinaux par Sato et al. en 2009, la technologie des organoïdes est devenue immensément populaire². Un grand nombre d’études ont caractérisé en détail la composition cellulaire et la fonction de modèles d’organoïdes 3,4,5,6. Cependant, l’espace luminal de ces structures multicellulaires 3D reste largement indéfini ^7,8. La lumière est la cavité centrale des organoïdes dérivés des tissus muqueux qui est entourée par les parties apicales des cellules épithéliales polarisées. Étant donné que la sécrétion et l’absorption cellulaires se produisent principalement à la surface de l’épithélium apical, le microenvironnement luminal des organoïdes est contrôlé par ces processus physiologiques importants. Les modèles organoïdes actuellement utilisés montrent des variations dans les modèles de signalisation cellulaire, la souche globale, les gradients de concentration de métabolites et les conditions environnementales⁹. La compréhension de la physiologie luminale des organoïdes est donc nécessaire pour la modélisation précise de la fonction et de la pathologie des organes. Malheureusement, la relative inaccessibilité de la lumière entrave considérablement les analyses fonctionnelles de la physiologie luminale dans les organoïdes 3D¹⁰.

La capacité d’examiner les profils de pH est particulièrement importante dans l’estomac, qui est connu pour avoir le gradient de protons le plus raide dans le corps, allant d’environ 1-3 dans la lumière, à presque neutre à l’épithélium 11,12,13. Il reste une lacune importante dans notre compréhension du maintien à l’échelle microscopique du gradient de pH gastrique et de la pertinence des modèles organoïdes pour récapituler ce milieu dynamique à travers la couche de mucus gastrique. Les approches traditionnelles pour l’analyse du pH des organoïdes impliquent l’utilisation de colorants sensibles au pH, qui peuvent être des indicateurs fluorescents ou colorimétriques. McCracken et al. ont utilisé une injection luminale de SNARF-5F-un indicateur de pH ratiométrique dans des organoïdes pour analyser une baisse du pH luminal en réponse à un traitement à l’histamine. De tels colorants peuvent être incorporés dans le milieu de culture, ce qui permet une surveillance non invasive du pH en temps réel. Non seulement les colorants sensibles au pH nécessitent des étapes d’étalonnage complexes qui contribuent à une fiabilité et une précision médiocres des mesures, mais ces colorants ont également tendance à fonctionner dans des plages de détection spécifiques qui peuvent ne pas être représentatives de l’ensemble de la gamme de pH dans le microenvironnement d’intérêt^14,15. Il pourrait toutefois être considéré comme raisonnable d’utiliser des colorants indicateurs pour des expériences de confirmation. Des nanocapteurs optiques utilisant des approches de détection du pH basées sur l’optode fluorescent ont également été développés ; Cependant, ces techniques de détection nécessitent une imagerie microscopique et sont également sensibles au photoblanchiment, à la phototoxicité, ainsi qu’au biais d’imagerie^16,17. De plus, Brooks et al. ont des plaques multipuits imprimées en 3D contenant des microélectrodes sur lesquelles les organoïdes peuvent être plaqués¹⁸. Cependant, cette approche ne permet pas d’effectuer des mesures directement à l’intérieur de la lumière organoïde.

Les mesures du pH à l’aide d’électrodes peuvent atteindre une meilleure précision par rapport à d’autres méthodes, ainsi que fournir une surveillance du pH en temps réel. De plus, les électrodes de pH montées sur des micromanipulateurs permettent une résolution spatiale supérieure des mesures de pH, car l’emplacement précis de la pointe de l’électrode peut être contrôlé avec précision. Cela permet une flexibilité et une reproductibilité maximales dans les analyses de modèles d’organoïdes. Les électrodes utilisées ici sont des microélectrodes de pH miniaturisées qui fonctionnent sur la base de la diffusion de protons à travers du verre de pH sélectif qui entoure un mince fil de platine. La microélectrode est connectée à une électrode de référence Ag-AgCl externe, puis connectée à un millivoltmètre à haute impédance. Le potentiel électrique entre les deux pointes d’électrode lorsqu’elles sont immergées dans la même solution reflétera le pH de la solution¹⁹. De tels systèmes de microprofilage ont été utilisés dans l’analyse métabolique de biofilms^20,21, d’algues planctoniques²², d’échantillons d’expectorations humaines²³ et même de sphéroïdes de cellules souches mésenchymateuses²⁴. Notre laboratoire et Murphy et al. ont déjà utilisé des microélectrodes O₂ contrôlées par des micromanipulateurs pour évaluer les concentrations d’oxygène dans les espaces luminaux des organoïdes. Murphy et al. ont associé cette méthode à une modélisation mathématique pour révéler un gradient d’oxygène dans leurs sphéroïdes. Notre groupe a pu trouver des niveaux d’oxygène luminal réduits dans les organoïdes gastriques dérivés des tissus par rapport à la matrice extracellulaire^{environnante 25}.

Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour le profilage manuel des microélectrodes du pH luminal dans les organoïdes sphériques du tractus gastro-intestinal qui permettra une meilleure compréhension physiologique de leur microenvironnement luminal complexe. Nous prévoyons que cette technique ajoutera une nouvelle dimension à l’exploration de la physiologie des organoïdes grâce à des mesures en temps réel et à haute résolution des niveaux de pH à l’échelle microscopique. De plus, le protocole suivant pourrait être facilement adapté pour l’analyse de O₂, N₂O, H₂, NO, H₂S, redox et de la température dans divers types de modèles d’organoïdes. Le profilage physiologique est un outil précieux pour optimiser les conditions de culture d’organoïdes afin de mieux imiter les environnements in vivo , renforçant ainsi la pertinence et l’utilité des modèles d’organoïdes dans la recherche biomédicale.

Protocole

Ce protocole nécessite des organoïdes 3D d’au moins 200 μm de diamètre qui ont une lumière distincte et qui sont intégrés dans une matrice extracellulaire artificielle (ECM, par exemple, Matrigel). Des tissus gastriques humains pour la dérivation d’organoïdes ont été obtenus avec l’approbation du Conseil d’examen institutionnel de l’Université d’État du Montana et le consentement éclairé de patients subissant une endoscopie supérieure à Bozeman Health (protocole # 2023-48-FCR, à D.B.) ou en tant qu’échantillons exemptés d’estomac entier ou de gastrectomie en manchon du National Disease Research Interchange (protocole #DB062615-EX). Le tableau 1 fournit des renseignements sur les raies organoïdes et les numéros de passage utilisés pour cette étude, et la composition des milieux est indiquée au tableau 2. Se référer aux protocoles précédemment publiés pour la génération et la maintenance des lignées d’organoïdes gastro-intestinaux^{6, 26, 27}.

1. Préparation d’organoïdes gastriques humains pour le profilage du pH

1. Initier et maintenir des cultures d’organoïdes gastriques en utilisant des protocoles standard. Maintenir les organoïdes sur des plaques de 24 puits dans 500 μL de milieu d’expansion par puits (tableau 2). Passage établissait des lignes organoïdes tous les 5 à 7 jours, puis les transférait dans une boîte à fond de verre de 35 mm en préparation des expériences de profilage du pH.
   REMARQUE : Les cultures d’organoïdes pour nos expériences sont dérivées de préparations de glandes gastriques, qui sont obtenues à partir de tissus adultes comme décrit ci-dessus. Nous utilisons une méthode de digestion tissulaire de la collagénase pour isoler ces glandes avant qu’elles ne soient en suspension dans la MEC, comme décrit précédemment 25,28,29.
2. À partir de cultures d’organoïdes en croissance active dans les passages 1 à 15, choisissez des puits contenant au moins 100 organoïdes (environ 2 millions de cellules) d’un diamètre compris entre 200 et 700 μm pour le transfert et l’expansion sur des boîtes de Pétri de 3,5 mm.
3. Pendant la préparation des organoïdes pour le placage (étapes 1.4 à 1.8), laisser décongeler les aliquotes de la matrice extracellulaire (MEC) sur de la glace pendant au moins 45 min. Maintenez l’ECM sur la glace tout au long de ce protocole pour éviter la gélification. Préchauffez les plaques de culture cellulaire en les plaçant dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ .
4. Retirez le milieu des puits et récoltez les cultures d’organoïdes gastriques en pipetant du PBS glacé sur chaque gouttelette ECM et en grattant le gel avec la pointe d’une pipette P1000. Pipeter le PBS avec les fragments de MEC contenant des organoïdes dans un tube conique de 15 mL.
5. Centrifugez le tube à 200 × g à 4 °C pendant 5 min. Les fragments ECM contenant les organoïdes seront visibles sous forme de couche au fond du tube. Aspirez soigneusement le surnageant et pipetez 350 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans chaque tube, en mélangeant doucement en pipetant de haut en bas. Incuber les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 à 5 min.
6. Après l’incubation avec de la trypsine-EDTA, ajouter 600 μL de DMEM glacé avec pénicilline/streptomycine dans chaque tube et pipeter vigoureusement de haut en bas au moins 40 fois. Centrifugeuse à 200 × g à 4 °C pendant 5 min. Aspirez le surnageant. Pour mettre en place des cultures pour les mesures de pH, remettez en suspension la pastille cellulaire dans une ECM liquide glacée à un rapport v/v de 1:4 entre la pastille organoïde et l’ECM pour le placage.
7. Pour chaque échantillon, disposez une plaque de 40 μL d’ECM liquide contenant des organoïdes/fragments d’organoïdes en une fine ligne horizontale le long du diamètre d’une boîte à fond de verre de 35 mm.
   REMARQUE : La distribution du gel sur la plaque en ligne au lieu d’une gouttelette ronde permet un accès plus facile aux organoïdes individuels en éclaircissant la culture.
8. Laisser le gel polymériser pendant 15 à 30 min ; ensuite, ajoutez soigneusement 2 mL de milieu d’expansion organoïde à la plaque en pipetant le long du bord du puits pour éviter de perturber le gel.
9. Remplacez le support tous les deux jours. Attendez 4 à 8 jours pour qu’un minimum de 10 organoïdes atteignent un diamètre minimum de 400 μm.
10. Pour procéder à une expérience de profilage du pH, assurez-vous que chaque culture contient au moins 10 organoïdes qui répondent aux critères suivants : > 200 μm de diamètre, apparence saine (peu ou pas de matière sombre visible dans les organoïdes observés au microscope à fond clair) et non surpeuplée par d’autres organoïdes.

2. Déballage et étalonnage des microélectrodes

REMARQUE : Pour permettre des mesures à l’échelle microscopique, une électrode de référence distincte est utilisée en plus de la microélectrode du capteur de pH plutôt que d’utiliser une conception intégrée (et donc plus volumineuse). La microélectrode de pH et l’électrode de référence doivent être stockées humides. Ne laissez pas l’exposition à l’air pendant plus de 10 minutes à la fois. Déterminez la taille de pointe appropriée pour l’application. Ici, nous avons utilisé une microélectrode de pH potentiométrique avec un diamètre de pointe biseauté de 25 μm.

1. Avec la microélectrode toujours dans son tube de protection, inspectez visuellement l’embout pour tout dommage.
2. Connectez l’électrode de référence au câble de l’électrode de pH via le connecteur. Ensuite, connectez la microélectrode à l’amplificateur et l’amplificateur à un PC mis à la terre avec le logiciel à l’aide d’un câble USB (Figure 1A).
3. Remplissez deux tubes coniques 2/3 de 50 mL avec de l’éthanol à 70 % et du H₂O désionisé (diH₂O). Placez la microélectrode et l’électrode de référence dans le tube diH₂O, en veillant à ce que les deux pointes apparaissent immergées d’au moins 1 cm dans le liquide.
   REMARQUE : De grands béchers peuvent également être utilisés pour cette étape et des étapes similaires.
4. Laissez les électrodes s’équilibrer pendant ~10 min.
   REMARQUE : La procédure peut également être interrompue à cette étape et reprise plus tard car les électrodes peuvent être stockées dans diH₂O.
5. Pendant que les électrodes s’équilibrent, ouvrez le logiciel (icône rouge) sur le poste de travail. Sous l’onglet Paramètres, assurez-vous que la case à côté de la microélectrode est cochée, indiquant qu’elle est correctement connectée et reconnue par le logiciel. Cliquez sur Démarrer l’expérience en haut à gauche de la fenêtre et entrez le nom de fichier et la destination de votre choix. Dans la fenêtre Paramètres d’étalonnage et d’expérience du capteur , cliquez sur Effacer tous les points pour préparer le logiciel à un nouvel étalonnage.
6. Remplissez deux tubes coniques de 50 mL 2/3 avec des tampons d’étalonnage de pH 4,01 et pH 9,21. Séchez doucement la tubulure de protection et l’électrode de référence avec une lingette de laboratoire délicate.
7. En commençant par les électrodes dans le tampon de pH 4,01, entrez 4,01 comme valeur de pH connue. Une fois que la lecture mV s’est stabilisée, sélectionnez Ajouter un point. Vérifiez que le signal est stable à ~380 mV. Une fois le point ajouté, remettez les deux électrodes dans diH₂O pour rincer, puis séchez à nouveau.
8. Répétez l’étape précédente avec la mémoire tampon 9.21 et cliquez sur ajouter un point lorsque le signal est stable (~83 mV). Vérifiez que les microélectrodes répondent linéairement entre pH 4,01 et 9,21 ; Par conséquent, seule une courbe d’étalonnage en deux points est nécessaire. Assurez-vous que la ligne résultante entre ces points a une pente négative de 50-70 mV/unité de pH. Cliquez sur Enregistrer et utiliser l’étalonnage.
   REMARQUE : Vous êtes maintenant prêt à commencer à enregistrer les mesures³⁰.

3. Profilage du pH des organoïdes gastriques humains

REMARQUE : Le protocole suivant est décrit pour un utilisateur droitier. ATTENTION : Désactivez toutes les options d’économie d’énergie sur votre PC, car les mesures en cours seront interrompues si le PC passe en mode veille.

1. Assemblez un support annulaire avec une pince sur le côté gauche d’un stéréomicroscope pour maintenir l’électrode de référence. Placez un micromanipulateur fixé à un lourd support de laboratoire sur le côté droit du microscope (Figure 1A).
2. Retirez délicatement la microélectrode de son boîtier de protection en la posant à plat sur le banc et en retirant le boîtier d’un mouvement rapide et rapide.
   ATTENTION : Les microélectrodes sont incroyablement fragiles et il faut veiller à ce que l’embout n’entre pas en contact avec un matériau rigide et solide. Pour de meilleurs résultats, effectuez les mesures sur une paillasse solide, exempte d’équipement qui pourrait provoquer des vibrations de la paillasse ou un mouvement indésirable des électrodes.
3. Montez la microélectrode sur un micromanipulateur et disposez le stéréoscope et le micromanipulateur de manière à ce que la microélectrode puisse avancer vers la boîte de culture sans heurter l’objectif ou d’autres parties du microscope.
4. Positionnez la boîte de culture contenant les organoïdes de manière à ce que l’on puisse visualiser adéquatement le premier organoïde à profiler (figure 1B).
5. Fixez légèrement l’électrode de référence à la pince du support annulaire à gauche du stéréoscope. Positionnez l’électrode de référence de manière à ce qu’elle repose dans le milieu entourant l’ECM. Veillez à ce qu’il ne perturbe pas les organoïdes lorsque la platine est déplacée entre les mesures.
6. En regardant directement la plaque de culture (et non dans le microscope), avancez l’extrémité de la microélectrode jusqu’à ce qu’elle soit suffisamment immergée dans le milieu. Sous l’onglet Enregistreur de données du logiciel, cliquez sur le bouton Démarrer (triangle unique pointant vers la droite) pour commencer l’enregistrement. Assurez-vous que la case Calibré est cochée sur le côté droit de l’écran.
   REMARQUE : Attendez ~10 s pour que chaque lecture se stabilise avant de passer à la région suivante.
7. Avant d’entrer dans l’ECM, assurez-vous que la pointe de l’électrode est visible au microscope et qu’elle est positionnée de manière à avancer linéairement vers le premier organoïde d’intérêt. Avancez lentement l’électrode dans le gel, sans entrer en contact avec des organoïdes. Enregistrez au moins trois lectures de pH et calculez la moyenne.
8. Positionnez la microélectrode de manière à ce qu’elle soit prête à avancer vers le premier organoïde d’intérêt le long de l’axe perpendiculaire à la surface. Laissez l’électrode faire une petite indentation sur la surface épithéliale sans pénétrer (Figure 1C).
   REMARQUE : Cette étape vous permettra également de savoir si l’organoïde restera en place ou s’il pourra se déplacer plus librement dans l’ECM.
9. D’un mouvement rapide, faites avancer la microélectrode dans l’organoïde. Si l’organoïde se déplace autour de la microélectrode ou s’éloigne, essayez un angle légèrement différent ou appuyez-le contre un autre organoïde ou le bord en plastique entourant le fond en verre de couverture de la parabole. Mesurez le pH luminal (trois fois individuellement) de 10 organoïdes différents pour chaque condition expérimentale. Lorsque vous avez terminé d’enregistrer les mesures, cliquez sur le bouton carré Arrêter.
   ATTENTION : Estimez le diamètre de l’organoïde pour décider jusqu’où avancer l’électrode dans la lumière de l’organoïde, en prenant soin de ne pas la percer. Pour une précision accrue, mesurez le diamètre avec le logiciel de l’appareil photo de votre microscope, si disponible. REMARQUE : Si l’extrémité de la microélectrode est visiblement recouverte de débris après une ou plusieurs mesures, lavez la microélectrode dans une solution de dissociation cellulaire, PBS, EtOH, puis diH₂O avant de continuer.

4. Profilage motorisé (en option)

REMARQUE : Cette option nécessite un micromanipulateur monté sur un étage de moteur mécanique, qui est finalement contrôlé par un logiciel informatique via un contrôleur de moteur³¹.

1. Ouvrez le logiciel de profilage (icône marron) et démarrez une nouvelle expérience sous l’onglet Profilage .
2. Les paramètres de l’axe z reconnaîtront automatiquement le moteur lorsqu’un appareil moteur est correctement connecté.
   REMARQUE : Le mouvement dans les directions x et y est toujours contrôlé manuellement avec cette configuration.
3. Recherchez l’onglet d’interaction Profil³⁰. Avant d’appuyer sur le bouton de démarrage, assurez-vous qu’il est possible de passer rapidement à l’observation de l’oculaire du microscope pour assurer l’entrée de l’organoïde à la distance souhaitée. Accédez aux paramètres du profil et procédez comme suit :
   1. Indiquez que la distance de départ est de 0 μm.
      ATTENTION : Si la coquille épithéliale est particulièrement dure sur un organoïde donné, l’organoïde peut être repoussé ou déformé au lieu d’être pénétré. Si c’est le cas, continuez à avancer l’électrode, mais notez le point d’entrée, car le logiciel ne peut pas l’enregistrer automatiquement.
   2. Pour juger de la taille de l’organoïde profilé, indiquez une distance finale qui ne dépasse pas les 3/4 du diamètre estimé d’un organoïde.
      REMARQUE : Cette étape particulière est conçue pour éviter d’endommager la pointe de l’électrode.
   3. Indiquez la taille de pas souhaitée (100 μm), comme illustré à la figure 2E. Assurez-vous que la taille minimale du pas correspond à la taille de l’embout de l’électrode (p. ex., 25 μm pour un embout d’électrode de 25 μm pH-25).
   4. Indiquez une position sûre à laquelle le moteur ramènera la pointe de l’électrode entre les profilés.
      REMARQUE : Il doit s’agir d’une hauteur confortable au-dessus de l’échantillon (à l’extérieur de l’organoïde) où le capteur peut être déplacé en toute sécurité latéralement dans les directions x et y avec le micromanipulateur manuel. Laissez l’angle du capteur à son réglage par défaut.
   5. Pour permettre à l’électrode de s’équilibrer, indiquez au moins 3 s sous Attendre avant la ou les mesures.
   6. Définissez la ou les périodes de mesure sur au moins 1 s. La moyenne des mesures sur cette période sera calculée.
      REMARQUE : Si vous effectuez des mesures dans un environnement à fort bruit électrique, il peut être utile d’indiquer une période plus longue.
   7. Réglez le délai entre les deux à au moins 1 s.
   8. Définissez le nombre préféré de répétitions à mesurer à chaque profondeur.
   9. Commencez à enregistrer les mesures en appuyant sur le bouton Démarrer .

5. Nettoyage des électrodes

1. Replacez l’électrode à nettoyer dans son tube de protection.
2. Rincer les électrodes avec du diH₂O après les mesures.
3. Rincez les électrodes avec de l’éthanol à 70 % pendant quelques minutes.
4. Rincez les électrodes avec un tampon de pH 4,01.
5. Rincez à nouveau les électrodes avec du diH₂O avant de procéder aux mesures.

6. Stockage des électrodes

REMARQUE : Les deux électrodes doivent être stockées à température ambiante dans un endroit à faible activité, à l’abri des dommages accidentels.

1. Après avoir utilisé la microélectrode de pH, glissez-la délicatement horizontalement dans son tube de protection (en glissant le long de la paillasse pour un support horizontal).
2. En tenant la microélectrode à la verticale (pointe pointée vers le haut), remplissez doucement le tube de protection avec de l’eau stérile. Branchez le tube de protection avec le bouchon fourni avec l’électrode. Assurez-vous que tous les trous dans le tube de protection sont scellés avec du ruban isolant. Conserver dans une boîte incassable jusqu’à la prochaine utilisation.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser la boîte d’origine dans laquelle les électrodes sont arrivées car elle contiendra des inserts de protection conçus pour maintenir les électrodes en place lorsqu’elles sont stockées.
3. Stockez l’électrode de référence dans un bécher ou un cylindre gradué rempli d’une solution de KCl 3M. Couvrir le bécher/cylindre gradué avec un parafilm pour éviter l’évaporation de la solution.
   REMARQUE : Si vous utilisez un cylindre gradué, il est recommandé de le fixer à la paillasse de laboratoire avec du ruban adhésif pour éviter tout mouvement accidentel.

7. Injection de rouge de méthyle (facultatif)

REMARQUE : Le rouge de méthyle est un colorant indicateur colorimétrique qui peut être utilisé pour valider les mesures des microélectrodes.

1. Remplissez un capillaire en verre de 2 μL avec de l’huile minérale stérile, chargez-le sur un auto-injecteur nL commandé par micromanipulateur, puis remplissez-le d’une solution contenant 0,02 % de rouge de méthyle et 150 mM de HCl.
   REMARQUE : La solution doit apparaître rouge/rose dans le capillaire en raison de l’acidité du HCl.
2. Injecter des organoïdes d’au moins 300 μm de diamètre avec 9,2 μL de la solution²⁵.
3. Capturez des images ou des vidéos à l’aide d’une caméra adaptée au stéréomicroscope (Figure 2G).

Résultats

La sécrétion d’acide est une fonction cruciale de l’estomac humain. Cependant, la question de savoir dans quelle mesure la sécrétion d’acide peut être modélisée dans les organoïdes est encore un sujet de débat 6,32,33,34. Nous avons donc développé le protocole détaillé ci-dessus pour mesurer avec précision la production d’acide dans les organoïdes gastriques. Notamment, n...

Discussion

L’accès limité à l’espace luminal des organoïdes a sévèrement limité notre compréhension de la dynamique physiologique de ce microenvironnement. Un outil fiable pour les analyses fonctionnelles de la physiologie luminale élargira notre capacité à exploiter les organoïdes comme modèles in vitro pour la physiologie, la pharmacologie et la recherche sur les maladies. Les organoïdes sont des modèles physiologiquement pertinents qui offrent un potentiel supplémentaire de reproduction de la variabi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile	CellTreat	229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229422
70% Ethanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile	CellTreat	229483
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605-100
Cell recovery solution	Corning	354253	Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Bovine Serum	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfate	Corning	30-234-CR
Gentamycin sulfate	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144C-212
Incubator	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 camera	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscope	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Right handed
MS-15 Motorized Stage	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microelectrodes	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Smartphone Camera Adapter	Gosky
Specifications Laboratory Stand LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µSensor Calibration Kit	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets