Perfilado del pH luminal en organoides gastrointestinales tridimensionales mediante microelectrodos

Resumen

El presente protocolo describe las mediciones de pH en organoides gástricos derivados de tejidos humanos utilizando microelectrodos para la caracterización espacio-temporal de la fisiología intraluminal.

Resumen

La optimización y caracterización detallada de modelos de organoides gastrointestinales requiere métodos avanzados para analizar sus entornos luminales. Este artículo presenta un método altamente reproducible para la medición precisa del pH dentro de la lumina de organoides gástricos humanos en 3D a través de microelectrodos controlados por micromanipuladores. Los microelectrodos de pH están disponibles en el mercado y consisten en puntas de vidrio biseladas de 25 μm de diámetro. Para las mediciones, el microelectrodo de pH se introduce en el lumen de un organoide (>200 μm) que está suspendido en Matrigel, mientras que un electrodo de referencia descansa sumergido en el medio circundante en la placa de cultivo.

Utilizando estos microelectrodos para perfilar organoides derivados del cuerpo gástrico humano, demostramos que el pH luminal es relativamente consistente dentro de cada cultivo bien a ~7,7 ± 0,037 y que se pueden obtener mediciones continuas durante un mínimo de 15 min. En algunos organoides más grandes, las mediciones revelaron un gradiente de pH entre la superficie epitelial y el lumen, lo que sugiere que las mediciones de pH en organoides se pueden lograr con alta resolución espacial. En un estudio anterior, los microelectrodos se utilizaron con éxito para medir las concentraciones de oxígeno luminal en organoides, lo que demuestra la versatilidad de este método para el análisis de organoides. En resumen, este protocolo describe una herramienta importante para la caracterización funcional del espacio luminal complejo dentro de organoides 3D.

Introducción

Los organoides, estructuras multicelulares en miniatura derivadas de células madre, han revolucionado nuestra capacidad para estudiar la fisiología humana y están comenzando a reemplazar a los modelos animales, incluso^{en entornos} regulatorios. Desde la descripción inicial de los organoides intestinales por Sato et al. en 2009, la tecnología de organoides se ha vuelto inmensamente popular². Un gran número de estudios han caracterizado con gran detalle la composición celular y la función de los modelos de organoides 3,4,5,6.^<....

Protocolo

Este protocolo requiere organoides 3D de al menos 200 μm de diámetro que tengan un lumen distinto y que estén incrustados en una matriz extracelular artificial (ECM, por ejemplo, Matrigel). Los tejidos gástricos humanos para la derivación de organoides se obtuvieron con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Montana y el consentimiento informado de los pacientes que se sometieron a una endoscopia superior en Bozeman Health (protocolo # 2023-48-FCR, a D.B.) o como muestras exentas de gastrectomía de estómago entero o manga del Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (protocolo #DB062615-EX). La información sobre l....

Discusión

El acceso limitado al espacio luminal de los organoides ha restringido severamente nuestra comprensión de la dinámica fisiológica de este microambiente. Una herramienta fiable para los análisis funcionales de la fisiología luminal ampliará nuestra capacidad de aprovechar los organoides como modelos in vitro para la fisiología, la farmacología y la investigación de enfermedades. Los organoides son modelos altamente ajustables, fisiológicamente relevantes, con el potencial añadido de replicar la variabi.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile	CellTreat	229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229422
70% Ethanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile	CellTreat	229483
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605-100
Cell recovery solution	Corning	354253	Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Bovine Serum	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfate	Corning	30-234-CR
Gentamycin sulfate	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144C-212
Incubator	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 camera	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscope	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Right handed
MS-15 Motorized Stage	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microelectrodes	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Smartphone Camera Adapter	Gosky
Specifications Laboratory Stand LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µSensor Calibration Kit	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets