Profilierung des luminalen pH-Werts in dreidimensionalen gastrointestinalen Organoiden mit Hilfe von Mikroelektroden

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt pH-Messungen in aus menschlichem Gewebe gewonnenen Magenorganoiden unter Verwendung von Mikroelektroden zur raumzeitlichen Charakterisierung der intraluminalen Physiologie.

Zusammenfassung

Die Optimierung und detaillierte Charakterisierung von gastrointestinalen Organoidmodellen erfordert fortschrittliche Methoden zur Analyse ihrer luminalen Umgebungen. In dieser Arbeit wird eine hochgradig reproduzierbare Methode zur präzisen Messung des pH-Werts in der Lumina von menschlichen 3D-Magenorganoiden mittels mikromanipulatorgesteuerter Mikroelektroden vorgestellt. Die pH-Mikroelektroden sind im Handel erhältlich und bestehen aus abgeschrägten Glasspitzen mit einem Durchmesser von 25 μm. Für Messungen wird die pH-Mikroelektrode in das Lumen eines Organoids (>200 μm) vorgeschoben, das in Matrigel suspendiert ist, während eine Referenzelektrode in der Kulturplatte im umgebenden Medium eingetaucht ist.

Durch die Verwendung solcher Mikroelektroden zur Profilierung von Organoiden, die aus dem menschlichen Magenkörper stammen, zeigen wir, dass der luminale pH-Wert in jeder Kulturvertiefung bei ~7,7 ± 0,037 relativ konstant ist und dass kontinuierliche Messungen von mindestens 15 Minuten durchgeführt werden können. Bei einigen größeren Organoiden zeigten die Messungen einen pH-Gradienten zwischen der Epitheloberfläche und dem Lumen, was darauf hindeutet, dass pH-Messungen in Organoiden mit hoher räumlicher Auflösung durchgeführt werden können. In einer früheren Studie wurden Mikroelektroden erfolgreich zur Messung der luminalen Sauerstoffkonzentration in Organoiden eingesetzt, was die Vielseitigkeit dieser Methode für Organoidanalysen demonstriert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein wichtiges Werkzeug für die funktionelle Charakterisierung des komplexen luminalen Raums innerhalb von 3D-Organoiden darstellt.

Einleitung

Organoide - multizelluläre Miniaturstrukturen, die aus Stammzellen gewonnen werden - haben unsere Fähigkeit, die menschliche Physiologie zu untersuchen, revolutioniert und beginnen, Tiermodelle zu ersetzen, selbst in regulatorischen Umgebungen¹. Seit der Erstbeschreibung von Darmorganoiden durch Sato et al. im Jahr 2009 ist die Organoid-Technologie immens populär geworden². Eine große Anzahl von Studien hat die zelluläre Zusammensetzung und Funktion von Organoidmodellen sehr detailliert charakterisiert 3,4,5,6.

Protokoll

Dieses Protokoll erfordert 3D-Organoide mit einem Durchmesser von mindestens 200 μm, die ein ausgeprägtes Lumen haben und in eine künstliche extrazelluläre Matrix (ECM, z. B. Matrigel) eingebettet sind. Humanes Magengewebe für die Organoid-Gewinnung wurde mit Genehmigung des Institutional Review Board der Montana State University und mit Einverständniserklärung von Patienten gewonnen, die sich bei Bozeman Health einer oberen Endoskopie unterziehen (Protokoll # 2023-48-FCR, zu D.B.) oder als befreite Proben des ganzen Magens oder des Schlauchmagens aus dem National Disease Research Interchange (Protokoll #DB062615-EX). Informationen über die für diese Studie verwendete....

Diskussion

Der eingeschränkte Zugang zum luminalen Raum von Organoiden hat unser Verständnis der physiologischen Dynamik dieser Mikroumgebung stark eingeschränkt. Ein zuverlässiges Werkzeug für funktionelle Analysen der luminalen Physiologie wird unsere Fähigkeit erweitern, Organoide als In-vitro-Modelle für die Physiologie, Pharmakologie und Krankheitsforschung zu nutzen. Organoide sind hochgradig abstimmbare, physiologisch relevante Modelle mit dem zusätzlichen Potenzial, die genetische Variabilität innerhalb de.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile	CellTreat	229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229422
70% Ethanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile	CellTreat	229483
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605-100
Cell recovery solution	Corning	354253	Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Bovine Serum	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfate	Corning	30-234-CR
Gentamycin sulfate	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144C-212
Incubator	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 camera	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscope	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Right handed
MS-15 Motorized Stage	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microelectrodes	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Smartphone Camera Adapter	Gosky
Specifications Laboratory Stand LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µSensor Calibration Kit	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets