تسليم الجسيمات النانوية لحمولة قليلة النوكليوتيد في نموذج حيواني متعدد الأشكال للورم الأرومي الدبقي

Summary

يعد الحاجز الدموي الدماغي عقبة كبيرة في تقديم علاجات الورم الأرومي الدبقي ، وهو مرض لا يوجد علاج له. هنا ، نبلغ عن منصة نانو علاجية لأكسيد الحديد موجهة بالصور في الجسم الحي يمكنها تجاوز هذا الحاجز الفسيولوجي بحكم الحجم والتراكم في الورم.

Abstract

الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) هو الشكل الأكثر شيوعا وعدوانية للأورام الخبيثة الأولية في الدماغ التي لا يوجد علاج لها. يعد الحاجز الدموي الدماغي عقبة كبيرة في تقديم العلاجات إلى GBM. تم الإبلاغ هنا عن منصة نانو علاجية موجهة بالصور قائمة على أكسيد الحديد قادرة على تجاوز هذا الحاجز الفسيولوجي بحكم حجمها وتتراكمها في منطقة الورم ، وتسليم حمولتها. تتكون منصة النانو هذه 25 نانومتر من جزيئات نانوية من أكسيد الحديد المطلي بالديكستران المتشابكة وتحمل علامة بصبغة فلورية Cy5.5 وتحتوي على قليل النوكليوتيد المضاد للمعنى كحمولة صافية. يتيح قلب أكسيد الحديد المغناطيسي تتبع الجسيمات النانوية من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي ، بينما تسمح صبغة Cy5.5 بالتتبع عن طريق التصوير البصري. يوضح هذا التقرير بالتفصيل مراقبة تراكم منصة الجسيمات النانوية هذه (تسمى MN-anti-miR10b) في أورام الورم الأرومي الدبقي المزروعة تقويما بعد الحقن في الوريد. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر نظرة ثاقبة على التوصيل في الجسم الحي لقليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي ، وهي مشكلة أعاقت ترجمة علاجات الحمض النووي الريبي إلى العيادة.

Introduction

الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) هو أعلى درجة من الورم النجمي الذي لا يوجد علاج له تقريبا. يتم تشخيص ما يقرب من 15,000 شخص بالورم الأرومي الدبقي سنويا ، والذي يبلغ متوسط البقاء على قيد الحياة حوالي 15 شهرا ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات 5٪ ¹. في العقود الماضية ، كان هناك تحسن هامشي في التشخيص على الرغم من الجهود المتعددة للنهوض بالخيارات العلاجية. يتضمن المعيار الحالي للرعاية ل GBM الاستئصال الجراحي الأقصى ، عندما يكون ذلك ممكنا ، يليه العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي². كان Temozolomide (TMZ) ، العلاج الكيميائي المفضل ، أحدث علاج للورم الأرومي الدبقي الذي تم اكتشافه لإظهار فعالية سريرية ملحوظة. ومع ذلك ، فإن 50٪ على الأقل من أورام GBM تظهر مقاومة TMZ³. على الرغم من هذا النظام العلاجي الصارم ، لا تزال هناك حاجة سريرية كبيرة لتحسين علاج الورم الأرومي الدبقي.

يتم إعاقة تطوير علاجات GBM والأمراض الأخرى المرتبطة بالدماغ بشكل كبير بسبب الطبيعة الانتقائية للحاجز الدموي الدماغي (BBB). BBB هو حاجز فسيولوجي يتكون من الخلايا البطانية والخلايا المحيطة ونهايات أقدام الخلايا النجمية ، مما يخلق غشاء شبه منفذ بين الدورة الدموية والدماغ ، مما يحد من المرور الحر للجزيئات والخلايا إلى الدماغ⁴. في حين أنه وقائي في علم وظائف الأعضاء الطبيعي وحاسم لتوازن الدماغ ، يمنع BBB العديد من العلاجات من الوصول إلى الدماغ ، مما يعقد علاج GBM. أدت الجهود المبذولة لتعزيز توصيل العلاجات إلى GBM إلى تطوير مركبات توصيل قائمة على الجسيمات النانوية ، وتعزيز توصيل الأدوية بالموجات فوق الصوتية المركزة ، وتوصيل الأدوية بوساطة المستقبلات^5،6.

برزت الجسيمات النانوية كوسيلة واعدة لتطوير علاجات لعدد لا يحصى من الأمراض ، بما في ذلك السرطانات. تمت محاولة تطبيق الجسيمات النانوية لأغراض التصوير والعلاج في GBM باستخدام تركيبات الجسيمات النانوية المختلفة^7،8. مع التركيز على توصيل الأدوية إلى GBM جنبا إلى جنب مع التصوير في الجسم الحي للتسليم ، يستخدم النهج المقترح الجسيمات النانوية المغناطيسية (MN) التي تتكون من نواة أكسيد الحديد ومغطاة بالديكستران لتحقيق الاستقرار. تتيح الخصائص المغناطيسية لهذه الجسيمات النانوية اكتشافها عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (MR) ، بينما تسمح كيمياء الاقتران البسيطة لطلاء ديكستران الأمين باقتران الشقوق العلاجية مثل جزيئات الحمض النووي الريبي ، أو شقوق الاستهداف الإضافية ، أو شقوق التصوير (مثل الصبغة البصرية القريبة من الأشعة تحت الحمراء Cy5.5)^9،10. بالإضافة إلى قدرات التصوير ، فإن منصة النانو قادرة على إطالة عمر نصف علاجات الحمض النووي الريبي من خلال حماية قليل النوكليوتيد من النوكليازات الداخلية ، وتحسين التوصيل العلاجي. هنا ، يتم تقديم تطبيق منصة النانو هذه للتوصيل في الجسم الحي لقليل النوكليوتيدات العلاجية (تسمى MN-anti-miR10b) إلى GBM ، التي يتم مراقبتها بواسطة التصوير في الجسم الحي . في السابق ، تم إثبات قدرة منصة النانو هذه على التراكم في خلايا GBM في المختبر ، مما تسبب في فقدان كبير لقابلية الخلايا السرطانية¹¹. قبل إجراء الدراسات العلاجية في الجسم الحي ، من الضروري إثبات توصيل منصة النانو هذه في الجسم الحي إلى أورام GBM في النماذج الحيوانية. لتحقيق ذلك ، تم إنتاج نماذج حيوانية GBM تقويم العظام ، وتم إجراء الإعطاء الوريدي للبناء متبوعا بالتصوير في الجسم الحي . فيما يلي بروتوكولات هذه الدراسات التي تظهر التراكم في منطقة الورم التي تم تأكيدها بواسطة التصوير في الجسم الحي والفحص المجهري خارج الجسم الحي .

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ولاية ميشيغان (IACUC). تم شراء إناث الفئران العارية الرياضية من مختبرات جاكسون (سلالة # 007850) في عمر 7 أسابيع وسمح لها بالتأقلم لمدة أسبوع واحد قبل جراحة الزرع. كانت الفئران حوالي 21-25 جم في وقت الزرع. تم إنشاء خلايا U251 التي تعبر عن لوسيفيراز اليراع وقدمتها الدكتورة آنا دي كارفالو¹².

1. زراعة الخلايا والتحضير للزرع

1. مزرعة خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري المسمى لوسيفيراز ، U251 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على D-glucose و L-glutamine وبيروفات الصوديوم ومكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 70٪ من التقاء ، قم بالتربسين باستخدام 0.25٪ تريبسين / EDTA لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استخدم 2-4 مل لقارورة T-75 ، أو 4-6 مل لقارورة T-175.
3. بعد انفصال الخلايا عن القارورة ، قم بإخماد التفاعل بنسبة 2: 1 من DMEM المكمل واخلطه برفق عن طريق سحب العينات لفصل الخلايا في معلق أحادي الخلية. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
4. قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). عد الخلايا باستخدام مقياس الدم باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق لاستبعاد الخلايا الميتة وحساب العدد الإجمالي للخلايا الحية. بيليه الخلايا مرة أخرى ، كما هو موضح أعلاه.
5. أعد تعليق حبيبات الخلية إلى تركيز 1 × 10⁸ خلايا / مل في PBS وقم بتخزين معلق الخلية على الجليد للزرع داخل الجمجمة.

2. زرع ورم تقويم العظام اليدوي

ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من Irtenkauf et al. (إجراء الدكتورة آنا ديكارفاليو; مركز هنري فورد هيلث هيرميلين لأورام الدماغ)¹². يجب تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية لضمان السلامة لكل من الأشخاص والباحثين. تسمح طريقة الزرع اليدوي بإجراء أسرع لتحقيق أحجام عينات أكبر مع الحفاظ على جودة الزرع داخل الجمجمة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام جهاز تجسيمي لزرع الورم بنفس الإحداثيات الموضحة أدناه.

1. قم بوزن الفأر العاري والرياضي وقم بإعطاء محلول مخدر من الكيتامين/زيلازين (100 ملغم/كغ/10 ملغ/كجم) عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام حقنة 28G. ضع الماوس في قفص استرداد فوق وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. تأكد من التخدير عن طريق فحص منعكس الدواسة.
2. ضع مرهم العين العيني ، وقم بإعطاء كيتوبروفين (5 مجم / كجم) تحت الجلد باستخدام حقنة 28G ، وإعطاء لكمات الأذن المحددة.
3. تعقيم موقع الجراحة في الجزء العلوي من الرأس باستخدام 70٪ من الإيثانول متبوعا بمقشر البيتادين وكرر 3 مرات. بعد ذلك ، قم بعمل شق 5-7 مم بمقص جراحي صغير على يمين خط الوسط للرأس وسحب الجلد بالملقط الدقيق لفضح خطوط الجمجمة والخياطة في الجمجمة.
4. افرك الجمجمة بقطعة قطن لإزالة السمحاق ، مما يسمح بالوصول إلى العظام. ضع محلولا من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ باستخدام قطعة قطن جديدة لتجفيف العظام. باستخدام قطعة قطن جديدة ، امسح بيروكسيد الهيدروجين الزائد وأي رغوة قد تتشكل. كرر هذه الخطوة 3 مرات حتى يظهر البريجما على الجمجمة ويصبح العظم جافا بدرجة كافية للحفر. ستحتوي الجمجمة الجافة بدرجة كافية على خطوط خياطة بيضاء بشكل صارخ وتقليل الاحمرار من مظهر البداية.
5. فيما يتعلق بالبريجما ، قم بقياس -2.5 مم وسطي / جانبي و -1 مم أمامي / خلفي بمسطرة وقم بتمييز موقع الحفر بعلامة. قم بالقياس مرة أخرى قبل الحفر للتأكد من أن العلامة في الموضع الصحيح.
6. خذ مثقابا كهربائيا للجراحة الدقيقة (11,000 دورة في الدقيقة) مع لدغ حفر 0.5 مم وقم بعمل ثقب في الجمجمة بعناية حيث تم وضع علامة عليه مسبقا. امتصاص أي دم أو سوائل قد تتراكم في موقع الحفر بقطعة قطن طازجة.
7. قم بإعداد حقنة ميكرولتر 33G مزودة بغطاء إبرة بطول إبرة مكشوفة يبلغ 3 مم. ارسم 5 ميكرولتر من معلق الخلية 1 × 10⁸ خلية/مل المعدة مسبقا بعد إعادة التعليق لفترة وجيزة باستخدام ماصة وتأكد من عدم وجود فقاعات في محلول الحقن. امسح بعناية أي تعليق خلوي زائد متبقي على الجزء الخارجي من الإبرة وكم الإبرة بمنديل 70٪ من الأيزوبروبانول.
8. أدخل الإبرة عموديا في موقع الحفر حتى يتوقف غلاف الإبرة عن إدخال الإبرة. اسحب الإبرة بعناية حوالي 0.5 مم لتوفير مساحة لتراكم الخلايا المحقونة.
9. حقن معلق الخلية ببطء على مدى 1 دقيقة. بمجرد حقن الحجم الكامل ، أمسك الإبرة في العمق لمدة دقيقة إضافية لتقليل تدفق محلول الحقن. ثم اسحب الإبرة بعناية.
10. باستخدام قطعة قطن نظيفة ، امسح أي سائل يتراكم في موقع الحقن ثم ضع شمع العظام لإغلاق الفتحة.
11. أغلق الشق برابطة بيطرية واتركه حتى يجف. باستخدام قطعة قطن نظيفة ، ضع الليدوكائين الموضعي كمسكن.
12. راقب الماوس حتى يتعافى تماما ومتنقل. تطبيق كيتوبروفين (5 ملغ/كغ) تحت الجلد لمدة يومين بعد الزرع للتحكم في الألم.

3. تخليق منصة الجسيمات النانوية

1. قم بتصنيع الجسيمات النانوية واقترانها مع Cy5.5 وقليل النوكليوتيد (مضاد miR10b) كما هو موضح سابقا¹¹.

4. إدارة MN-anti-miR10b

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء الحقن مرة واحدة في الأسبوع لمدة 6 أسابيع بدءا من 7 أيام بعد الزرع ، ولكن يمكن استخدام نفس البروتوكول لترددات الحقن المختلفة.

1. قم بوزن الماوس واحسب حجم MN-anti-miR10b لإدارته للماوس. يتم إعطاء جرعات MN-anti-miR10b عند 20 مجم Fe / kg في نماذج GBM للفئران. على سبيل المثال ، يتلقى الفأر 20 جم جرعة 80 ميكرولتر من 5 مجم Fe / مل MN-anti-miR10b. تتلقى الفئران الضابطة حجما متساويا من PBS بما يتوافق مع مخطط الجرعات هذا.
2. قم بإعداد حقنة 28G بجرعة MN-anti-miR10b وتأكد من عدم وجود فقاعات في محلول الحقن.
3. قم بتخدير الفأر تحت 2٪ -4٪ أيزوفلوران للحث و 1.5٪ -2٪ للصيانة بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة في صندوق الحث. حرك الفأر إلى مخروط الأنف واستمر في إعطاء التخدير. تحقق من عمق التخدير وقم بتطبيق مرهم بيطري.
4. عقم الذيل بمنديل 70٪ من الأيزوبروبانول واترك الكحول الزائد يجف.
5. قم بتدوير الذيل لوضع الأوردة الذيلية الجانبية في الجزء العلوي من الذيل. ثم ، بهدف الوريد ، أدخل الإبرة في الذيل وقم بإنشاء فراغ عن طريق سحب المكبس للخلف.
6. أدخل الإبرة حتى يدخل الدم إلى المحقنة ، مما يشير إلى الدخول الناجح إلى الوريد.
7. حقن MN-anti-miR10b ببطء وسحب الإبرة بعد الولادة الكاملة. اضغط على موقع الحقن بالشاش حتى يتوقف النزيف.
8. قم بإزالة الماوس من مخروط الأنف. راقب الماوس حتى يتعافى تماما ومتنقل.
   ملاحظة: قد يسبب إعطاء البلعة للجسيمات النانوية ضائقة في التنفس. راقب الماوس بعناية وقم بتطبيق ضغطات خفيفة على الصدر على الفور إذا كانت هناك علامات على ضائقة التنفس.

5. في الجسم الحي التلألؤ البيولوجي والتصوير الفلوري

ملاحظة: يتم إجراء التلألؤ البيولوجي في الجسم الحي والتصوير الفلوري في نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) قبل وبعد 24 ساعة من حقن الجسيمات النانوية.

1. تحضير D-luciferin معقم مفلتر بتركيز 30 مجم / مل في PBS بدون Mg²⁺ و Ca²⁺.
2. افتح برنامج تشغيل IVIS وابدأ التهيئة لإعداد الجهاز. أثناء تهيئة النظام، حدد مجلدا لحفظ الصور عن طريق تحديد الاكتساب > الحفظ التلقائي في وتحديد المجلد الخاص بالملفات المراد حفظها.
3. في النقاط الزمنية للتصوير ، قم بوزن الفأر واحسب حجم D-luciferin لإدارته لجرعة 150 مجم / كجم. قم بإعداد حقنة 28G مع الحجم ، مما يحمي المحلول من الضوء المباشر. تضمنت هذه الدراسة التصوير بعد يومين من جراحة الزرع لتأكيد البذر ، وبدأ التصوير الأسبوعي في اليوم السابع بعد الزرع مباشرة قبل العلاجات الأسبوعية.
4. قم بتخدير الفأر تحت 2٪ -4٪ إيزوفلوران للحث و 1.5٪ -2٪ للصيانة بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة في غرفة الحث. بمجرد التخدير ، قم بتجشير الفأر برفق لتجنب المزيد من الإصابات في موقع الجراحة وحقن جرعة D-luciferin داخل الصفاق. اسمح للفأر بالتعافي وانتظر لمدة 10 دقائق قبل التصوير للسماح لإشارة التلألؤ البيولوجي بالتطور والاستقرار.
5. أثناء تطور إشارة التلألؤ البيولوجي ، قم بإعداد الماسح الضوئي IVIS للتصوير الحيوي. ضع حصيرة التألق المنخفضة السوداء في مرحلة التصوير وقم بتكوين مصفوفة مخروط الأنف لعدد الأهداف المراد تصويرها.
6. في البرنامج، انقر فوق معالج التصوير. حدد Bioluminescence Imaging ثم حدد Open Filter. في الشاشة التالية، حدد موضوع التصوير ومجال الرؤية. تم تعيين IVIS الآن للتصوير الحيوي.
7. قبل التصوير بمقدار 3 دقائق ، ابدأ في تحضير صندوق الحث عن طريق السماح لخليط الأيزوفلوران / الأكسجين بملء الصندوق. قبل التصوير بدقيقتين ، ضع الفئران في صندوق الحث للتخدير.
8. بمجرد التخدير ، انقل الفئران من صندوق الحث إلى IVIS للتصوير ووضع كل منها في وضع الانبطاح. توفير التخدير المداومة باستخدام 2٪ الأيزوفلوران أثناء التصوير.
9. بمجرد وضع الفئران في الماسح الضوئي IVIS، انقر فوق اكتساب التسلسل. التقط صورة باستخدام إعدادات التعريض الضوئي التلقائي مع حد أدنى للإشارة يبلغ 3,000 عدد. يصور التصوير الحيوي توطين خلايا الورم الأرومي الدبقي U251 المسمى لوسيفيراز. سيلتقط التعريض الضوئي التلقائي صورة بطول تعريض ضوئي محسوب بناء على الإشارة الأكثر سطوعا في العرض حتى الحد الأقصى للطول المحدد من قبل المستخدم وهو 5 دقائق.
   ملاحظة: يتطلب القفص النموذجي للفئران صورة واحدة ، حيث يكون البذر موحدا بشكل عام. في الحالات التي تحتوي على فئران ساطعة واحدة أو أكثر ، يمكن إزالة الفئران ، ويمكن إجراء عملية اكتساب متكررة لالتقاط إشارات بشكل أفضل من الفئران الخافتة.
10. بعد التصوير الحيوي ، قم بتغيير إعدادات IVIS لإعداد التصوير الفلوري وإجراء فحوصات التألق.
    1. في معالج التصوير، حدد Fluorescence > Filtered Pair with Epi-Illumination. في الشاشة التالية ، حدد المجسات المراد تصويرها ، مثل Cy5.5. حدد موضوع التصوير ومجال الرؤية. تم الآن ضبط الماسح الضوئي IVIS للتصوير الفلوري للمجسات المحددة في الشاشة السابقة.
11. التقط صورة باستخدام إعدادات التعريض الضوئي التلقائي مع حد أدنى للإشارة يبلغ 6,000 عد. يصور التصوير الفلوري Cy5.5 توطين MN-anti-miR10b. سيلتقط التعريض الضوئي التلقائي صورة بطول تعريض ضوئي محسوب بناء على الإشارة الأكثر سطوعا في العرض حتى الحد الأقصى للطول المحدد من قبل المستخدم وهو 5 دقائق.
    ملاحظة: نادرا ما يستغرق التصوير الفلوري أكثر من 1 دقيقة من التعرض ، حتى في الفئران المحقونة ب PBS. تكون الصورة الواحدة كافية دائما لأن انحراف الإشارة بين الفئران المعالجة صغير.
12. قم بإزالة الماوس من IVIS بعد التصوير. راقب حتى يتعافى تماما من التخدير والإسعاف.

6. في الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي

ملاحظة: يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي قبل حقن الجسيمات النانوية وبعد 24 ساعة ويمكن إجراؤه في نفس التي تخضع للتصوير البصري والتلألؤ البيولوجي.

1. قم بتخدير الماوس الموضوع في صندوق تحريضي تحت 2٪ -4٪ إيزوفلوران للحث و 1.5٪ -2٪ للصيانة بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة. بمجرد التخدير ، ضع الفأر على سرير التصوير بالرنين المغناطيسي أعلى بالون مراقبة الجهاز التنفسي. ضع مخروط الأنف بإحكام على الخطم لتقديم التخدير أثناء التصوير ووضع مرهم العين للعين.
2. قم بتثبيت الرأس ووضعه للمسح الضوئي باستخدام قضيب العض وقضبان الأذن.
3. قم بتثبيت مسبار درجة حرارة المستقيم المشحم وتأكد من عمل التنفس ومراقبة درجة الحرارة. ضع ملف دماغ الماوس فوق الرأس عن طريق تركيب الأوتاد الموجودة على سرير الماوس في الفتحات الموجودة على الملف وقم بلصق الملف في مكانه لتقليل الحركة أثناء المسح.
4. ضع وسادة صغيرة لتدوير الماء الدافئ فوق الجزء العلوي من الماوس للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء التخدير. احرص على السماح ببعض المسافة بين الملف وبطانية التسخين للحد من تشويه الصورة عن طريق تداخل الماء.
5. حرك الماوس وسرير التصوير إلى موضعهما للمسح الضوئي.
6. قم بضبط ملفات التصوير بالرنين المغناطيسي ومطابقتها عن طريق بدء خطوة إعداد Wobble في برنامج الاستحواذ. في نهاية خدمة التصوير بالرنين المغناطيسي ، استخدم مقابض الضبط والمطابقة الموجودة على الملف للتأكد من أن التتبع في المنتصف (الضبط) وعميق قدر الإمكان (تطابق).
7. احصل على مسح موضعي ثلاثي المستويات واضبط سرير التصوير لوضع الدماغ في مركز المغناطيس ، إذا لزم الأمر.
8. احصل على فحوصات مرجحة 2D T₂ للكشف عن العامل المحقون في الورم باستخدام المعلمات التالية: وقت التكرار (TR) = 2500 مللي ثانية ، وقت الصدى (TE) = 25 مللي ثانية ، مجال الرؤية (FOV) 20 × 20 مم ، 18 شريحة إكليلية ، فجوة شريحة 0.2 مم ، دقة 150 × 150 ميكرومتر ، سمك شريحة 0.5 مم.
9. احصل على خريطة B0 للدماغ بأكمله لحساب الرقائق المترجمة باستخدام الأداة المساعدة Mapshim. بعد ذلك ، استخدم الصور المرجحة 3D T₂ لتصور الجسيمات النانوية ب TR = 30 مللي ثانية ، TE = 10 مللي ثانية ، مجال الرؤية 20 × 15 × 12 مم ، دقة 100 ميكرومتر متناحية.
10. احصل على خريطة T₂ ^* لمزيد من التصوير بالجسيمات النانوية باستخدام الصورة المرجحة 2D T₂ كمرجع لمسح الموضع فوق الورم. استخدم TR = 800 مللي ثانية ، TE = 3.5 مللي ثانية. مجال الرؤية 20 × 20 مم ، 5 شرائح إكليلية ، لا توجد فجوة في الشريحة. الدقة في المستوى 100 ميكرومتر في المستوى. احصل على 10 صور صدى إيجابية مع تباعد وقت صدى يبلغ 5 مللي ثانية.
11. مراقبة التنفس ودرجة حرارة الجسم في جميع أنحاء تسلسل التصوير وضبط درجة حرارة الأيزوفلوران والماء إذا لزم الأمر.
12. بعد التصوير ، قم بإزالة الماوس من ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي وضعه في قفص استرداد ساخن. راقب الماوس حتى يتعافى تماما من التخدير والإسعاف.

7. التلألؤ البيولوجي خارج الجسم الحي والتصوير الفلوري

1. إجراء التلألؤ البيولوجي خارج الجسم الحي والتصوير الفلوري في IVIS ، على غرار التصوير في الجسم الحي . قم بتنفيذ تهيئة IVIS وخطوات إعداد المسح الضوئي كما هو موضح أعلاه.
2. في نقطة النهاية التجريبية ، قم بوزن الفأر واحسب حجم D-luciferin لإعطاء جرعة 150 مجم / كجم. حقن جرعة D-luciferin وإجراء التصوير الحي بعد 10 دقائق من الحقن ، كما هو موضح سابقا.
3. بعد التلألؤ البيولوجي النهائي في الجسم الحي والتصوير الفلوري ، قم بالقتل الرحيم للفأر بسرعة عن طريق خلع عنق الرحم بينما لا يزال تحت التخدير ، وقم بتشريح الفأر ، وجمع الأعضاء الرئيسية ، بما في ذلك الدماغ ، على طبق بتري.
4. ضع طبق بتري مع الأعضاء المستقطوعة في الماسح الضوئي IVIS وقم بتصوير الأعضاء بكل من طرق التلألؤ البيولوجي والفلورة باستخدام نفس إعدادات الاستحواذ مثل التصوير في الجسم الحي .
5. قم بتجميد الفلاش لأي أعضاء ضرورية لمزيد من التحليل في OCT عن طريق خفض التبريد ببطء مع العينة في OCT إلى بركة ضحلة من النيتروجين السائل مع ملقط طويل حتى يتحول OCT إلى اللون الأبيض تماما. لا تسمح للنيتروجين السائل بلمس السائل OCT أو خفض القالب بسرعة كبيرة ، حيث سيحدث فقاعات OCT. قم بتخزين العينات المجمدة عند -80 درجة مئوية.
6. قم بتخزين الدماغ الذي يحتوي على الورم في OCT والتجميد السريع للاستئصال بالتبريد. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة للتحليل.

8. الفحص المجهري الفلوري

1. جهز ناظم البرد للاستئصال بالتبريد. اضبط درجة حرارة الغرفة ورأس العينة بين -15 درجة مئوية و -20 درجة مئوية.
2. خذ الدماغ المجمد في OCT من تخزين -80 درجة مئوية وضعه داخل حجرة ناظم البرد. اترك العينات تسخن إلى درجة حرارة الغرفة (-20 درجة مئوية) قبل التقسيم.
3. باستخدام ماكينة حلاقة ذات حواف واحدة ، قم بقطع الدماغ إكليليا في موقع الحقن. عادة ما يكون هذا مرئيا على شكل غمازة على سطح الدماغ. قم بتركيب العينة على قرص العينة باستخدام كمية صغيرة من OCT لوضع الجانب المقطوع من الدماغ المراد تقسيمه. قم بتطبيق ضغط وافر مع الوزن المبرد داخل الغرفة لضمان التركيب المستقر للعينة.
4. انقل العينة المركبة وقرص العينة إلى رأس العينة استعدادا للتقسيم. قم بقص الأنسجة إلى العمق المطلوب عن طريق أخذ أقسام 20 ميكرومتر ، وضبط زاوية العينة لتقسيم الأنسجة بالقرب من المستوى مع الأنسجة قدر الإمكان.
5. بمجرد الوصول إلى عمق الأنسجة المطلوب ، اضبط ناظم البرد ليأخذ أقساما من 5 إلى 7 ميكرومتر من العينة. قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية مسماة مسبقا بواصفات مثل معرف الماوس ، والأنسجة المقسمة ، ورقم الشريحة عن طريق خفض الجانب المشحون من شريحة المجهر بسرعة على القسم.
6. اصنع 4٪ بارافورمالدهيد طازج (PFA). اغمر الشريحة بأنسجة في محلول PFA لمدة 15 دقيقة لإصلاح الأنسجة. اشطف الشريحة باستخدام DPBS 3x بعد التثبيت.
7. إلى قسم الأنسجة الثابت الآن على الشريحة الزجاجية ، أضف قطرة 40 ميكرولتر من وسط التركيب الذي يحتوي على 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، والذي يلطخ نوى الخلية. ضع بعناية غطاء زجاجي مقاس 24 مم × 50 مم أعلى وسائط التثبيت وتأكد من تغليف الأنسجة بالكامل في وسائط التثبيت.
8. تصور الأنسجة باستخدام الفحص المجهري الفلوري DAPI (الانبعاث (em) عند 359 نانومتر, الإثارة (ex) عند 457 نانومتر) و Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm).

النتائج

تم تصنيع MN-anti-miR10b وتوصيفه ، كما هو موضح سابقا¹¹. يظهر المجهر الإلكتروني للإرسال ل MN-anti-miR10b مورفولوجيا وتعدد التشتت لمنصة النانو (الشكل 1 ب). يبلغ متوسط حجم منصة النانو هذه 25.12 ± 0.34 نانومتر مع إمكانات زيتا تبلغ 13.18 ± 1.47 مللي فولت (

Discussion

يمكن أن تكون العديد من الخطوات الحاسمة عبر الطرق المختلفة للتحقق من صحة تراكم الجسيمات النانوية عبر BBB حاسمة لنجاح البروتوكول. بدءا من زرع تقويم العظام لخلايا GBM ، من المهم التأكد من أن خطوط خياطة الجمجمة مرئية بعد تجفيف العظام ؛ هذا يساعد في وضع الخلايا السرطانية بدقة. ل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery