Entrega de nanopartículas de uma carga útil de oligonucleotídeo em um modelo animal de glioblastoma multiforme

Resumo

A barreira hematoencefálica é um obstáculo significativo na entrega de terapias para o glioblastoma, uma doença para a qual não há cura. Aqui, relatamos uma nano plataforma terapêutica de óxido de ferro guiada por imagem in vivo que pode contornar essa barreira fisiológica em virtude do tamanho e se acumular no tumor.

Resumo

O glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais comum e agressiva de malignidade cerebral primária para a qual não há cura. A barreira hematoencefálica é um obstáculo significativo na entrega de terapias ao GBM. Relatada aqui é uma nano plataforma de entrega terapêutica baseada em óxido de ferro guiada por imagem, capaz de contornar essa barreira fisiológica em virtude do tamanho e se acumular na região do tumor, entregando sua carga útil. Esta plataforma nano de 25 nm consiste em nanopartículas de óxido de ferro revestidas com dextrana reticuladas marcadas com corante fluorescente Cy5.5 e contendo oligonucleotídeo antisense como carga útil. O núcleo magnético de óxido de ferro permite o rastreamento das nanopartículas por meio de ressonância magnética in vivo , enquanto o corante Cy5.5 permite o rastreamento por imagens ópticas. Este relatório detalha o monitoramento do acúmulo dessa plataforma de nanopartículas (denominada MN-anti-miR10b) em tumores de glioblastoma implantados ortotopicamente após injeção intravenosa. Além disso, fornece informações sobre a entrega in vivo de oligonucleotídeos de RNA, um problema que tem dificultado a tradução da terapêutica de RNA para a clínica.

Introdução

O glioblastoma multiforme (GBM) é o grau mais alto de astrocitoma para o qual praticamente não há cura. Aproximadamente 15.000 pessoas são diagnosticadas com glioblastoma anualmente, o que tem uma sobrevida média sombria de cerca de 15 meses e uma taxa de sobrevida de 5 anos de 5%¹. Nas últimas décadas, houve uma melhora marginal no prognóstico, apesar dos múltiplos esforços para avançar nas opções terapêuticas. O padrão atual de tratamento para GBM inclui ressecção cirúrgica máxima, quando viável, seguida de radioterapia e quimioterapia². A temozolomida (TMZ), a quimioterapia de escolha, foi a mais recente terapia para glioblastoma descoberta para mostrar notável eficácia clínica; no entanto, pelo menos 50% dos tumores de GBM apresentam resistência à TMZ³. Apesar desse regime terapêutico rigoroso, ainda há uma necessidade clínica significativa de melhorar a terapia do glioblastoma.

O desenvolvimento de terapias para GBM e outras doenças relacionadas ao cérebro é significativamente prejudicado pela natureza seletiva da barreira hematoencefálica (BHE). A BHE é uma barreira fisiológica composta por células endoteliais, pericitos e extremidades dos pés dos astrócitos, que cria a membrana semipermeável entre o sistema circulatório e o cérebro, restringindo a livre passagem de moléculas e células para o cérebro⁴. Embora protetora na fisiologia normal e crítica para a homeostase cerebral, a BHE impede que muitas terapias cheguem ao cérebro, complicando o tratamento do GBM. Os esforços para melhorar a entrega de terapêuticas ao GBM levaram ao desenvolvimento de veículos de entrega baseados em nanopartículas, aprimoramento da entrega de medicamentos por ultrassom focalizado e administração de medicamentos mediada por receptor ^5,6.

As nanopartículas surgiram como um meio promissor para o desenvolvimento de terapias para uma miríade de doenças, incluindo cânceres. A aplicação de nanopartículas para fins terapêuticos e de imagem em GBM tem sido tentada usando várias construções de nanopartículas ^7,8. Com o foco na entrega de medicamentos ao GBM em conjunto com imagens in vivo da entrega, a abordagem proposta utiliza nanopartículas magnéticas (MN) que consistem em um núcleo de óxido de ferro e cobertas por dextrano para estabilidade. As propriedades magnéticas dessas nanopartículas permitem sua detecção por ressonância magnética (RM), enquanto a química de conjugação simples com o revestimento de dextrano aminado permite a conjugação de porções terapêuticas, como moléculas de RNA, porções de direcionamento adicionais ou porções de imagem (como o corante óptico de infravermelho próximo Cy5.5) ^{9 , 10}. Além dos recursos de imagem, a plataforma nano é capaz de estender a meia-vida da terapêutica de RNA, protegendo o oligonucleotídeo das nucleases endógenas, melhorando a entrega terapêutica. Aqui, é apresentada a aplicação desta nanoplataforma para entrega in vivo de oligonucleotídeos terapêuticos (denominados MN-anti-miR10b) ao GBM, monitorada por imagens in vivo. Anteriormente, a capacidade dessa nanoplataforma de se acumular foi demonstrada em células GBM in vitro, causando perda significativa de viabilidade das células tumorais¹¹. Antes de realizar estudos terapêuticos in vivo, é necessário demonstrar a entrega in vivo desta nano plataforma para tumores GBM em modelos animais. Para isso, foram produzidos modelos animais ortotópicos de GBM, e a administração intravenosa do construto foi realizada seguida de imagens in vivo. Aqui estão descritos os protocolos desses estudos mostrando acúmulo na região do tumor confirmado por imagem in vivo e microscopia ex vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Michigan (IACUC). Camundongos fêmeas nus atímicos foram comprados da Jackson Labs (cepa # 007850) com 7 semanas de idade e autorizados a se aclimatar por 1 semana antes da cirurgia de implantação. Os camundongos tinham aproximadamente 21-25 g no momento do implante. As células U251 expressando luciferase de vaga-lume foram geradas e fornecidas pela Dra. Ana de Carvalho¹².

1. Cultura celular e preparação para implantação

1. Cultura de células de glioblastoma humano marcadas com luciferase, U251 em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo D-glicose, L-glutamina e piruvato de sódio e suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Quando as células atingirem 70% de confluência, tripsinize com 0,25% de tripsina/EDTA por 1-2 min a 37 °C. Use 2-4 mL para um balão T-75 ou 4-6 mL para um balão T-175.
3. Depois que as células se desprenderem do frasco, extinguir a reação com uma proporção de 2:1 de DMEM suplementado e misturar suavemente pipetando para dissociar as células em uma suspensão de célula única. Transfira as células para um tubo cônico e peletize as células por centrifugação a 300 x g por 5 min.
4. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Conte as células com um hemocitômetro usando a coloração com azul de tripano para excluir as células mortas e calcular o número total de células vivas. Pulverize as células novamente, conforme descrito acima.
5. Ressuspenda o pellet celular a uma concentração de 1 x 10⁸ células / mL em PBS e armazene a suspensão celular em gelo para implantação intracraniana.

2. Implante de tumor ortotópico à mão livre

NOTA: Este protocolo é adaptado de Irtenkauf et al. (procedimento da Dra. Ana deCarvalho; Centro de Tumores Cerebrais Henry Ford Health Hermelin)¹². Todas as etapas devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança para garantir a segurança tanto dos sujeitos quanto dos pesquisadores. O método de implantação à mão livre permite um procedimento mais rápido para atingir tamanhos de amostra maiores, mantendo a qualidade da implantação intracraniana. Alternativamente, um dispositivo estereotáxico pode ser usado para implantar o tumor nas mesmas coordenadas descritas abaixo.

1. Pese o camundongo atímico nu e administre uma solução anestésica de cetamina / xilazina (100 mg / kg / 10mg / kg) por injeção intraperitoneal com uma seringa 28G. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação em cima de uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. Confirme a anestesia verificando o reflexo do pedal.
2. Aplique pomada oftálmica para os olhos, administre cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea com uma seringa 28G e dê perfurações de identificação na orelha.
3. Esterilize o local cirúrgico no topo da cabeça com etanol a 70% seguido de esfoliação betadina e repita 3x. Em seguida, faça uma incisão de 5-7 mm com uma pequena tesoura cirúrgica à direita da linha média da cabeça e retraia a pele com uma pinça fina para expor o crânio e as linhas de sutura do crânio.
4. Esfregue o crânio com um cotonete para remover o periósteo, permitindo o acesso ao osso. Aplique uma solução de peróxido de hidrogênio a 3% usando um novo cotonete para secar o osso. Usando um novo cotonete, limpe o excesso de peróxido de hidrogênio e qualquer espuma que possa se formar. Repita esta etapa 3x até que o bregma esteja visível no crânio e o osso esteja suficientemente seco para perfuração. Um crânio suficientemente seco terá linhas de sutura totalmente esbranquiçadas e vermelhidão reduzida desde a aparência inicial.
5. Com relação ao bregma, meça -2,5 mm medial/lateral e -1 mm anterior/posterior com uma régua e marque o local da broca com um marcador. Meça novamente antes de perfurar para garantir que a marca esteja na posição correta.
6. Pegue uma broca de microcirurgia elétrica (11.000 RPM) com uma broca de 0,5 mm e faça cuidadosamente um furo no crânio onde foi previamente marcado. Absorva qualquer sangue ou fluido que possa se acumular no local da broca com um cotonete fresco.
7. Prepare uma seringa de microlitros de 33G equipada com uma manga de agulha com um comprimento de agulha exposto de 3 mm. Retire 5 μL da suspensão de 1 x 10^{células /} mL de células previamente preparada após ressuspensão breve com uma pipeta e certifique-se de que não haja bolhas na solução de injeção. Limpe cuidadosamente qualquer excesso de suspensão celular deixada na parte externa da agulha e da manga da agulha com um pano de isopropanol a 70%.
8. Insira a agulha verticalmente no local da broca até que a manga da agulha pare de inserir a agulha. Retraia cuidadosamente a agulha aproximadamente 0,5 mm para criar espaço para que as células injetadas se acumulem.
9. Injete lentamente a suspensão celular durante um período de 1 min. Uma vez injetado o volume total, mantenha a agulha em profundidade por mais um minuto para reduzir o efluxo da solução injetável. Em seguida, retraia a agulha com cuidado.
10. Com um cotonete limpo, limpe qualquer líquido que se acumule no local da injeção e, em seguida, aplique cera óssea para selar o orifício.
11. Feche a incisão com uma ligação veterinária e deixe secar. Com um cotonete limpo, aplique lidocaína tópica como analgésico.
12. Monitore o mouse até que esteja totalmente recuperado e deambulatório. Administre cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea por 2 dias após o implante para controle da dor.

3. Síntese da plataforma de nanopartículas

1. Sintetizar e conjugar as nanopartículas com Cy5.5 e oligonucleotídeo (anti-miR10b) conforme descrito anteriormente¹¹.

4. Administração de MN-anti-miR10b

NOTA: Neste estudo, as injeções foram feitas uma vez por semana durante 6 semanas, começando 7 dias após o implante, mas o mesmo protocolo pode ser usado para várias frequências de injeção.

1. Pese o camundongo e calcule o volume de MN-anti-miR10b a ser administrado ao camundongo. Doses de MN-anti-miR10b são administradas a 20 mg Fe/kg em modelos murinos de GBM. Por exemplo, um camundongo de 20 g recebe uma dosagem de 80 μL de 5 mg de Fe/mL de MN-anti-miR10b. Os camundongos de controle recebem um volume igual de PBS consistente com este esquema de dosagem.
2. Prepare uma seringa de 28G com a dose de MN-anti-miR10b e certifique-se de que não há bolhas na solução injetável.
3. Anestesiar o camundongo sob 2% -4% de isoflurano para indução e 1,5% -2% para manutenção com uma taxa de fluxo de 1,5 L / min em uma caixa de indução. Mova o mouse para um cone nasal e continue a administrar anestesia. Verifique a profundidade da anestesia e aplique pomada veterinária.
4. Esterilize a cauda com um pano de isopropanol a 70% e deixe o excesso de álcool secar.
5. Gire a cauda para posicionar as veias caudais laterais no topo da cauda. Em seguida, apontando para a veia, insira a agulha na cauda e estabeleça um vácuo puxando o êmbolo para trás.
6. Insira a agulha até que o sangue entre na seringa, indicando a entrada bem-sucedida na veia.
7. Injete lentamente o MN-anti-miR10b e retraia a agulha após o parto completo. Aplique pressão no local da injeção com gaze até que o sangramento pare.
8. Remova o mouse do cone do nariz. Monitore o mouse até que esteja totalmente recuperado e deambulatório.
   NOTA: A administração em bolus de nanopartículas pode causar desconforto respiratório. Monitore cuidadosamente o mouse e aplique imediatamente leves compressões torácicas se houver sinais de dificuldade respiratória.

5. Imagem de bioluminescência e fluorescência in vivo

NOTA: A bioluminescência in vivo e a imagem de fluorescência são realizadas no Sistema de Imagem In Vivo (IVIS) antes e 24 h após a injeção da nanopartícula.

1. Prepare D-luciferina filtrada estéril a uma concentração de 30 mg / mL em PBS sem Mg²⁺ e Ca²⁺.
2. Abra o software de operação IVIS e inicie a inicialização para preparar a máquina. Enquanto o sistema inicializa, selecione uma pasta para salvar as imagens selecionando Aquisição > Salvar automaticamente em e defina a pasta para os arquivos a serem salvos.
3. Em pontos de tempo de imagem, pesar o camundongo e calcular o volume de D-luciferina a ser administrado para uma dose de 150 mg / kg. Prepare uma seringa de 28G com o volume, protegendo a solução da luz direta. Este estudo incluiu imagens 2 dias após a cirurgia de implantação para confirmar a semeadura, e imagens semanais iniciadas no dia 7 após o implante, imediatamente antes dos tratamentos semanais.
4. Anestesiar o camundongo sob 2%-4% de isoflurano para indução e 1,5%-2% para manutenção com uma taxa de fluxo de 1,5 L/min em uma câmara de indução. Uma vez anestesiado, esfregue suavemente o mouse para evitar mais lesões no local da cirurgia e injete a dose de D-luciferina por via intraperitoneal. Permita que o mouse se recupere e aguarde 10 minutos antes da imagem para permitir que o sinal de bioluminescência se desenvolva e se estabilize.
5. Enquanto o sinal de bioluminescência se desenvolve, prepare o scanner IVIS para imagens de bioluminescência. Coloque o tapete preto de baixa fluorescência no estágio de imagem e configure o conjunto de cones do nariz para o número de assuntos a serem fotografados.
6. No software, clique em Assistente de Imagem. Selecione Imagem de Bioluminescência e, em seguida, selecione Abrir Filtro. Na próxima tela, selecione Assunto de imagem e campo de visão. O IVIS agora está configurado para imagens de bioluminescência.
7. 3 minutos antes da imagem, comece a preparar a caixa de indução, permitindo que a mistura de isoflurano/oxigênio encha a caixa. 2 minutos antes da imagem, coloque os camundongos na caixa de indução para anestesia.
8. Uma vez anestesiados, mova os camundongos da caixa de indução para o IVIS para imagens e deite-os na posição prona. Forneça anestesia de manutenção usando isoflurano a 2% durante a imagem.
9. Depois que os mouses forem colocados no scanner IVIS, clique em Adquirir sequência. Tire uma imagem usando configurações de exposição automática com um limite mínimo de sinal de 3.000 contagens. A imagem de bioluminescência visualiza a localização de células de glioblastoma U251 marcadas com luciferase. A exposição automática irá captar uma imagem com uma duração de exposição calculada com base no sinal mais brilhante em vista até à duração máxima definida pelo utilizador de 5 min.
   NOTA: Uma gaiola típica de camundongos requer uma única imagem, pois a semeadura é geralmente uniforme. Nos casos com um ou mais camundongos brilhantes, os camundongos podem ser removidos e uma aquisição repetida pode ser feita para capturar melhor os sinais de camundongos fracos.
10. Após a imagem de bioluminescência, altere as configurações do IVIS para preparar a imagem de epifluorescência e faça varreduras de fluorescência.
    1. No Assistente de Imagem, selecione Fluorescência > Par filtrado com Epi-Iluminação. Na próxima tela, selecione as sondas a serem visualizadas, como Cy5.5. Selecione o assunto da imagem e o campo de visão. O scanner IVIS agora está configurado para imagens de fluorescência das sondas selecionadas na tela anterior.
11. Tire uma imagem usando configurações de exposição automática com um limite mínimo de sinal de 6.000 contagens. A imagem de fluorescência Cy5.5 visualiza a localização de MN-anti-miR10b. A exposição automática irá captar uma imagem com uma duração de exposição calculada com base no sinal mais brilhante em vista até à duração máxima definida pelo utilizador de 5 min.
    NOTA: A imagem de fluorescência raramente leva mais de 1 min de exposição, mesmo em camundongos injetados com PBS de controle. Uma única imagem é sempre suficiente, pois o desvio de sinal entre os camundongos tratados é pequeno.
12. Remova o mouse do IVIS após a imagem. Monitore até que esteja totalmente recuperado da anestesia e ambulatório.

6. Ressonância magnética in vivo

NOTA: A imagem de RM é realizada antes e 24 h após a injeção de nanopartículas e pode ser realizada nos mesmos animais que passam por imagens ópticas e de bioluminescência.

1. Anestesiar o rato em uma caixa de indução sob 2%-4% de isoflurano para indução e 1,5%-2% para manutenção com uma taxa de fluxo de 1,5 L/min. Uma vez anestesiado, coloque o mouse de bruços na cama de ressonância magnética em cima do balão de monitoramento respiratório. Encaixe o cone do nariz confortavelmente no focinho para aplicar anestesia durante a imagem e aplique pomada oftálmica para os olhos.
2. Imobilize e posicione a cabeça para escaneamento usando uma barra de mordida e barras auriculares.
3. Instale a sonda de temperatura retal lubrificada e certifique-se de que o monitoramento da respiração e da temperatura esteja funcionando. Posicione a bobina do cérebro do mouse sobre a cabeça, encaixando os pinos na cama do mouse nos orifícios da bobina e prenda a bobina no lugar para reduzir o movimento durante a digitalização.
4. Coloque uma pequena almofada de circulação de água morna sobre a parte superior do mouse para manter a temperatura corporal enquanto anestesiado. Tome cuidado para permitir alguma distância entre a bobina e a manta de aquecimento para limitar a distorção da imagem por interferência de água.
5. Mova o mouse e a mesa de imagem para a posição de digitalização.
6. Ajuste e combine as bobinas de ressonância magnética iniciando a etapa de configuração do Wobble no software de aquisição. No final do serviço da ressonância magnética, use os botões de sintonia e fósforo na bobina para garantir que o traço esteja centralizado (sintonia) e o mais profundo possível (correspondência).
7. Adquira uma varredura localizadora de três planos e ajuste o leito de imagem para posicionar o cérebro no isocentro do ímã, se necessário.
8. Adquira varreduras ponderadas 2D T₂ para detectar o agente injetado no tumor com os seguintes parâmetros: tempo de repetição (TR) = 2500 ms, tempo de eco (TE) = 25 ms, campo de visão (FOV) 20 x 20 mm, 18 cortes coronais, intervalo de corte de 0,2 mm, resolução no plano de 150 x 150 μm, espessura de corte de 0,5 mm.
9. Adquira um mapa B0 de todo o cérebro para calcular um calço localizado usando o utilitário Mapshim. Em seguida, use imagens ponderadas 3D T₂ para visualizar as nanopartículas com TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 mm, resolução isotrópica de 100 μm.
10. Adquira o mapa T₂^* para obter mais imagens de nanopartículas usando a imagem ponderada 2D T₂ como referência para a varredura de posição sobre o tumor. Use TR = 800 ms, TE = 3,5 ms. FOV 20 x 20 mm, 5 cortes coronais, sem folga entre cortes. Resolução no plano 100 μm no plano. Adquira 10 imagens de eco positivas com espaçamento de tempo de eco de 5 ms.
11. Monitore a respiração e a temperatura corporal ao longo das sequências de imagem e ajuste o isoflurano e a temperatura da água, se necessário.
12. Após a imagem, remova o mouse do scanner de ressonância magnética e coloque-o em uma gaiola de recuperação aquecida. Monitore o mouse até que ele esteja totalmente recuperado da anestesia e do ambulatório.

7. Bioluminescência ex vivo e imagem de fluorescência

1. Realize imagens de bioluminescência e fluorescência ex vivo no IVIS, semelhante à imagem in vivo . Execute as etapas de inicialização e configuração de varredura do IVIS conforme descrito acima.
2. No ponto final experimental, pesar o camundongo e calcular o volume de D-luciferina a administrar para uma dose de 150 mg / kg. Injete a dose de D-luciferina e realize imagens ao vivo 10 minutos após a injeção, conforme descrito anteriormente.
3. Após a bioluminescência in vivo final e a imagem de fluorescência, eutanasiar rapidamente o camundongo por luxação cervical enquanto ainda estiver sob anestesia, dissecar o camundongo e coletar os principais órgãos, incluindo o cérebro, em uma placa de Petri.
4. Coloque a placa de Petri com órgãos excisados no scanner IVIS e obtenha imagens dos órgãos com as modalidades de bioluminescência e fluorescência usando as mesmas configurações de aquisição da imagem in vivo .
5. Congele rapidamente todos os órgãos necessários para uma análise mais aprofundada na OCT, baixando lentamente o criomold com a amostra na OCT em uma poça rasa de nitrogênio líquido com uma pinça longa até que a OCT fique completamente branca. Não permita que o nitrogênio líquido toque na OCT líquida ou abaixe o mofo muito rapidamente, pois ocorrerá o borbulhamento da OCT. Armazene amostras congeladas a -80 °C.
6. Armazene o cérebro contendo o tumor na OCT e congele rapidamente para criossecção. Conservar a -80 °C até ser necessário para análise.

8. Microscopia de fluorescência

1. Preparar o criostato para a criossecção. Defina as temperaturas da câmara e da cabeça da amostra entre -15 °C e -20 °C.
2. Retire o cérebro congelado rapidamente em OCT do armazenamento de -80 ° C e coloque-o dentro da câmara de criostato. Deixar aquecer as amostras até à temperatura da câmara (-20 °C) antes de seccionar.
3. Usando uma navalha de um único gume, corte o cérebro coronalmente no local da injeção. Isso geralmente é visível como uma covinha na superfície do cérebro. Monte a amostra no disco de amostra usando uma pequena quantidade de OCT para posicionar o lado cortado do cérebro a ser seccionado. Aplique ampla pressão com o peso resfriado dentro da câmara para garantir a montagem estável da amostra.
4. Mova a amostra montada e o disco de amostra para a cabeça da amostra em preparação para o seccionamento. Apare o tecido até a profundidade desejada fazendo cortes de 20 μm, ajustando o ângulo da amostra para seccionar o tecido o mais próximo possível do nível do tecido.
5. Uma vez atingida a profundidade desejada do tecido, ajuste o criostato para obter seções de 5 a 7 μm da amostra. Monte as seções em lâminas de vidro pré-rotuladas com descritores como ID do mouse, tecido seccionado e número da lâmina, abaixando rapidamente o lado carregado da lâmina do microscópio na seção.
6. Faça paraformaldeído fresco a 4% (PFA). Mergulhe a lâmina com tecido na solução de PFA por 15 min para fixar o tecido. Enxágue a lâmina com DPBS 3x após a fixação.
7. À seção de tecido agora fixada na lâmina de vidro, adicione uma gota de 40 μL de meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que cora os núcleos das células. Coloque cuidadosamente uma lamínula de vidro de 24 mm x 50 mm em cima da mídia de montagem e certifique-se de que todo o tecido foi envolto na mídia de montagem.
8. Visualize o tecido usando DAPI (emissão (em) a 359 nm, excitação (ex) a 457 nm) e microscopia de fluorescência Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm).

Resultados

O MN-anti-miR10b foi sintetizado e caracterizado, conforme descrito anteriormente¹¹. A microscopia eletrônica de transmissão de MN-anti-miR10b mostra a morfologia e polidispersidade da plataforma nano (Figura 1B). Esta plataforma nano tem um tamanho médio de 25,12 ± 0,34 nm com um potencial zeta de 13,18 ± 1,47 mV (Figura 1C, D). Nesses estudos, camundongos atímicos...

Discussão

Várias etapas críticas nos diferentes métodos de validação do acúmulo das nanopartículas através do BBB podem ser decisivas para o sucesso do protocolo. Começando com a implantação ortotópica das células GBM, é importante garantir que as linhas de sutura do crânio sejam visíveis após a secagem do osso; Isso ajuda na colocação precisa das células tumorais. Para perfurar o crânio, é melhor aplicar uma leve pressão no local da broca e começar a perfurar para causar u...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery