Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

요약

혈액-뇌 장벽은 치료법이 없는 질병인 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 중요한 장애물입니다. 여기에서, 우리는 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양에 축적될 수 있는 in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform을 보고합니다.

초록

다형 교모세포종(GBM)은 치료법이 없는 원발성 뇌 악성 종양 중 가장 흔하고 공격적인 형태입니다. 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)은 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 있어 중요한 장애물입니다. 여기에 보고된 것은 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양 영역에 축적되어 페이로드를 전달할 수 있는 이미지 유도 산화철 기반 치료 전달 나노 플랫폼입니다. 이 25nm 나노 플랫폼은 Cy5.5 형광 염료로 표지되고 안티센스 올리고뉴클레오티드를 페이로드로 포함하는 가교 결합된 덱스트란 코팅 산화철 나노입자로 구성됩니다. 자성 산화철 코어는 생체 내 자기 공명 이미징을 통해 나노 입자를 추적할 수 있으며, Cy5.5 염료는 광학 이미징으로 추적할 수 있습니다. 이 보고서는 정맥 주사 후 orthotopically 이식된 교모세포종 종양에서 이 나노입자 플랫폼(MN-anti-miR10b라고 함)의 축적 모니터링에 대해 자세히 설명합니다. 또한 RNA 치료제의 임상으로의 번역을 방해하는 문제인 RNA 올리고뉴클레오티드의 생체 내 전달에 대한 통찰력을 제공합니다.

서문

다형성 교모세포종(GBM)은 사실상 치료법이 없는 최고 등급의 성상세포종입니다. 매년 약 15,000명이 교모세포종 진단을 받고 있으며, 평균 생존 기간은 약 15개월, 5년 생존율은 ^5%입니다1. 지난 수십 년 동안 치료 옵션을 발전시키기 위한 여러 노력에도 불구하고 예후가 미미하게 개선되었습니다. 현재 교모세포종에 대한 치료 표준은 가능한 경우 최대한의 외과적 절제술을 시행한 후 방사선 요법과 화학요법을 시행하는 것이다². 선택된 화학 요법인 테모졸로마이드(TMZ)는 현저한 임상적 효능을 보여주는 것으로 밝혀진 교모세포종에 대한 최신 치료법이었습니다. 그러나 교모세포종 종양의 최소 50%는 TMZ 내성을 보인다³. 이러한 엄격한 치료 요법에도 불구하고 개선된 교모세포종 치료에 대한 임상적 필요성은 여전히 상당합니다.

교모세포종(GBM) 및 기타 뇌 관련 질환에 대한 치료제 개발은 혈액뇌장벽(BBB)의 선택적인 특성으로 인해 크게 방해받고 있습니다. BBB는 내피세포(endothelial cell), 주위세포(pericyte), 성상세포(astrocyte....

프로토콜

동물을 대상으로 하는 모든 절차는 Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았습니다. 암컷 외래교배된 흉선성 누드 마우스는 생후 7주에 Jackson Labs(균주 #007850)에서 구입하고 착상 수술 전에 1주일 동안 적응하도록 허용했습니다. 마우스는 이식 당시 약 21-25g이었습니다. 반딧불이 루시페라아제를 발현하는 U251 세포는 Ana deCarvalho¹² 박사에 의해 생성되고 제공되었습니다.

1. 세포 배양 및 이식 준비

1. D-포도당, L-글루타민 및 피루브산나트륨을 함유하고 37°C에서 5% CO₂로 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)의 루시페라아제 표지된 인간 교모세포종 세포, U251 배양.
2. 세포가 70% 밀도에 도달하면 37°C에서 1-2분 동안 0.25% 트립신/EDTA로 트립신화합니다. T-75 플라스크의 경우 2-4mL, T-17....

토론

BBB에 걸쳐 나노 입자의 축적을 검증하는 다양한 방법에 걸친 몇 가지 중요한 단계는 프로토콜의 성공에 결정적인 역할을 할 수 있습니다. 교모세포세포의 정형외피(orthotopic) 이식을 시작으로, 뼈를 건조시킨 후 두개골의 봉합선이 보이도록 하는 것이 중요합니다. 이는 종양 세포의 정확한 배치에 도움이 됩니다. 두개골을 뚫으려면 드릴 부위에 가벼운 압력을 가하고 뼈에.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery