Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke ist eine große Hürde bei der Bereitstellung von Therapien für das Glioblastom, eine Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Hier berichten wir über eine in vivo bildgesteuerte therapeutische Nanoplattform für Eisenoxid, die diese physiologische Barriere aufgrund ihrer Größe umgehen und sich im Tumor anreichern kann.

Zusammenfassung

Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist die häufigste und aggressivste Form der primären Malignität des Gehirns, für die es keine Heilung gibt. Die Blut-Hirn-Schranke ist eine bedeutende Hürde bei der Verabreichung von Therapien für GBM. Hier wird über eine bildgeführte, auf Eisenoxid basierende therapeutische Verabreichungs-Nanoplattform berichtet, die in der Lage ist, diese physiologische Barriere aufgrund ihrer Größe zu umgehen und sich in der Tumorregion anzureichern, um ihre Nutzlast zu liefern. Diese 25-nm-Nanoplattform besteht aus vernetzten, dextranbeschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln, die mit dem Cy5.5-Fluoreszenzfarbstoff markiert sind und Antisense-Oligonukleotid als Nutzlast enthalten. Der magnetische Eisenoxidkern ermöglicht die Verfolgung der Nanopartikel durch in vivo Magnetresonanztomographie, während der Cy5.5-Farbstoff die Verfolgung durch optische Bildgebung ermöglicht. In diesem Bericht wird die Überwachung der Akkumulation dieser Nanopartikelplattform (als MN-anti-miR10b bezeichnet) in orthotopisch implantierten Glioblastom-Tumoren nach intravenöser Injektion beschrieben. Darüber hinaus bietet es Einblicke in die In-vivo-Verabreichung von RNA-Oligonukleotiden, ein Problem, das die Translation von RNA-Therapeutika in die Klinik behindert hat.

Einleitung

Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der höchste Grad des Astrozytoms, für das es praktisch keine Heilung gibt. Jährlich wird bei etwa 15.000 Menschen ein Glioblastom diagnostiziert, was ein düsteres medianes Überleben von etwa 15 Monaten und eine 5-Jahres-Überlebensrate von 5 %¹ hat. In den letzten Jahrzehnten hat sich die Prognose trotz mehrfacher Bemühungen, die Therapieoptionen voranzutreiben, geringfügig verbessert. Der derzeitige Behandlungsstandard für GBM umfasst die maximale chirurgische Resektion, wenn möglich, gefolgt von Strahlentherapie und Chemotherapie². Temozolomid (TMZ), die Chemotherapie der Wahl, war die jüngste Therapie für Glioblastome, bei denen eine bemerkenswerte klinische Wirksamkeit entdeckt wurde. mindestens 50% der GBM-Tumoren weisen jedoch eine TMZ-Resistenz^{auf 3}. Trotz dieses rigorosen Therapieschemas besteht nach wie vor ein erheblicher klinischer Bedarf an einer verbesserten Glioblastomtherapie.

Die Entwicklung von Therapeutika für GBM und andere hirnbedingte Erkrankungen wird durch die selektive Natur der Blut-Hirn-Schranke (BHS) erheblich behindert. Die BHS ist eine physiologische Barriere, die aus Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten-Füßen besteht und die semipermeable Membran zwischen dem Kreislaufsystem und dem Gehirn bildet und den freien Durchgang von Molekülen und Zellen in das Gehirn einschränkt⁴. Obwohl die BHS in der normalen Physiologie schützend und für die Homöostase des Gehirns von entscheidender Bedeutung ist, verhindert sie, dass viele Therapeutika das Gehirn erreichen, was die Behandlung von GBM erschwert. Die Bemühungen, die Verabreichung von Therapeutika an GBM zu verbessern, haben zur Entwicklung von Nanopartikel-basierten Verabreichungsvehikeln, zur Verbesserung der gezielten Ultraschallverabreichung von Arzneimitteln und zur rezeptorvermittelten Verabreichung von Arzneimitteln geführt ^5,6.

Nanopartikel haben sich zu einem vielversprechenden Medium für die Entwicklung von Therapeutika für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs, entwickelt. Die Anwendung von Nanopartikeln für bildgebende und therapeutische Zwecke bei GBM wurde unter Verwendung verschiedener Nanopartikelkonstrukte versucht ^7,8. Mit dem Schwerpunkt auf der Verabreichung von Medikamenten an GBM in Verbindung mit der In-vivo-Bildgebung der Verabreichung verwendet der vorgeschlagene Ansatz magnetische Nanopartikel (MN), die aus einem Eisenoxidkern bestehen und zur Stabilität mit Dextran bedeckt sind. Die magnetischen Eigenschaften dieser Nanopartikel ermöglichen ihre Detektion durch Magnetresonanztomographie (MR), während eine einfache Konjugationschemie an die aminierte Dextran-Beschichtung die Konjugation von therapeutischen Einheiten wie RNA-Molekülen, zusätzlichen Zieleinheiten oder bildgebenden Einheiten (wie dem optischen Farbstoff Cy5.5 im Nahinfrarot) ^{ermöglicht9,10}. Zusätzlich zu den Bildgebungsmöglichkeiten ist die Nanoplattform in der Lage, die Halbwertszeit von RNA-Therapeutika zu verlängern, indem sie das Oligonukleotid vor endogenen Nukleasen schützt und so die therapeutische Verabreichung verbessert. Hier wird die Anwendung dieser Nanoplattform für die in vivo Verabreichung von therapeutischen Oligonukleotiden (als MN-anti-miR10b bezeichnet) an GBM vorgestellt, die durch in vivo Bildgebung überwacht wird. Zuvor wurde die Fähigkeit dieser Nanoplattform zur Akkumulation in GBM-Zellen in vitro nachgewiesen, was zu einem erheblichen Verlust der Lebensfähigkeit von Tumorzellen führte¹¹. Vor der Durchführung therapeutischer In-vivo-Studien ist es notwendig, die In-vivo-Verabreichung dieser Nanoplattform an GBM-Tumoren in Tiermodellen zu demonstrieren. Um dies zu erreichen, wurden orthotope GBM-Tiermodelle erstellt und eine intravenöse Verabreichung des Konstrukts mit anschließender In-vivo-Bildgebung durchgeführt. Im Folgenden sind die Protokolle dieser Studien aufgeführt, die eine Akkumulation in der Tumorregion zeigen, die durch in vivo Bildgebung und ex vivo Mikroskopie bestätigt wurde.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiere beteiligt sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University genehmigt. Weibliche, ausgezüchtete athyme Nacktmäuse wurden im Alter von 7 Wochen von Jackson Labs (Stamm #007850) gekauft und durften sich vor der Implantationsoperation 1 Woche lang akklimatisieren. Die Mäuse waren zum Zeitpunkt der Implantation etwa 21-25 g groß. U251-Zellen, die Glühwürmchen-Luciferase exprimieren, wurden von Dr. Ana deCarvalho¹² erzeugt und zur Verfügung gestellt.

1. Zellkultur und Vorbereitung für die Implantation

1. Kultur von Luziferase-markierten, humanen Glioblastomzellen, U251 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das D-Glucose, L-Glutamin und Natriumpyruvat enthält, und ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C mit 5 % CO₂.
2. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreicht haben, trypsinisieren Sie mit 0,25 % Trypsin/EDTA für 1-2 min bei 37 °C. Verwenden Sie 2-4 mL für einen T-75-Kolben oder 4-6 mL für einen T-175-Kolben.
3. Nachdem sich die Zellen aus dem Kolben gelöst haben, wird die Reaktion mit einem Verhältnis von 2:1 aus supplementiertem DMEM gestillt und durch Pipettieren vorsichtig gemischt, um die Zellen in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min.
4. Den Überstand vorsichtig aspirieren und das Zellpellet in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung der Trypanblau-Färbung, um tote Zellen auszuschließen und die Gesamtzahl der lebenden Zellen zu berechnen. Pelletieren Sie die Zellen erneut, wie oben beschrieben.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet auf eine Konzentration von 1 x 10⁸ Zellen/ml in PBS und lagern Sie die Zellsuspension auf Eis für die intrakranielle Implantation.

2. Freihändige orthotope Tumorimplantation

HINWEIS: Dieses Protokoll ist eine Adaption von Irtenkauf et al. (Dr. Ana deCarvalhos Verfahren; Henry Ford Health Hermelin Hirntumorzentrum)¹². Alle Schritte sollten in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sicherheit sowohl für die Probanden als auch für die Forscher zu gewährleisten. Die Freihandimplantationsmethode ermöglicht ein schnelleres Verfahren, um größere Probengrößen zu erreichen und gleichzeitig die Qualität der intrakraniellen Implantation zu erhalten. Alternativ kann eine stereotaktische Vorrichtung verwendet werden, um den Tumor an den gleichen Koordinaten zu implantieren, die unten beschrieben werden.

1. Wiegen Sie die nackte, athyme Maus und verabreichen Sie eine Anästhesielösung aus Ketamin/Xylazin (100 mg/kg/10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion mit einer 28-G-Spritze. Legen Sie die Maus in einen Aufwachkäfig auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur zu halten. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex überprüfen.
2. Tragen Sie eine Augensalbe für die Augen auf, verabreichen Sie Ketoprofen (5 mg/kg) subkutan mit einer 28-G-Spritze und geben Sie identifizierende Ohrstanzen.
3. Sterilisieren Sie die Operationsstelle oben am Kopf mit 70% Ethanol, gefolgt von einem Betadin-Peeling und wiederholen Sie dies 3x. Machen Sie dann einen 5-7 mm großen Schnitt mit einer kleinen chirurgischen Schere rechts von der Mittellinie des Kopfes und ziehen Sie die Haut mit einer feinen Pinzette zurück, um den Schädel und die Nahtlinien des Schädels freizulegen.
4. Schrubben Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen, um das Periost zu entfernen und den Zugang zum Knochen zu ermöglichen. Tragen Sie eine Lösung aus 3% Wasserstoffperoxid mit einem neuen Wattestäbchen auf, um den Knochen zu trocknen. Wischen Sie mit einem neuen Wattestäbchen überschüssiges Wasserstoffperoxid und eventuell entstehenden Schaum ab. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x, bis das Bregma am Schädel sichtbar ist und der Knochen ausreichend trocken zum Bohren ist. Ein ausreichend trockener Schädel hat stark aufgehellte Nahtlinien und eine reduzierte Rötung gegenüber dem anfänglichen Erscheinungsbild.
5. In Bezug auf das Bregma -2,5 mm medial/lateral und -1 mm anterior/posterior mit einem Lineal messen und die Bohrstelle mit einem Marker markieren. Messen Sie vor dem Bohren erneut, um sicherzustellen, dass sich die Markierung in der richtigen Position befindet.
6. Nehmen Sie einen elektrischen mikrochirurgischen Bohrer (11.000 U/min) mit einem 0,5-mm-Bohrer und bohren Sie vorsichtig ein Loch in den Schädel, wo es zuvor markiert wurde. Nehmen Sie Blut oder Flüssigkeit, die sich an der Bohrstelle ansammeln können, mit einem frischen Wattestäbchen auf.
7. Bereiten Sie eine 33-G-Mikroliterspritze mit einer Nadelhülse auf eine freiliegende Nadellänge von 3 mm vor. Ziehen Sie 5 μl der zuvor vorbereiteten 1 x 10⁸ Zellen/ml-Zellsuspension nach kurzem Resuspendieren mit einer Pipette auf und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Injektionslösung befinden. Wischen Sie überschüssige Zellsuspension, die an der Außenseite der Nadel und der Nadelhülse verbleibt, vorsichtig mit einem 70%igen Isopropanoltuch ab.
8. Führen Sie die Nadel senkrecht in die Bohrstelle ein, bis die Nadelhülse das weitere Einführen der Nadel stoppt. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig ca. 0,5 mm zurück, um Platz für die Ansammlung der injizierten Zellen zu schaffen.
9. Injizieren Sie die Zellsuspension langsam über einen Zeitraum von 1 min. Sobald das volle Volumen injiziert wurde, halten Sie die Nadel eine weitere Minute lang in der Tiefe, um den Ausfluss der Injektionslösung zu reduzieren. Ziehen Sie dann die Nadel vorsichtig zurück.
10. Wischen Sie mit einem sauberen Wattestäbchen die Flüssigkeit ab, die sich an der Injektionsstelle ansammelt, und tragen Sie dann Knochenwachs auf, um das Loch zu verschließen.
11. Verschließen Sie den Schnitt mit einer tierärztlichen Bindung und lassen Sie ihn trocknen. Tragen Sie mit einem sauberen Wattestäbchen topisches Lidocain als Analgetikum auf.
12. Überwachen Sie die Maus, bis sie sich vollständig erholt und ambulant ist. Verabreichen Sie Ketoprofen (5 mg/kg) 2 Tage nach der Implantation subkutan zur Schmerzbehandlung.

3. Synthese von Nanopartikel-Plattformen

1. Synthetisieren und konjugieren Sie die Nanopartikel mit Cy5.5 und Oligonukleotid (anti-miR10b), wie zuvor beschrieben¹¹.

4. MN-anti-miR10b-Verabreichung

HINWEIS: In dieser Studie wurden die Injektionen einmal pro Woche für 6 Wochen ab 7 Tagen nach der Implantation durchgeführt, aber das gleiche Protokoll kann für verschiedene Injektionshäufigkeiten verwendet werden.

1. Wiegen Sie die Maus und berechnen Sie das Volumen von MN-anti-miR10b, das der Maus verabreicht werden soll. Die Dosen von MN-anti-miR10b betragen 20 mg Fe/kg in murinen GBM-Modellen. Zum Beispiel erhält eine 20-g-Maus eine 80-μl-Dosis von 5 mg Fe/ml MN-anti-miR10b. Kontrollmäuse erhalten eine gleiche Menge PBS, die diesem Dosierungsschema entspricht.
2. Bereiten Sie eine 28-G-Spritze mit der Dosis MN-anti-miR10b vor und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Injektionslösung befinden.
3. Anästhesieren Sie die Maus unter 2 % -4 % Isofluran für die Induktion und 1,5 %-2 % für die Wartung mit einer Flussrate von 1,5 l/min in einer Induktionsbox. Bewegen Sie die Maus auf einen Nasenkegel und verabreichen Sie die Narkose weiter. Überprüfen Sie die Narkosetiefe und tragen Sie Tierarztsalbe auf.
4. Sterilisieren Sie den Schwanz mit einem 70%igen Isopropanoltuch und lassen Sie überschüssigen Alkohol trocknen.
5. Drehe den Schwanz, um die seitlichen Schwanzvenen an der Spitze des Schwanzes zu positionieren. Zielen Sie dann auf die Vene, führen Sie die Nadel in den Schwanz ein und stellen Sie ein Vakuum her, indem Sie den Kolben zurückziehen.
6. Führen Sie die Nadel ein, bis Blut in die Spritze eindringt, was auf einen erfolgreichen Eintritt in die Vene hinweist.
7. Injizieren Sie langsam MN-anti-miR10b und ziehen Sie die Nadel nach vollständiger Abgabe zurück. Üben Sie mit Gaze Druck auf die Injektionsstelle aus, bis die Blutung aufhört.
8. Entfernen Sie die Maus aus dem Nasenkonus. Überwachen Sie die Maus, bis sie sich vollständig erholt und ambulant ist.
   HINWEIS: Die Bolusverabreichung von Nanopartikeln kann Atemnot verursachen. Überwachen Sie die Maus sorgfältig und wenden Sie sofort leichte Herzdruckmassagen an, wenn Anzeichen von Atemnot auftreten.

5. In-vivo-Biolumineszenz - und Fluoreszenzbildgebung

HINWEIS: In-vivo-Biolumineszenz - und Fluoreszenzbildgebung werden im In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) vor und 24 Stunden nach der Injektion des Nanopartikels durchgeführt.

1. Bereiten Sie steril filtriertes D-Luciferin in einer Konzentration von 30 mg/ml in PBS ohne Mg²⁺ und Ca²⁺ vor.
2. Öffnen Sie die IVIS-Betriebssoftware und beginnen Sie mit der Initialisierung, um das Gerät vorzubereiten. Wählen Sie während der Initialisierung des Systems einen Ordner zum Speichern von Bildern aus, indem Sie Erfassung > Automatisches Speichern in auswählen, und definieren Sie den Ordner für die zu speichernden Dateien.
3. Wiegen Sie die Maus zu den Zeitpunkten der Bildgebung und berechnen Sie das Volumen von D-Luciferin, das für eine Dosierung von 150 mg/kg verabreicht werden soll. Bereiten Sie eine 28G-Spritze mit dem Volumen vor und schützen Sie die Lösung vor direktem Licht. Diese Studie umfasste eine Bildgebung 2 Tage nach der Implantation, um die Aussaat zu bestätigen, und eine wöchentliche Bildgebung, die am Tag 7 nach der Implantation unmittelbar vor den wöchentlichen Behandlungen begann.
4. Anästhesieren Sie die Maus unter 2 % -4 % Isofluran für die Induktion und 1,5 %-2 % für die Wartung mit einer Flussrate von 1,5 l/min in einer Induktionskammer. Nach der Narkose die Maus vorsichtig abwischen, um eine weitere Verletzung der Operationsstelle zu vermeiden, und die Dosis von D-Luciferin intraperitoneal injizieren. Lassen Sie die Maus sich erholen und warten Sie 10 Minuten vor der Bildgebung, damit sich das Biolumineszenzsignal entwickeln und stabilisieren kann.
5. Während sich das Biolumineszenzsignal entwickelt, bereiten Sie den IVIS-Scanner für die Biolumineszenzbildgebung vor. Legen Sie die schwarze Matte mit niedriger Fluoreszenz auf den Bildgebungstisch und konfigurieren Sie das Nasenkegel-Array für die Anzahl der abzubildenden Motive.
6. Klicken Sie in der Software auf Imaging Wizard. Wählen Sie Biolumineszenz-Bildgebung und dann Filter öffnen aus. Wählen Sie auf dem nächsten Bildschirm Bildgebungsmotiv und Sichtfeld aus. Das IVIS ist nun für die Biolumineszenz-Bildgebung ausgelegt.
7. Beginnen Sie 3 Minuten vor der Bildgebung mit der Grundierung der Induktionsbox, indem Sie das Isofluran/Sauerstoff-Gemisch in die Box füllen lassen. 2 Minuten vor der Bildgebung werden die Mäuse zur Anästhesie in die Induktionsbox gelegt.
8. Bewegen Sie die Mäuse nach der Betäubung zur Bildgebung aus der Induktionsbox in die Infusion und legen Sie sie in Bauchlage. Bieten Sie während der Bildgebung eine Erhaltungsanästhesie mit 2 % Isofluran an.
9. Nachdem die Mäuse in den IVIS-Scanner eingesetzt wurden, klicken Sie auf Sequenz erfassen. Nehmen Sie ein Bild mit den Einstellungen für die automatische Belichtung mit einem Signalschwellenwert von mindestens 3.000 Zählungen auf. Die Biolumineszenz-Bildgebung visualisiert die Lokalisation von Luciferase-markierten U251-Glioblastomzellen. Die automatische Belichtung nimmt ein Bild mit einer Belichtungsdauer auf, die auf der Grundlage des hellsten sichtbaren Signals bis zur benutzerdefinierten maximalen Länge von 5 Minuten berechnet wird.
   HINWEIS: Ein typischer Käfig mit Mäusen erfordert ein einzelnes Bild, da die Aussaat im Allgemeinen gleichmäßig ist. In Fällen mit einer oder mehreren hellen Mäusen können Mäuse entfernt werden, und eine erneute Erfassung kann durchgeführt werden, um Signale von schwachen Mäusen besser zu erfassen.
10. Ändern Sie nach der Biolumineszenzbildgebung die IVIS-Einstellungen, um die Epifluoreszenzbildgebung vorzubereiten und Fluoreszenzscans durchzuführen.
    1. Wählen Sie im Bildgebungsassistenten Fluoreszenz > gefiltertes Paar mit Epi-Illumination aus. Wählen Sie im nächsten Bildschirm die Sonden aus, die abgebildet werden sollen, z. B. Cy5.5. Wählen Sie das Bildmotiv und das Sichtfeld aus. Der IVIS-Scanner ist nun für die Fluoreszenzbildgebung der im vorherigen Bildschirm ausgewählten Sonden eingestellt.
11. Nehmen Sie ein Bild mit den Einstellungen für die automatische Belichtung mit einem Signalschwellenwert von mindestens 6.000 Zählungen auf. Die Cy5.5-Fluoreszenzbildgebung visualisiert die Lokalisation von MN-anti-miR10b. Die automatische Belichtung nimmt ein Bild mit einer Belichtungsdauer auf, die auf der Grundlage des hellsten sichtbaren Signals bis zur benutzerdefinierten maximalen Länge von 5 Minuten berechnet wird.
    HINWEIS: Die Fluoreszenzbildgebung dauert selten länger als 1 Minute Belichtung, selbst bei PBS-injizierten Kontrollmäusen. Ein einzelnes Bild ist immer ausreichend, da die Signalabweichung zwischen den behandelten Mäusen gering ist.
12. Entfernen Sie die Maus nach der Bildgebung aus dem IVIS. Überwachen, bis Sie sich vollständig von der Narkose erholt haben und ambulant sind.

6. In vivo Magnetresonanztomographie

HINWEIS: Die MRT-Bildgebung wird vor und 24 Stunden nach der Nanopartikel-Injektion durchgeführt und kann an denselben Tieren durchgeführt werden, die einer optischen und Biolumineszenz-Bildgebung unterzogen werden.

1. Betäuben Sie die Probandenmaus in einer Induktionsbox unter 2 % bis 4 % Isofluran für die Einleitung und 1,5 % bis 2 % für die Wartung mit einer Flussrate von 1,5 l/min. Legen Sie die Maus nach der Betäubung bäuchlings auf das MRT-Bett auf den Atemüberwachungsballon. Passen Sie den Nasenkegel eng an die Schnauze an, um während der Bildgebung eine Anästhesie durchzuführen und eine Augensalbe aufzutragen.
2. Immobilisieren und positionieren Sie den Kopf für den Scanvorgang mit einer Beißstange und Ohrstangen.
3. Installieren Sie den geschmierten rektalen Temperaturfühler und stellen Sie sicher, dass die Atmungs- und Temperaturüberwachung funktioniert. Positionieren Sie die Mausgehirnspule über dem Kopf, indem Sie die Stifte am Mausbett in die Löcher an der Spule einsetzen und die Spule mit Klebeband festkleben, um die Bewegung während des Scannens zu reduzieren.
4. Legen Sie ein kleines warmes Wasserzirkulationspad über die Oberseite der Maus, um die Körpertemperatur während der Narkose zu halten. Achten Sie darauf, dass zwischen der Spule und der Heizdecke ein gewisser Abstand vorhanden ist, um eine Verzerrung des Bildes durch Wassereinflüsse zu begrenzen.
5. Bringen Sie die Maus und das Bildgebungsbett für den Scanvorgang in Position.
6. Stimmen Sie die MRT-Spulen ab und passen Sie sie an, indem Sie den Wobble-Setup-Schritt in der Erfassungssoftware starten. Verwenden Sie am Serviceende der MRT die Tune- und Match-Knöpfe an der Spule, um sicherzustellen, dass die Kurve zentriert (Tune) und so tief wie möglich (Match) ist.
7. Nehmen Sie einen Lokalisator-Scan mit drei Ebenen auf und passen Sie das Bildgebungsbett an, um das Gehirn bei Bedarf am Isozentrum des Magneten zu positionieren.
8. Erfassen Sie_gewichtete 2D-T2-Scans zum Nachweis des injizierten Wirkstoffs im Tumor mit den folgenden Parametern: Wiederholzeit (TR) = 2500 ms, Echozeit (TE) = 25 ms, Sichtfeld (FOV) 20 x 20 mm, 18 koronale Schnitte, 0,2 mm Schichtabstand, 150 x 150 μm Auflösung in der Ebene, 0,5 mm Schichtdicke.
9. Erwerben Sie eine B0-Karte des gesamten Gehirns, um mit dem Dienstprogramm Mapshim eine lokalisierte Unterlegscheibe zu berechnen. Verwenden Sie dann_gewichtete 3D-T2-Bilder, um die Nanopartikel mit TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 mm, Auflösung 100 μm isotrop zu visualisieren.
10. Erfassen Sie eine T₂^* -Karte für die weitere Bildgebung von Nanopartikeln unter Verwendung des gewichteten 2D-Bildes T₂ als Referenz für den Positionsscan über dem Tumor. Verwendung TR = 800 ms, TE = 3,5 ms. FOV 20 x 20 mm, 5 koronale Scheiben, kein Schichtspalt. Auflösung in der Ebene 100 μm in der Ebene. Erfassen Sie 10 positive Echobilder mit einem Echo-Zeitabstand von 5 ms.
11. Überwachen Sie die Atmung und die Körpertemperatur während der gesamten Bildgebungssequenzen und passen Sie bei Bedarf die Isofluran- und Wassertemperatur an.
12. Nehmen Sie die Maus nach der Bildgebung aus dem MRT-Scanner und legen Sie sie in einen beheizten Auffangkäfig. Überwachen Sie die Maus, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt und ambulant ist.

7. Ex-vivo-Biolumineszenz - und Fluoreszenzbildgebung

1. Führen Sie ex vivo Biolumineszenz- und Fluoreszenzbildgebung im IVIS durch, ähnlich wie bei der in vivo Bildgebung. Führen Sie die IVIS-Initialisierungs- und Scan-Einstellungsschritte wie oben beschrieben durch.
2. Am experimentellen Endpunkt wird die Maus gewogen und das Volumen von D-Luciferin berechnet, das für eine Dosierung von 150 mg/kg verabreicht werden soll. Injizieren Sie die Dosis von D-Luciferin und führen Sie 10 Minuten nach der Injektion eine Live-Bildgebung durch, wie zuvor beschrieben.
3. Nach der abschließenden In-vivo-Biolumineszenz - und Fluoreszenzbildgebung wird die Maus noch unter Narkose schnell durch Gebärmutterhalsdislokation eingeschläfert, die Maus präpariert und die wichtigsten Organe, einschließlich des Gehirns, auf einer Petrischale gesammelt.
4. Platzieren Sie die Petrischale mit den exzidierten Organen in den IVIS-Scanner und bilden Sie die Organe sowohl mit Biolumineszenz- als auch mit Fluoreszenzmodalitäten ab, wobei Sie die gleichen Aufnahmeeinstellungen wie bei der In-vivo-Bildgebung verwenden.
5. Frieren Sie alle Organe, die für die weitere Analyse in der OCT erforderlich sind, im Schockfrost ein, indem Sie den Kryomold mit der Probe in der OCT langsam mit einer langen Pinzette in ein flaches Becken aus flüssigem Stickstoff absenken, bis die OCT vollständig weiß wird. Lassen Sie flüssigen Stickstoff nicht mit flüssigem OCT in Berührung kommen und senken Sie den Schimmel nicht zu schnell ab, da es zu Blasenbildung des OCT kommt. Lagern Sie gefrorene Proben bei -80 °C.
6. Lagern Sie das Gehirn, in dem sich der Tumor befindet, in OCT und Schockfrost für die Kryosektion. Bis zur Analyse bei -80 °C lagern.

8. Fluoreszenzmikroskopie

1. Bereiten Sie den Kryostaten für die Kryosektion vor. Stellen Sie die Temperaturen der Kammer und des Probenkopfes zwischen -15 °C und -20 °C ein.
2. Nehmen Sie das schockgefrostete Gehirn in OCT aus der -80 °C-Lagerung und legen Sie es in die Kryostatenkammer. Lassen Sie die Proben vor dem Schneiden auf Kammertemperatur (-20 °C) erwärmen.
3. Mit einem einschneidigen Rasiermesser das Gehirn an der Injektionsstelle koronal durchtrennen. Dies ist meist als Grübchen auf der Oberfläche des Gehirns sichtbar. Montieren Sie die Probe mit einer kleinen Menge OCT auf die Probenscheibe, um die Schnittseite des Gehirns zu positionieren, die geschnitten werden soll. Üben Sie mit dem gekühlten Gewicht in der Kammer ausreichend Druck aus, um eine stabile Lagerung der Probe zu gewährleisten.
4. Bewegen Sie die eingefasste Probe und die Probenscheibe zur Vorbereitung des Schnitts auf den Probenkopf. Schneiden Sie das Gewebe auf die gewünschte Tiefe, indem Sie 20-μm-Schnitte nehmen und den Winkel der Probe anpassen, um das Gewebe so nah wie möglich an der Höhe des Gewebes zu schneiden.
5. Sobald die gewünschte Gewebetiefe erreicht ist, stellen Sie den Kryostaten so ein, dass 5 - 7 μm große Schnitte der Probe entnommen werden. Montieren Sie die Schnitte auf Objektträgern, die mit Deskriptoren wie Maus-ID, Gewebeschnitt und Objektträgernummer vorbeschriftet sind, indem Sie die geladene Seite des Objektträgers schnell auf den Schnitt absenken.
6. Stellen Sie frische 4% Paraformaldehyd (PFA) her. Tauchen Sie den Objektträger 15 Minuten lang mit Gewebe in die PFA-Lösung, um das Gewebe zu fixieren. Spülen Sie den Objektträger 3x nach der Fixierung mit DPBS aus.
7. Zu dem nun fixierten Gewebeschnitt auf dem Objektträger wird ein 40-μl-Tropfen Einbettmedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegeben, das die Zellkerne färbt. Legen Sie vorsichtig ein 24 mm x 50 mm großes Glasdeckglas auf das Eindeckmedium und stellen Sie sicher, dass das gesamte Gewebe in das Eindeckmedium eingeschlossen ist.
8. Visualisieren Sie das Gewebe mit DAPI (Emission (em) bei 359 nm, Anregung (ex) bei 457 nm) und Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm) Fluoreszenzmikroskopie.

Ergebnisse

MN-anti-miR10b wurde synthetisiert und charakterisiert, wie zuvor beschrieben¹¹. Die Transmissionselektronenmikroskopie von MN-anti-miR10b zeigt die Morphologie und Polydispersität der Nanoplattform (Abbildung 1B). Diese Nanoplattform hat eine durchschnittliche Größe von 25,12 ± 0,34 nm mit einem Zetapotenzial von 13,18 ± 1,47 mV (Abbildung 1C,D). In diesen Studien w...

Diskussion

Mehrere kritische Schritte in den verschiedenen Methoden zur Validierung der Akkumulation der Nanopartikel über die BHS können für den Erfolg des Protokolls entscheidend sein. Beginnend mit der orthotopen Implantation von GBM-Zellen ist es wichtig sicherzustellen, dass die Nahtlinien des Schädels nach dem Trocknen des Knochens sichtbar sind; Dies hilft bei der genauen Platzierung der Tumorzellen. Für das Bohren durch den Schädel üben Sie am besten leichten Druck auf die Bohrstelle...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery