Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Riepilogo

La barriera emato-encefalica è un ostacolo significativo nella somministrazione di terapie per il glioblastoma, una malattia per la quale non esiste una cura. Qui, riportiamo una nano piattaforma terapeutica di ossido di ferro guidata da immagini in vivo che può bypassare questa barriera fisiologica in virtù delle dimensioni e accumularsi nel tumore.

Abstract

Il glioblastoma multiforme (GBM) è la forma più comune e aggressiva di tumore maligno cerebrale primario per il quale non esiste una cura. La barriera emato-encefalica è un ostacolo significativo nella somministrazione di terapie al GBM. Qui è riportata una nanopiattaforma di somministrazione terapeutica guidata da immagini, basata sull'ossido di ferro, in grado di aggirare questa barriera fisiologica in virtù delle dimensioni e di accumularsi nella regione tumorale, trasportando il suo carico utile. Questa nanopiattaforma da 25 nm è costituita da nanoparticelle di ossido di ferro rivestite di destrano reticolato marcate con colorante fluorescente Cy5.5 e contenenti oligonucleotide antisenso come carico utile. Il nucleo magnetico di ossido di ferro consente il tracciamento delle nanoparticelle attraverso la risonanza magnetica in vivo , mentre il colorante Cy5.5 consente il tracciamento mediante imaging ottico. Questo rapporto descrive in dettaglio il monitoraggio dell'accumulo di questa piattaforma di nanoparticelle (denominata MN-anti-miR10b) nei tumori di glioblastoma impiantati ortotopicamente dopo iniezione endovenosa. Inoltre, fornisce informazioni sulla somministrazione in vivo di oligonucleotidi di RNA, un problema che ha ostacolato la traduzione delle terapie a RNA in clinica.

Introduzione

Il glioblastoma multiforme (GBM) è il più alto grado di astrocitoma per il quale non esiste praticamente alcuna cura. Ogni anno a circa 15.000 persone viene diagnosticato un glioblastoma, che ha una sopravvivenza mediana di circa 15 mesi e un tasso di sopravvivenza a 5 anni del 5%¹. Negli ultimi decenni, c'è stato un miglioramento marginale della prognosi nonostante i molteplici sforzi per far progredire le opzioni terapeutiche. L'attuale standard di cura per il GBM include la resezione chirurgica massima, quando possibile, seguita da radioterapia e chemioterapia². La temozolomide (TMZ),....

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Le femmine di topi nudi atimici sono stati acquistati da Jackson Labs (ceppo #007850) a 7 settimane di età e lasciati acclimatare per 1 settimana prima dell'intervento chirurgico di impianto. I topi pesavano circa 21-25 g al momento dell'impianto. Le cellule U251 che esprimono luciferasi lucciola sono state generate e fornite dalla dottoressa Ana deCarvalho¹².

1. Coltura cellulare e preparazione all'impianto

Discussione

Diversi passaggi critici nei diversi metodi di convalida dell'accumulo delle nanoparticelle attraverso la BBB possono essere decisivi per il successo del protocollo. A partire dall'impianto ortotopico di cellule GBM, è importante assicurarsi che le linee di sutura del cranio siano visibili dopo l'asciugatura dell'osso; Questo aiuta nel posizionamento accurato delle cellule tumorali. Per perforare il cranio, è meglio applicare una leggera pressione sul sito di perforazione e iniziare a .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery