神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

要約

血液脳関門は、治療法がない病気である膠芽腫の治療を提供する上で大きなハードルです。ここでは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍に蓄積できる in vivo 画像誘導酸化鉄治療用ナノプラットフォームを報告します。

要約

多形性膠芽腫(GBM)は、治療法がない原発性脳悪性腫瘍の最も一般的で侵攻性の形態です。血液脳関門は、GBMへの治療の提供における大きなハードルです。ここで報告されているのは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍領域に蓄積してペイロードを送達できる、画像誘導酸化鉄ベースの治療送達ナノプラットフォームです。この25 nmナノプラットフォームは、Cy5.5蛍光色素で標識され、ペイロードとしてアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む架橋デキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子で構成されています。磁性酸化鉄コアは 、in vivo 磁気共鳴イメージングによるナノ粒子の追跡を可能にし、Cy5.5色素は光学イメージングによる追跡を可能にします。このレポートでは、静脈内注射後の同所性移植性膠芽腫腫瘍におけるこのナノ粒子プラットフォーム(MN-anti-miR10bと呼ばれる)の蓄積のモニタリングについて詳しく説明します。さらに、RNA治療薬の臨床への翻訳を妨げてきた問題であるRNAオリゴヌクレオチドの in vivo 送達に関する洞察を提供します。

概要

多形性膠芽腫(GBM)は、事実上治療法がない星状細胞腫の最高グレードです。膠芽腫と診断されるのは年間約15,000人で、生存期間の中央値は約15カ月、5年生存率は^5%と悲惨な結果となっています1。過去数十年間、治療の選択肢を前進させるための複数の努力にもかかわらず、予後はわずかに改善されてきました。GBMの現在の標準治療には、可能な場合は最大限の外科的切除が含まれ、その後に放射線療法と化学療法^{が行われます2}。テモゾロミド(TMZ)は、選択された化学療法であり、顕著な臨床効果を示すことが発見された膠芽腫の最新の治療法でした。ただし、GBM腫瘍の少なくとも50%はTMZ抵抗性を示しています³。この厳格な治療レジメンにもかかわらず、改善された膠芽腫治療に対する臨床的ニーズは依然として大きいです。

GBMやその他の脳関連疾患の治療法の開発は、血液脳関門(BBB)の選択的性質によって大幅に妨げられています。BBBは、内皮細胞、周皮細胞、および星状細胞の足端からなる生理学的バリアであり、循環器系と脳との間に半透膜を作り出し、分子と細胞の脳への自由な通過を制限する⁴。BBBは、正常な生理機能を保護し、脳の恒常性維持に重要ですが、多くの....

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。雌の近交系無霊科ヌードマウスをJackson Labs(株#007850)から7週齢で購入し、着床手術の1週間前に順応させました。マウスは移植時に約21〜25gであった。ホタルルシフェラーゼを発現するU251細胞をAna deCarvalho博士によって作製し、提供した¹²。

1. 細胞培養と移植準備

1. D-グルコース、L-グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でルシフェラーゼ標識ヒト膠芽腫細胞U251を培養し、37°Cで10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを5%_CO2で補充します。
2. 細胞が70%のコンフルエント度に達したら、0.25%トリプシン/EDTAで37°Cで1〜2分間トリプシン化します。 T-75フラスコには2〜4mL、T-175フラスコには4〜6mLを使用してください。
3. 細胞がフラスコから分離した後、補充したDMEMを2:1の比率で反応を急冷し、ピペッティングで穏やかに混合して細胞を解離して単一細胞懸濁液にします。細胞を円錐管に移し、300 x ....

ディスカッション

BBBを介したナノ粒子の蓄積を検証するさまざまな方法にわたるいくつかの重要なステップは、プロトコルの成功にとって決定的なものとなり得ます。GBM細胞の同所性移植から始めて、骨を乾燥させた後に頭蓋骨の縫合線が見えるようにすることが重要です。これにより、腫瘍細胞の正確な配置が可能になります。頭蓋骨を穴あけするには、穴あけ部位に軽い圧力を加.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery