神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

要約

血液脳関門は、治療法がない病気である膠芽腫の治療を提供する上で大きなハードルです。ここでは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍に蓄積できる in vivo 画像誘導酸化鉄治療用ナノプラットフォームを報告します。

要約

多形性膠芽腫(GBM)は、治療法がない原発性脳悪性腫瘍の最も一般的で侵攻性の形態です。血液脳関門は、GBMへの治療の提供における大きなハードルです。ここで報告されているのは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍領域に蓄積してペイロードを送達できる、画像誘導酸化鉄ベースの治療送達ナノプラットフォームです。この25 nmナノプラットフォームは、Cy5.5蛍光色素で標識され、ペイロードとしてアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む架橋デキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子で構成されています。磁性酸化鉄コアは 、in vivo 磁気共鳴イメージングによるナノ粒子の追跡を可能にし、Cy5.5色素は光学イメージングによる追跡を可能にします。このレポートでは、静脈内注射後の同所性移植性膠芽腫腫瘍におけるこのナノ粒子プラットフォーム(MN-anti-miR10bと呼ばれる)の蓄積のモニタリングについて詳しく説明します。さらに、RNA治療薬の臨床への翻訳を妨げてきた問題であるRNAオリゴヌクレオチドの in vivo 送達に関する洞察を提供します。

概要

多形性膠芽腫(GBM)は、事実上治療法がない星状細胞腫の最高グレードです。膠芽腫と診断されるのは年間約15,000人で、生存期間の中央値は約15カ月、5年生存率は^5%と悲惨な結果となっています1。過去数十年間、治療の選択肢を前進させるための複数の努力にもかかわらず、予後はわずかに改善されてきました。GBMの現在の標準治療には、可能な場合は最大限の外科的切除が含まれ、その後に放射線療法と化学療法^{が行われます2}。テモゾロミド(TMZ)は、選択された化学療法であり、顕著な臨床効果を示すことが発見された膠芽腫の最新の治療法でした。ただし、GBM腫瘍の少なくとも50%はTMZ抵抗性を示しています³。この厳格な治療レジメンにもかかわらず、改善された膠芽腫治療に対する臨床的ニーズは依然として大きいです。

GBMやその他の脳関連疾患の治療法の開発は、血液脳関門(BBB)の選択的性質によって大幅に妨げられています。BBBは、内皮細胞、周皮細胞、および星状細胞の足端からなる生理学的バリアであり、循環器系と脳との間に半透膜を作り出し、分子と細胞の脳への自由な通過を制限する⁴。BBBは、正常な生理機能を保護し、脳の恒常性維持に重要ですが、多くの治療薬が脳に到達するのを防ぎ、GBMの治療を複雑にします。GBMへの治療薬の送達を強化するための努力は、ナノ粒子ベースの送達手段、集束超音波薬物送達強化、および受容体媒介薬物送達の開発につながっています^5,6。

ナノ粒子は、がんを含む無数の疾患の治療法を開発するための有望な媒体として浮上しています。GBMにおけるイメージングおよび治療目的のためのナノ粒子の適用は、種々のナノ粒子コンストラクト^7,8を用いて試みられてきた。提案されたアプローチは、送達のin vivoイメージングと併せてGBMに薬物を送達することに焦点を当てており、酸化鉄コアで構成され、安定性のためにデキストランで覆われた磁性ナノ粒子(MN)を利用します。これらのナノ粒子の磁気特性は、磁気共鳴(MR)イメージングによる検出を可能にし、一方、アミノ化デキストランコーティングへの単純な結合化学により、RNA分子などの治療部分、追加の標的部分、またはイメージング部分(Cy5.5近赤外光学色素^など)の結合が可能になります^9,10。.イメージング機能に加えて、nanoプラットフォームは、オリゴヌクレオチドを内因性ヌクレアーゼから保護することにより、RNA治療薬の半減期を延長し、治療送達を改善することができます。ここでは、このナノプラットフォームを、治療用オリゴヌクレオチド(MN-抗miR10bと呼ばれる)のGBMへのin vivo送達に応用し、in vivoイメージングでモニタリングする方法を紹介します。以前に、このナノプラットフォームの蓄積能力は、in vitroでGBM細胞で実証され、腫瘍細胞の生存率の大幅な損失を引き起こしました¹¹。治療的なin vivo研究を行う前に、このナノプラットフォームのGBM腫瘍へのin vivo送達を動物モデルで実証する必要があります。これを達成するために、同所性GBM動物モデルを作成し、コンストラクトの静脈内投与を行った後、in vivoイメージングを行いました。ここでは、in vivoイメージングおよびex vivo顕微鏡法によって確認された腫瘍領域への蓄積を示すこれらの研究のプロトコルを概説します。

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。雌の近交系無霊科ヌードマウスをJackson Labs(株#007850)から7週齢で購入し、着床手術の1週間前に順応させました。マウスは移植時に約21〜25gであった。ホタルルシフェラーゼを発現するU251細胞をAna deCarvalho博士によって作製し、提供した¹²。

1. 細胞培養と移植準備

1. D-グルコース、L-グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でルシフェラーゼ標識ヒト膠芽腫細胞U251を培養し、37°Cで10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを5%_CO2で補充します。
2. 細胞が70%のコンフルエント度に達したら、0.25%トリプシン/EDTAで37°Cで1〜2分間トリプシン化します。 T-75フラスコには2〜4mL、T-175フラスコには4〜6mLを使用してください。
3. 細胞がフラスコから分離した後、補充したDMEMを2:1の比率で反応を急冷し、ピペッティングで穏やかに混合して細胞を解離して単一細胞懸濁液にします。細胞を円錐管に移し、300 x g で5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。
4. 上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。トリパンブルー染色を使用して血球計算盤で細胞をカウントし、死んだ細胞を除外し、生細胞の総数を計算します。上記のように、細胞を再度ペレット化します。
5. 細胞ペレットをPBSで1 x 10⁸ 細胞/mLの濃度に再懸濁し、頭蓋内移植のために細胞懸濁液を氷上に保存します。

2.フリーハンドの同所性腫瘍移植術

注:このプロトコルは、Irtenkaufら(Ana deCarvalho博士の手順;ヘンリーフォードヘルスハーメリン脳腫瘍センター)¹²。すべてのステップは、被験者と研究者の両方の安全を確保するために、バイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。フリーハンドの移植法では、頭蓋内移植の品質を維持しながら、より大きなサンプルサイズを達成するための迅速な手順が可能になります。あるいは、脳定位固定装置を使用して、以下に説明するのと同じ座標で腫瘍を移植することができる。

1. ヌードの無気力マウスの体重を量り、ケタミン/キシラジン (100 mg/kg/10mg/kg) の麻酔薬溶液を 28G 注射器で腹腔内注射します。マウスを温熱パッドの上のリカバリーケージに入れて、体温を維持します。ペダル反射を確認して麻酔を確認します。
2. 眼科用眼軟膏を塗布し、ケトプロフェン(5 mg / kg)を28Gシリンジで皮下投与し、耳のパンチを特定します。.
3. 頭頂部の手術部位を70%エタノールで滅菌し、続いてベタジンスクラブで3回繰り返します。次に、頭の正中線の右側にある小さな手術用ハサミで5〜7mmの切開を行い、細い鉗子で皮膚を引っ込めて頭蓋骨と頭蓋骨の縫合線を露出させます。
4. 綿棒で頭蓋骨をこすり洗いして骨膜を取り除き、骨にアクセスできるようにします。新しい綿棒を使用して3%過酸化水素の溶液を塗布し、骨を乾かします。新しい綿棒を使用して、余分な過酸化水素と形成される可能性のある泡を拭き取ります。ブレグマが頭蓋骨に見え、骨が穴あけに十分に乾くまで、この手順を3回繰り返します。十分に乾燥した頭蓋骨は、縫合糸のラインがはっきりと白くなり、最初の外観からの赤みが減少します。
5. ブレグマに対して、定規で-2.5 mmの内側/外側と-1 mmの前後/後部を測定し、マーカーでドリルサイトをマークします。穴を開ける前に再度測定して、マークが正しい位置にあることを確認してください。
6. 0.5mmのドリルバリが付いた電動マイクロサージェリードリル(11,000RPM)を取り、以前にマークされた頭蓋骨に慎重に穴を開けます。ドリルサイトに蓄積する可能性のある血液や体液を、新しい綿棒で吸収します。
7. 33Gマイクロリットルの注射器を準備し、3mmの露出した針の長さに針スリーブを取り付けます。ピペットで短時間再懸濁した後、以前に調製した1 x 10⁸ 細胞/mL細胞懸濁液を5 μL引き出し、注入溶液に気泡がないことを確認します。ニードルとニードルスリーブの外側に残った余分な細胞懸濁液を70%イソプロパノールワイプで慎重に拭き取ります。
8. ニードルスリーブが針のさらなる挿入を停止するまで、針をドリル部位に垂直に挿入します。針を約0.5mm慎重に引っ込めて、注入した細胞が蓄積するスペースを作ります。
9. 細胞懸濁液を1分間かけてゆっくりと注入します。全量が注入されたら、注射液の排出を減らすために、針をさらに深さで保持します。次に、針を慎重に引っ込めます。
10. 清潔な綿棒で、注入部位に溜まった液体を拭き取り、ボーンワックスを塗布して穴を塞ぎます。
11. 切開部を獣医用ボンドで閉じ、乾燥させます。清潔な綿棒で、鎮痛剤として局所リドカインを塗布します。.
12. 完全に回復して歩行できるようになるまでマウスを監視します。ケトプロフェン(5 mg / kg)を移植後2日間皮下投与し、疼痛管理を行います。.

3. ナノ粒子プラットフォーム合成

1. 前述したように、ナノ粒子をCy5.5およびオリゴヌクレオチド(抗miR10b)と合成し、結合させる¹¹。

4. MN-抗miR10b投与

注: この研究では、注射は移植の 7 日後から 6 週間、週に 1 回行われましたが、同じプロトコルをさまざまな注射頻度に使用できます。

1. マウスの体重を量り、マウスに投与するMN-anti-miR10bの量を計算します。MN-抗miR10bの用量は、マウスGBMモデルで20 mg Fe / kgで投与されます。.例えば、20 gのマウスに80 μLの5 mg Fe/mL MN-anti-miR10bを投与します。対照マウスは、この投与計画と一致する同量のPBSを投与されます。
2. MN-anti-miR10bの用量で28Gシリンジを準備し、注射液に気泡がないことを確認します。.
3. 誘導ボックス内で1.5 L / minの流量で、誘導のために2%〜4%のイソフルラン、メンテナンスのために1.5%〜2%でマウスを麻酔します。マウスをノーズコーンに移動し、麻酔を続けます。麻酔の深さを確認し、獣医用軟膏を塗布します。
4. 70%イソプロパノールワイプで尾を滅菌し、余分なアルコールを乾かします。
5. 尾を回転させて、外側尾静脈を尾の上部に配置します。次に、静脈を狙って針を尾部に挿入し、プランジャーを引き戻して真空にします。
6. 血液がシリンジに入るまで針を挿入し、静脈への正常な侵入を示します。
7. MN-anti-miR10bをゆっくりと注入し、完全送達後に針を引っ込めます。出血が止まるまでガーゼで注射部位に圧力をかけます。.
8. マウスをノーズコーンから取り外します。完全に回復して歩行できるようになるまでマウスを監視します。
   注:ナノ粒子のボーラス投与は、呼吸困難を引き起こす可能性があります。マウスを注意深く監視し、呼吸困難の兆候がある場合はすぐに軽い胸骨圧迫を適用してください。

5. in vivo 生物発光および蛍光イメージング

注: In vivo 生物発光および蛍光イメージングは、ナノ粒子が注入される前と注入後24時間後に In vivo イメージングシステム(IVIS)で行われます。

1. 滅菌ろ過されたD-ルシフェリンを30 mg / mLの濃度でPBSに調製し、Mg²⁺ およびCa²⁺を含まない。
2. IVIS操作ソフトウェアを開き、初期化を開始して本機を準備します。システムの初期化中に、[ 取得] > [自動保存先 ] を選択して画像を保存するフォルダーを選択し、ファイルを保存するフォルダーを定義します。
3. イメージングの時点で、マウスの体重を量り、150 mg / kgの投与量で投与するD-ルシフェリンの量を計算します。容量の28Gシリンジを準備し、溶液を直射日光から保護します。この研究では、移植手術の 2 日後に播種を確認するための画像検査と、毎週の治療の直前に移植後 7 日目に毎週の画像検査が開始されました。
4. 誘導チャンバー内で1.5 L / minの流量で、誘導のために2%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔し、メンテナンスのために1.5%〜2%でマウスを麻酔します。麻酔をかけたら、手術部位をさらに傷つけないようにマウスを優しく首筋に切り、D-ルシフェリンの用量を腹腔内に注射します。マウスを回復させ、イメージングする前に10分間待ってから、生物発光シグナルが発生して安定するのを待ちます。
5. 生物発光シグナルが発達している間に、IVISスキャナーを生物発光イメージング用に準備します。黒色の低蛍光マットをイメージングステージに置き、イメージングする被写体の数に合わせてノーズコーンアレイを設定します。
6. ソフトウェアで、[ イメージングウィザード]をクリックします。 「Bioluminescence Imaging 」を選択し、「 Open Filter」を選択します。次の画面で、[イメージング対象] と [視野] を選択します。IVISは現在、生物発光イメージング用に設定されています。
7. イメージングの3分前に、イソフルラン/酸素混合物をボックス内に充填させることにより、誘導ボックスのプライミングを開始します。イメージングの2分前に、マウスを麻酔用の誘導ボックスに入れます。
8. 麻酔をかけたら、マウスを誘導ボックスからIVISに移動してイメージングし、それぞれを腹臥位に寝かせます。イメージング中に2%イソフルランを使用して維持麻酔を提供します。
9. マウスをIVISスキャナーにセットしたら、 Acquire Sequenceをクリックします。自動露出設定を使用して、最小信号しきい値が3,000カウントの画像を撮影します。生物発光イメージングは、ルシフェラーゼ標識U251神経膠芽腫細胞の局在を視覚化します。自動露出は、ユーザーが定義した最大長である 5 分まで、ビュー内の最も明るい信号に基づいて計算された露出長で画像をキャプチャします。
   注:一般的なマウスのケージには、播種が一般的に均一であるため、1つの画像が必要です。1匹以上の明るいマウスを装着した場合、マウスを取り出し、薄暗いマウスからの信号をよりよく捕捉するために、反復捕捉を行うことができる。
10. 生物発光イメージング後、IVIS設定を変更して落射蛍光イメージングを準備し、蛍光スキャンを行います。
    1. イメージングウィザードで、「 蛍光>フィルターペアとエピ照明付き」を選択します。次の画面で、イメージ化するプローブ (Cy5.5 など) を選択します。撮像対象と視野を選択します。これで、IVISスキャナーは、前の画面で選択したプローブの蛍光イメージング用に設定されています。
11. 自動露出設定を使用して、最小信号しきい値が6,000カウントの画像を撮影します。Cy5.5蛍光イメージングは、MN-anti-miR10bの局在を可視化します。自動露出は、ユーザーが定義した最大長である 5 分まで、ビュー内の最も明るい信号に基づいて計算された露出長で画像をキャプチャします。
    注:蛍光イメージングは、対照PBS注入マウスであっても、1分以上の曝露を要することはめったにありません。治療したマウス間のシグナル偏差が小さいため、常に1つの画像で十分です。
12. イメージング後、マウスをIVISから取り外します。麻酔と外来から完全に回復するまで監視します。

6. 生体内 磁気共鳴画像法

注:MRイメージングは、ナノ粒子注入前および24時間後に実施され、光学イメージングおよび生物発光イメージングを受けるのと同じ動物で実施することができる。

1. 導入の場合は 2%-4% イソフルラン、メンテナンスの場合は 1.5% 〜 2% 未満の誘導ボックスで、対象のマウスを麻酔します 1.5 L/分の流量。麻酔をかけたら、マウスをうつ伏せにして、呼吸モニタリングバルーンの上のMRIベッドに置きます。ノーズコーンを鼻にぴったりとフィットさせて、イメージング中に麻酔を行い、眼科用眼軟膏を塗布します。
2. バイトバーとイヤーバーを使用してスキャンするために頭を固定して配置します。
3. 潤滑された直腸温度プローブを取り付け、呼吸と温度監視が機能していることを確認します。マウスベッドのペグをコイルの穴にはめ込んでマウスブレインコイルを頭の上に置き、コイルを所定の位置にテープで固定してスキャン中の動きを減らします。
4. マウスの上部に小さな温水循環パッドを置き、麻酔中に体温を維持します。コイルとヒーティングブランケットの間にある程度の距離を空けて、水の干渉による画像の歪みを制限するように注意してください。
5. マウスとイメージングベッドをスキャンの位置に移動します。
6. MRIコイルの調整とマッチングは、アクイジションソフトウェアでWobbleのセットアップステップを開始して行います。MRIのサービス終了時には、コイルのチューンノブとマッチノブを使用して、トレースが中央に配置され(チューン)、できるだけ深く(一致)ことを確認します。
7. 3平面ローカライザースキャンを取得し、必要に応じてイメージングベッドを調整して、脳を磁石のアイソセンターに配置します。
8. 次のパラメータで腫瘍に注入された薬剤を検出するために、2D T₂ 加重スキャンを取得します:繰り返し時間(TR)= 2500ミリ秒、エコー時間(TE)= 25ミリ秒、視野(FOV)20 x 20 mm、18冠状スライス、0.2 mmスライスギャップ、150 x 150 μm面内分解能、0.5 mmスライス厚さ。
9. 全脳のB0マップを取得し、Mapshimユーティリティを使用してローカライズされたシムを計算します。次に、3D T₂ 強調画像を使用して、TR = 30 ms、TE = 10 ms、FOV 20 x 15 x 12 mm、解像度 100 μm の等方性でナノ粒子を視覚化します。
10. 腫瘍上の位置スキャンへの参照として2D T₂強調画像を使用して、さらなるナノ粒子イメージングのためにT₂^*マップを取得します。TR = 800 ms、TE = 3.5 ms. FOV 20 x 20 mm、5 コロナ スライス、スライス ギャップなしを使用します。平面内の分解能は平面内100μm。5msのエコー時間間隔で10枚のポジティブエコー画像を取得します。
11. イメージングシーケンス全体を通して呼吸と体温をモニタリングし、必要に応じてイソフルランと水温を調整します。
12. イメージング後、マウスをMRIスキャナーから取り外し、加熱されたリカバリーケージに入れます。マウスが麻酔と歩行から完全に回復するまでマウスを監視します。

7. ex vivo 生物発光および蛍光イメージング

1. IVISでは、in vivoイメージングと同様に、ex vivo生物発光および蛍光イメージングを行います。上記のようにIVISの初期化とスキャン設定の手順を実行します。
2. 実験エンドポイントで、マウスの体重を量り、150 mg / kgの投与量で投与するD-ルシフェリンの量を計算します。D-ルシフェリンの用量を注射し、前述のように注射後10分でライブイメージングを行います。
3. 最終的な in vivo 生物発光および蛍光イメージングの後、麻酔下でマウスを子宮頸部脱臼により迅速に安楽死させ、マウスを解剖し、脳を含む主要な臓器をペトリ皿に集めます。
4. 切除された臓器を装着したペトリ皿をIVISスキャナーにセットし、 in vivo イメージングと同じ取得設定を使用して、生物発光モダリティと蛍光モダリティの両方で臓器をイメージングします。
5. OCTでのさらなる分析に必要な臓器を急速凍結するには、OCTで試料を採取したクライオモールドを、長い鉗子で液体窒素の浅いプールにゆっくりと下げ、OCTが完全に白くなるまで加熱します。液体窒素が液体OCTに触れたり、OCTの泡立ちが発生するため、金型を急激に下げたりしないでください。凍結サンプルは-80°Cで保存してください。
6. 腫瘍を含む脳をOCTで保存し、凍結切片のために瞬間凍結します。分析に必要になるまで-80°Cで保存してください。

8. 蛍光顕微鏡

1. クライオセクショニング用のクライオスタットを準備します。チャンバーと試料ヘッドの温度を-15°Cから-20°Cの間に設定します。
2. OCTで急速凍結した脳を-80°Cで保存した状態から取り出し、クライオスタットチャンバー内に置きます。切片作製する前に、サンプルをチャンバー温度(-20°C)まで温めます。
3. 片刃のカミソリを使用して、注射部位で脳を冠状に切ります。これは通常、脳の表面にくぼみとして見えます。少量のOCTを使用してサンプルを検体ディスクにマウントし、脳の切断面を切片に配置します。チャンバー内で冷やしたおもりで十分な圧力をかけることで、サンプルを安定して装着することができます。
4. マウントされたサンプルと試料ディスクを試料ヘッドに移動し、切片化の準備をします。20 μmの切片を取り、サンプルの角度を調整して、組織をできるだけ組織と同じ高さに近づけるように切片にして、組織を希望の深さにトリミングします。
5. 目的の組織深度に達したら、クライオスタットを調整してサンプルの5〜7μmの切片を取ります。マウスID、切片組織、スライド番号などの記述子があらかじめラベル付けされたスライドガラスに切片をマウントし、顕微鏡スライドの帯電面を切片上に素早く下ろします。
6. 新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)を作ります。スライドを組織と一緒にPFA溶液に15分間浸し、組織を固定します。固定後、スライドをDPBS 3xですすいでください。
7. スライドガラス上に固定した組織切片に、細胞核を染色する4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤を40 μL滴下します。24 mm x 50 mmのガラスカバースリップを封入剤の上に慎重に置き、ティッシュ全体が封入剤に包まれていることを確認します。
8. DAPI(359 nmでの発光(em)、457 nmでの励起(ex))およびCy5.5(ex:683 nm、em 703 nm)蛍光顕微鏡を使用して組織を視覚化します。

結果

MN-抗miR10bは、前述のように合成され、特性評価された¹¹。MN-anti-miR10bの透過型電子顕微鏡は、ナノプラットフォームの形態と多分散性を示しています(図1B)。このナノプラットフォームの平均サイズは25.12 ± 0.34 nmで、ゼータ電位は13.18 ± 1.47 mVです(図1C、D)。これらの研究では、ヌ?...

ディスカッション

BBBを介したナノ粒子の蓄積を検証するさまざまな方法にわたるいくつかの重要なステップは、プロトコルの成功にとって決定的なものとなり得ます。GBM細胞の同所性移植から始めて、骨を乾燥させた後に頭蓋骨の縫合線が見えるようにすることが重要です。これにより、腫瘍細胞の正確な配置が可能になります。頭蓋骨を穴あけするには、穴あけ部位に軽い圧力を加...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery