העברת ננו-חלקיקים של מטען אוליגונוקלאוטיד במודל בעלי חיים רב-צורניים מסוג גליובלסטומה

Summary

מחסום הדם-מוח הוא משוכה משמעותית במתן טיפולים לגליובלסטומה, מחלה שאין לה תרופה. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמת ננו טיפולית של תחמוצת ברזל מונחית תמונה in vivo שיכולה לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר בגידול.

Abstract

גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM) היא הצורה הנפוצה והאגרסיבית ביותר של ממאירות מוחית ראשונית שאין לה תרופה. מחסום הדם-מוח הוא מכשול משמעותי במתן טיפולים לגליובלסטומה. כאן מדווחת פלטפורמת ננו טיפולית מונחית תמונה, מבוססת תחמוצת ברזל, המסוגלת לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר באזור הגידול ולספק את המטען שלו. פלטפורמת ננו 25 ננומטר זו מורכבת מננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מצולבים המצופים דקסטרן המסומנים בצבע פלואורסצנטי Cy5.5 ומכילים אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס כמטען. ליבת תחמוצת הברזל המגנטית מאפשרת מעקב אחר ננו-חלקיקים באמצעות דימות תהודה מגנטית in vivo , בעוד שצבע Cy5.5 מאפשר מעקב באמצעות הדמיה אופטית. דו"ח זה מפרט את ניטור ההצטברות של פלטפורמת ננו-חלקיקים זו (המכונה MN-anti-miR10b) בגידולי גליובלסטומה מושתלים אורתוטופית לאחר הזרקה תוך ורידית. בנוסף, הוא מספק תובנה לגבי אספקת in vivo של אוליגונוקלאוטידים RNA, בעיה שהקשתה על התרגום של טיפולי RNA למרפאה.

Introduction

Glioblastoma multiforme (GBM) הוא הדרגה הגבוהה ביותר של אסטרוציטומה אשר אין כמעט תרופה. כ -15,000 אנשים מאובחנים עם גליובלסטומה מדי שנה, שיש לה הישרדות חציונית עגומה של כ -15 חודשים ושיעור הישרדות של 5 שנים של 5%¹. בעשורים האחרונים חל שיפור שולי בפרוגנוזה למרות מאמצים מרובים לקדם אפשרויות טיפוליות. סטנדרט הטיפול הנוכחי בגליובלסטומה כולל כריתה כירורגית מקסימלית, במידת האפשר, ואחריה הקרנות וכימותרפיה². טמוזולומיד (TMZ), הכימותרפיה המועדפת, הייתה הטיפול האחרון בגליובלסטומה שהתגלה כמראה יעילות קלינית בולטת; עם זאת, לפחות 50% מגידולי GBM מראים עמידות^{ל-TMZ 3}. למרות משטר....

Protocol

כל ההליכים המערבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מישיגן (IACUC). נקבות עכברים עירומים אתמיים נרכשו ממעבדות ג'קסון (זן #007850) בגיל 7 שבועות והורשו להתאקלם במשך שבוע לפני ניתוח ההשתלה. עכברים היו בערך 21-25 גרם בזמן השתל. תאי U251 המבטאים לוציפראז גחלילית נוצרו וסופקו על ידי ד"ר אנה דה-קרבליו¹².

1. תרבית תאים והכנה להשתלה

1. תרבית תאי גליובלסטומה אנושיים עם תווית לוציפראז, U251 בתווך הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו המכיל D-גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37°C עם 5....

תוצאות

MN-anti-miR10b סונתז ואופיין, כפי שתואר קודם לכן¹¹. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת של MN-anti-miR10b מראה את המורפולוגיה והפיזור הפולי-פיזור של פלטפורמת הננו (איור 1B). לפלטפורמת ננו זו יש גודל ממוצע של 25.12 ± 0.34 ננומטר עם פוטנציאל zeta של 13.18 ± 1.47 mV (

Discussion

מספר שלבים קריטיים בשיטות השונות לאימות הצטברות הננו-חלקיקים על פני BBB יכולים להיות מכריעים להצלחת הפרוטוקול. החל מההשתלה האורתוטופית של תאי GBM, חשוב לוודא כי קווי התפרים של הגולגולת נראים לאחר ייבוש העצם; זה מסייע במיקום מדויק של תאי הגידול. עבור קידוח דרך הגולגולת, עדיף.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery