העברת ננו-חלקיקים של מטען אוליגונוקלאוטיד במודל בעלי חיים רב-צורניים מסוג גליובלסטומה

Summary

מחסום הדם-מוח הוא משוכה משמעותית במתן טיפולים לגליובלסטומה, מחלה שאין לה תרופה. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמת ננו טיפולית של תחמוצת ברזל מונחית תמונה in vivo שיכולה לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר בגידול.

Abstract

גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM) היא הצורה הנפוצה והאגרסיבית ביותר של ממאירות מוחית ראשונית שאין לה תרופה. מחסום הדם-מוח הוא מכשול משמעותי במתן טיפולים לגליובלסטומה. כאן מדווחת פלטפורמת ננו טיפולית מונחית תמונה, מבוססת תחמוצת ברזל, המסוגלת לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר באזור הגידול ולספק את המטען שלו. פלטפורמת ננו 25 ננומטר זו מורכבת מננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מצולבים המצופים דקסטרן המסומנים בצבע פלואורסצנטי Cy5.5 ומכילים אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס כמטען. ליבת תחמוצת הברזל המגנטית מאפשרת מעקב אחר ננו-חלקיקים באמצעות דימות תהודה מגנטית in vivo , בעוד שצבע Cy5.5 מאפשר מעקב באמצעות הדמיה אופטית. דו"ח זה מפרט את ניטור ההצטברות של פלטפורמת ננו-חלקיקים זו (המכונה MN-anti-miR10b) בגידולי גליובלסטומה מושתלים אורתוטופית לאחר הזרקה תוך ורידית. בנוסף, הוא מספק תובנה לגבי אספקת in vivo של אוליגונוקלאוטידים RNA, בעיה שהקשתה על התרגום של טיפולי RNA למרפאה.

Introduction

Glioblastoma multiforme (GBM) הוא הדרגה הגבוהה ביותר של אסטרוציטומה אשר אין כמעט תרופה. כ -15,000 אנשים מאובחנים עם גליובלסטומה מדי שנה, שיש לה הישרדות חציונית עגומה של כ -15 חודשים ושיעור הישרדות של 5 שנים של 5%¹. בעשורים האחרונים חל שיפור שולי בפרוגנוזה למרות מאמצים מרובים לקדם אפשרויות טיפוליות. סטנדרט הטיפול הנוכחי בגליובלסטומה כולל כריתה כירורגית מקסימלית, במידת האפשר, ואחריה הקרנות וכימותרפיה². טמוזולומיד (TMZ), הכימותרפיה המועדפת, הייתה הטיפול האחרון בגליובלסטומה שהתגלה כמראה יעילות קלינית בולטת; עם זאת, לפחות 50% מגידולי GBM מראים עמידות^{ל-TMZ 3}. למרות משטר טיפולי קפדני זה, עדיין קיים צורך קליני משמעותי בטיפול משופר בגליובלסטומה.

הפיתוח של טיפולים עבור GBM ומחלות אחרות הקשורות למוח מעוכב באופן משמעותי על ידי האופי הסלקטיבי של מחסום הדם-מוח (BBB). מחסום BBB הוא מחסום פיזיולוגי המורכב מתאי אנדותל, פריציטים וקצות רגליים אסטרוציטים, אשר יוצר את הקרום החדיר למחצה בין מערכת הדם למוח, ומגביל את המעבר החופשי של מולקולות ותאים למוח⁴. בעוד שהוא מגן בפיזיולוגיה נורמלית וקריטי להומאוסטזיס של המוח, מחסום הדם-מוח מונע מטיפולים רבים להגיע למוח, מה שמסבך את הטיפול בגליובלסטומה. מאמצים לשפר את מתן התרופות לגליובלסטומה הובילו לפיתוח רכבי משלוח מבוססי ננו-חלקיקים, שיפור ממוקד במתן תרופות באולטרסאונד ואספקת תרופות בתיווך קולטן ^5,6.

ננו-חלקיקים התגלו כמדיום מבטיח לפיתוח תרופות למספר עצום של מחלות, כולל סרטן. היישום של ננו-חלקיקים למטרות הדמיה וטיפול בגליובלסטומה נוסה באמצעות מבנים שונים של ננו-חלקיקים ^7,8. עם התמקדות בהעברת תרופות לגליובלסטומה בשילוב עם הדמיה in vivo של הלידה, הגישה המוצעת משתמשת בננו-חלקיקים מגנטיים (MN) המורכבים מליבת תחמוצת ברזל ומכוסים על ידי דקסטרן ליציבות. התכונות המגנטיות של ננו-חלקיקים אלה מאפשרות את זיהויים באמצעות דימות תהודה מגנטית (MR), בעוד שכימיית הצמידות הפשוטה לציפוי דקסטרן האמין מאפשרת צימוד של מויאטים טיפוליים כגון מולקולות RNA, מוייטי מטרה נוספים, או מויטי הדמיה (כגון צבע אופטי Cy5.5 קרוב לאינפרא אדום)^9,10. בנוסף ליכולות ההדמיה, פלטפורמת הננו מסוגלת להאריך את זמן מחצית החיים של טיפולי RNA על ידי הגנה על האוליגונוקלאוטיד מפני נוקלאזות אנדוגניות, ובכך לשפר את האספקה הטיפולית. כאן מוצג היישום של פלטפורמת ננו זו להעברת in vivo של אוליגונוקלאוטידים טיפוליים (המכונים MN-anti-miR10b) לגליובלסטומה, המנוטרת על ידי הדמיה in vivo. בעבר, היכולת של פלטפורמת ננו זו להצטבר הודגמה בתאי GBM במבחנה, מה שגרם לאובדן משמעותי של הכדאיות של תאי הגידול¹¹. לפני ביצוע מחקרי Therapeutic in vivo, יש צורך להדגים in vivo משלוח של פלטפורמת ננו זו לגידולי GBM במודלים של בעלי חיים. כדי להשיג זאת, מודלים אורתוטופיים של GBM בבעלי חיים הופקו, וניהול תוך ורידי של המבנה בוצע ואחריו הדמיה in vivo. להלן הפרוטוקולים של מחקרים אלה המראים הצטברות באזור הגידול שאושרה על ידי הדמיה in vivo ומיקרוסקופ ex vivo.

Protocol

כל ההליכים המערבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מישיגן (IACUC). נקבות עכברים עירומים אתמיים נרכשו ממעבדות ג'קסון (זן #007850) בגיל 7 שבועות והורשו להתאקלם במשך שבוע לפני ניתוח ההשתלה. עכברים היו בערך 21-25 גרם בזמן השתל. תאי U251 המבטאים לוציפראז גחלילית נוצרו וסופקו על ידי ד"ר אנה דה-קרבליו¹².

1. תרבית תאים והכנה להשתלה

1. תרבית תאי גליובלסטומה אנושיים עם תווית לוציפראז, U251 בתווך הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו המכיל D-גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37°C עם 5% CO₂.
2. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70%, טריפסינזה עם 0.25% טריפסין/EDTA למשך 1-2 דקות ב-37°C. השתמש ב- 2-4 מ"ל עבור צלוחיות T-75, או 4-6 מ"ל עבור צלוחיות T-175.
3. לאחר שהתאים התנתקו מהצלוחית, הרוו את התגובה ביחס של 2:1 של תוספת DMEM וערבבו בעדינות על ידי פיפטציה כדי לנתק תאים לתרחיף חד-תאי. מעבירים את התאים לצינור חרוטי ומטילים את התאים בצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות.
4. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS). ספרו את התאים עם המוציטומטר באמצעות צביעה כחולה טריפאן כדי להוציא תאים מתים ולחשב את המספר הכולל של תאים חיים. גלול את התאים שוב, כפי שתואר לעיל.
5. השהה מחדש את גלולת התא לריכוז של 1 x 10⁸ תאים/מ"ל ב- PBS ואחסן את תרחיף התא על קרח להשתלה תוך גולגולתית.

2. השתלת גידול אורתוטופי ביד חופשית

הערה: פרוטוקול זה נלקח מ- Irtenkauf et al. (ההליך של ד"ר אנה דה קרבליו; Henry Ford Health Hermelin Brain Tumor Center)¹². כל הצעדים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית כדי להבטיח בטיחות הן לנבדקים והן לחוקרים. שיטת ההשתלה ביד חופשית מאפשרת הליך מהיר יותר להשגת דגימות גדולות יותר תוך שמירה על איכות ההשתלה התוך גולגולתית. לחלופין, ניתן להשתמש במכשיר סטריאוטקסי כדי להשתיל את הגידול באותן קואורדינטות המתוארות להלן.

1. לשקול את העכבר העירום, athymic ולתת פתרון הרדמה של קטמין/xylazine (100 מ"ג / ק"ג / 10 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal עם מזרק 28G. הניחו את העכבר בכלוב התאוששות על גבי כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. ודא את ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הדוושה.
2. יש למרוח משחת עיניים אופתלמית, לתת קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית עם מזרק 28G, ולתת אגרופים מזהים באוזן.
3. יש לעקר את אתר הניתוח בחלק העליון של הראש עם 70% אתנול ולאחר מכן לשפשף בטאדין ולחזור על הפעולה 3x. לאחר מכן, בצע חתך 5-7 מ"מ עם מספריים כירורגיים קטנים מימין לקו האמצע של הראש ולמשוך את העור עם מלקחיים עדינים כדי לחשוף את הגולגולת ואת קווי התפר של הגולגולת.
4. לשפשף את הגולגולת עם צמר גפן כדי להסיר את periosteum, המאפשר גישה לעצם. יש למרוח תמיסה של 3% מי חמצן באמצעות צמר גפן חדש לייבוש העצם. בעזרת צמר גפן חדש, נגבו את עודפי מי החמצן וכל קצף שעלול להיווצר. חזור על שלב זה 3x עד שהברגמה נראית על הגולגולת והעצם יבשה מספיק לקידוח. גולגולת יבשה מספיק תהיה בעלת קווי תפר מולבנים לחלוטין ואדמומיות מופחתת מהמראה ההתחלתי.
5. ביחס לברגמה, יש למדוד -2.5 מ"מ מדיאלי/לטרלי ו-1- מ"מ קדמי/אחורי עם סרגל ולסמן את אתר הקידוח בטוש. יש למדוד שוב לפני הקידוח כדי לוודא שהסימן נמצא במיקום הנכון.
6. קח מקדח מיקרו-כירורגיה חשמלי (11,000 סל"ד) עם בור מקדח 0.5 מ"מ ועשה בזהירות חור בגולגולת היכן שסומן קודם לכן. יש לספוג כל דם או נוזל שעלול להצטבר באתר הקידוח בעזרת צמר גפן טרי.
7. הכינו מזרק מיקרוליטר 33 גרם המצויד בשרוול מחט עד אורך מחט חשופה של 3 מ"מ. צייר 5 μL של השעיית תאים 1 x 10⁸ תאים / מ"ל שהוכנה קודם לכן לאחר השעיה קצרה עם פיפטה וודא שאין בועות בתמיסת ההזרקה. נגבו בזהירות את עודפי מתלי התאים שנותרו בחלק החיצוני של המחט ושרוול המחט עם מגבון איזופרופנול 70%.
8. הכנס את המחט אנכית לאתר המקדחה עד ששרוול המחט יפסיק את החדרת המחט נוספת. בזהירות למשוך את המחט כ 0.5 מ"מ כדי ליצור מקום עבור התאים המוזרקים להצטבר.
9. הזריקו באיטיות את תרחיף התא למשך דקה. לאחר הזרקת הנפח המלא, החזק את המחט בעומק למשך דקה נוספת כדי להפחית את שטף תמיסת ההזרקה. לאחר מכן, משוך את המחט בזהירות.
10. בעזרת צמר גפן נקי, נגבו כל נוזל שהצטבר באתר ההזרקה ולאחר מכן מרחו שעוות עצם כדי לאטום את החור.
11. סוגרים את החתך עם קשר וטרינרי ומניחים לו להתייבש. עם צמר גפן נקי, להחיל לידוקאין מקומי כמו משכך כאבים.
12. עקוב אחר העכבר עד להתאוששות מלאה ואמבולטורית. מתן קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית במשך יומיים לאחר ההשתלה לטיפול בכאב.

3. סינתזת פלטפורמת ננו-חלקיקים

1. לסנתז ולהצמיד את הננו-חלקיקים עם Cy5.5 ואוליגונוקלאוטיד (anti-miR10b) כפי שתואר קודם¹¹.

4. ניהול MN-anti-miR10b

הערה: במחקר זה, הזריקות נעשו פעם בשבוע במשך 6 שבועות החל מ-7 ימים לאחר ההשתלה, אך ניתן להשתמש באותו פרוטוקול בתדרי הזרקה שונים.

1. שקול את העכבר וחשב את נפח MN-anti-miR10b לנהל לעכבר. מינונים של MN-anti-miR10b ניתנים ב 20 מ"ג Fe / kg במודלים GBM murine. לדוגמה, עכבר של 20 גרם מקבל מינון של 80 μL של 5 מ"ג Fe/mL MN-anti-miR10b. עכברי ביקורת מקבלים נפח שווה של PBS בהתאם לסכמת מינון זו.
2. הכינו מזרק 28G עם המינון של MN-anti-miR10b וודאו שאין בועות בתמיסת ההזרקה.
3. יש להרדים את העכבר מתחת ל-2%-4% איזופלורן לאינדוקציה ו-1.5%-2% לתחזוקה עם קצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה בקופסת אינדוקציה. העבר את העכבר לקונוס אף והמשך בהרדמה. בדקו את עומק ההרדמה ומרחו משחה וטרינרית.
4. יש לעקר את הזנב עם מגבון איזופרופנול 70% ולאפשר לעודף אלכוהול להתייבש.
5. סובב את הזנב כדי למקם את הוורידים הקאודליים הרוחביים לחלק העליון של הזנב. לאחר מכן, מכוון לווריד, הכנס את המחט לזנב וצור ואקום על ידי משיכת הבוכנה לאחור.
6. הכנס את המחט עד שהדם נכנס למזרק, המציין כניסה מוצלחת לווריד.
7. הזריקו באיטיות MN-anti-miR10b ומשכו את המחט לאחר הלידה המלאה. החל לחץ על אתר ההזרקה עם גזה עד הדימום מפסיק.
8. הסר את העכבר מחרוט האף. עקוב אחר העכבר עד להתאוששות מלאה ואמבולטורית.
   הערה: מתן בולוס של ננו-חלקיקים עלול לגרום למצוקה נשימתית. בזהירות לפקח על העכבר ומיד להחיל לחיצות חזה קל אם יש סימנים של מצוקה נשימתית.

5. ביולומינסנציה In vivo והדמיית פלואורסצנטיות

הערה: ביולומינסנציה In vivo והדמיה פלואורסצנטית מבוצעות במערכת ההדמיה In Vivo (IVIS) לפני ו-24 שעות אחרי הזרקת הננו-חלקיק.

1. הכינו D-לוציפרין מסונן סטרילי בריכוז של 30 מ"ג/מ"ל ב-PBS ללא Mg²⁺ ו-Ca²⁺.
2. פתח את תוכנת הפעולה IVIS והתחל באתחול כדי להכין את המכונה. במהלך אתחול המערכת, בחרו תיקייה לשמירת תמונות באמצעות בחירה באפשרות 'רכישה' >'שמירה אוטומטית ל ' והגדירו את התיקייה לשמירת הקבצים.
3. בנקודות זמן הדמיה, לשקול את העכבר ולחשב את נפח D-luciferin לתת עבור מינון של 150 מ"ג / ק"ג. הכינו מזרק 28G עם הנפח, המגן על התמיסה מפני אור ישיר. מחקר זה כלל הדמיה יומיים לאחר ניתוח ההשתלה כדי לאשר את הזריעה, וההדמיה השבועית החלה ביום השביעי לאחר ההשתלה מיד לפני הטיפולים השבועיים.
4. מרדימים את העכבר מתחת ל-2%-4% איזופלורן לאינדוקציה ו-1.5%-2% לתחזוקה עם קצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה בתא אינדוקציה. לאחר הרדמה, בעדינות לשפשף את העכבר כדי למנוע פגיעה נוספת באתר הניתוח להזריק את המינון של D-luciferin intraperitoneally. אפשר לעכבר להתאושש והמתן 10 דקות לפני ההדמיה כדי לאפשר לאות הביולומינסנציה להתפתח ולהתייצב.
5. בזמן שהאות הביולומינסנציה מתפתח, הכינו את סורק IVIS להדמיית ביולומינסנציה. הניחו את משטח הפלואורסצנטיות הנמוך השחור על במת ההדמיה והגדירו את מערך חרוטי האף למספר הנושאים שיש לצלם.
6. בתוכנה, לחץ על אשף ההדמיה. בחר Bioluminescence Imaging ולאחר מכן בחר Open Filter. במסך הבא, בחר נושא הדמיה ושדה ראייה. ה- IVIS מוגדר כעת להדמיית ביולומינסנציה.
7. 3 דקות לפני ההדמיה, התחל להכין את קופסת האינדוקציה על ידי מתן אפשרות לתערובת איזופלורן/חמצן למלא את הקופסה. 2 דקות לפני ההדמיה, הכניסו עכברים לקופסת האינדוקציה לצורך הרדמה.
8. לאחר ההרדמה, העבירו את העכברים מקופסת האינדוקציה לאינפוזיה לצורך הדמיה והניחו כל אחד מהם במצב נוטה. לספק הרדמה תחזוקתית באמצעות 2% isoflurane במהלך ההדמיה.
9. לאחר שהעכברים הוכנסו לסורק IVIS, לחצו על 'רכוש רצף'. צלם תמונה באמצעות הגדרות חשיפה אוטומטית עם סף אות מינימלי של 3,000 ספירות. הדמיה ביולומינסנציה מדמיינת את הלוקליזציה של תאי גליובלסטומה U251 המסומנים בלוציפראז. חשיפה אוטומטית תלכוד תמונה עם אורך חשיפה המחושב בהתבסס על האות הבהיר ביותר בתצוגה עד לאורך המרבי שהוגדר על-ידי המשתמש של 5 דקות.
   הערה: כלוב עכברים טיפוסי דורש תמונה אחת, מכיוון שהזריעה היא בדרך כלל אחידה. במקרים של עכבר בהיר אחד או יותר, ניתן להסיר עכברים, וניתן לבצע רכישה חוזרת כדי ללכוד טוב יותר אותות מעכברים עמומים.
10. לאחר הדמיית ביולומינסצנציה, שנה את הגדרות IVIS כדי להכין דימות אפי-פלואורסצנטי ולבצע סריקות פלואורסצנטיות.
    1. באשף ההדמיה, בחר Fluorescence > Filtered Pair with Epi-Illumination. במסך הבא, בחר את הבדיקות לצילום, כגון Cy5.5. בחר את נושא ההדמיה ואת שדה הראייה. סורק IVIS מוגדר כעת להדמיית פלואורסצנטיות של הגשושיות שנבחרו במסך הקודם.
11. צלם תמונה באמצעות הגדרות חשיפה אוטומטית עם סף אות מינימלי של 6,000 ספירות. Cy5.5 הדמיה פלואורסצנטית מדמיינת את הלוקליזציה של MN-anti-miR10b. חשיפה אוטומטית תלכוד תמונה עם אורך חשיפה המחושב בהתבסס על האות הבהיר ביותר בתצוגה עד לאורך המרבי שהוגדר על-ידי המשתמש של 5 דקות.
    הערה: הדמיה פלואורסצנטית נמשכת לעתים רחוקות יותר מדקה אחת של חשיפות, אפילו בעכברי ביקורת שהזריקו PBS. תמונה אחת תמיד מספיקה מכיוון שסטיית האות בין עכברים מטופלים קטנה.
12. הסר את העכבר מה- IVIS לאחר ההדמיה. יש לעקוב עד להחלמה מלאה מהרדמה ואמבולטורית.

6. הדמיית תהודה מגנטית In vivo

הערה: הדמיית MR מבוצעת לפני ו-24 שעות לאחר הזרקת ננו-חלקיקים וניתן לבצעה באותם בעלי חיים שעוברים הדמיה אופטית וביו-לומינסנציה.

1. מרדימים את העכבר הנבדק בקופסת אינדוקציה מתחת ל-2%-4% איזופלורן לאינדוקציה ו-1.5%-2% לתחזוקה עם קצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה. לאחר ההרדמה, הניחו את העכבר הנוטה למיטת MRI על גבי בלון ניטור הנשימה. התאימו את חרוט האף בצורה צמודה לחוטם כדי לספק הרדמה במהלך ההדמיה ומרחו משחת עיניים אופתלמית.
2. יש לשתק ולמקם את הראש לסריקה באמצעות מוט נשיכה ומוטות אוזניים.
3. התקן את בדיקת הטמפרטורה הרקטלית המשומנת וודא שניטור הנשימה והטמפרטורה מתפקדים. מקם את סליל המוח של העכבר מעל הראש על ידי התאמת היתדות על מיטת העכבר לתוך החורים בסליל והדביק את הסליל למקומו כדי להפחית את התנועה במהלך הסריקה.
4. הניחו משטח קטן למחזור מים חמים על חלקו העליון של העכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בזמן הרדמה. דאגו לאפשר מרחק מסוים בין הסליל לשמיכת החימום כדי להגביל את עיוות התמונה על ידי הפרעות מים.
5. הזז את העכבר ואת מיטת ההדמיה למקומם לסריקה.
6. כוונן והתאם את סלילי ה- MRI על ידי התחלת שלב הגדרת Wobble בתוכנת הרכישה. בסוף השירות של ה- MRI, השתמש בידיות ההתאמה והכוונון שעל הסליל כדי לוודא שהעקבה ממורכזת (מכווננת) ועמוקה ככל האפשר (התאמה).
7. רכשו סריקת לוקלייזר תלת-מישורית והתאימו את מצע ההדמיה כך שימקם את המוח במרכז האיזו-סנטר של המגנט, במידת הצורך.
8. רכוש סריקות משוקללות 2D T₂ כדי לזהות את הסוכן המוזרק בגידול עם הפרמטרים הבאים: זמן חזרה (TR) = 2500 ms, זמן הד (TE) = 25 ms, שדה הראייה (FOV) 20 x 20 מ"מ, 18 פרוסות העטרה, מרווח פרוסה 0.2 מ"מ, רזולוציה של 150 x 150 מיקרומטר במישור, עובי פרוסה 0.5 מ"מ.
9. רכוש מפת B0 של המוח כולו כדי לחשב shim מקומי באמצעות כלי השירות Mapshim. לאחר מכן, השתמש בתמונות משוקללות 3D T₂ כדי להמחיש את הננו-חלקיקים עם TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 מ"מ, רזולוציה 100 מיקרומטר איזוטרופי.
10. רכוש מפת T₂^* להדמיית ננו-חלקיקים נוספת באמצעות התמונה המשוקללת הדו-ממדית T₂ כהפניה לסריקת מיקום מעל הגידול. השתמש ב- TR = 800 אלפיות השנייה, TE = 3.5 אלפיות השנייה. FOV 20 x 20 מ"מ, 5 פרוסות קורונליות, ללא רווח פרוסות. רזולוציה במישור 100 מיקרומטר במישור. קבל 10 תמונות הד חיובי עם מרווח זמן הד של 5 אלפיות השנייה.
11. עקוב אחר הנשימה וטמפרטורת הגוף לאורך רצפי ההדמיה והתאם את טמפרטורת האיזופלורן והמים במידת הצורך.
12. לאחר ההדמיה, הוציאו את העכבר מסורק ה-MRI והניחו אותו בכלוב התאוששות מחומם. עקוב אחר העכבר עד שהוא מתאושש לחלוטין מהרדמה ואמבולטורי.

7. ביולומינסנציה Ex vivo והדמיית פלואורסצנטיות

1. בצע הדמיה ביולומינסנציה ופלואורסנציה ex vivo ב- IVIS, בדומה להדמיית in vivo . בצע את אתחול IVIS וסרוק שלבים כמתואר לעיל.
2. בנקודת הסיום של הניסוי, לשקול את העכבר ולחשב את נפח D-luciferin לתת עבור מינון של 150 מ"ג / ק"ג. להזריק את המינון של D-luciferin ולבצע הדמיה חיה 10 דקות לאחר ההזרקה, כפי שתואר קודם לכן.
3. לאחר ביולומינסנציה סופית in vivo והדמיה פלואורסצנטית, הרדימו במהירות את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם בעודו תחת הרדמה, נתחו את העכבר ואספו את האיברים העיקריים, כולל המוח, על צלחת פטרי.
4. מקם את צלחת הפטרי עם איברים שנכרתו בסורק IVIS וצלם את האיברים עם שיטות ביולומינסנציה ופלואורסנציה באמצעות אותן הגדרות רכישה כמו הדמיה in vivo .
5. הבזק מקפיא את כל האיברים הדרושים לניתוח נוסף ב-OCT על ידי הורדה איטית של הקריומולד עם הדגימה ב-OCT לתוך בריכה רדודה של חנקן נוזלי עם מלקחיים ארוכים עד שה-OCT הופך לבן לחלוטין. אין לאפשר לחנקן נוזלי לגעת בנוזל OCT או להוריד את התבנית מהר מדי, מכיוון שתתרחש בעבוע של ה-OCT. יש לאחסן דגימות קפואות בטמפרטורה של -80°C.
6. לאחסן את המוח המכיל את הגידול ב OCT ולהקפיא הבזק עבור cryosectioning. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לצורך בניתוח.

8. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. הכינו את הקריוסטט להקפאה. הגדר את טמפרטורת ראש התא והדגימה בין -15 ° C ו -20 ° C.
2. הוציאו את המוח הקפוא בהבזק ב-OCT מאחסון של -80°C והניחו אותו בתוך תא ההקפאה. אפשר לדגימות להתחמם לטמפרטורת החדר (-20 מעלות צלזיוס) לפני החיתוך.
3. באמצעות סכין גילוח בעל קצה יחיד חתכו את המוח באופן קורונלי באתר ההזרקה. זה נראה בדרך כלל כמו גומה על פני השטח של המוח. הרכיבו את הדגימה על דיסק הדגימה באמצעות כמות קטנה של OCT כדי למקם את הצד החתוך של המוח שיש לחתך. הפעילו לחץ רב עם המשקל המצונן בתוך התא כדי להבטיח הרכבה יציבה של הדגימה.
4. העבר את הדגימה המותקנת ואת דיסק הדגימה על ראש הדגימה כהכנה לחתך. חתוך את הרקמה לעומק הרצוי על ידי לקיחת חתכים של 20 מיקרומטר, התאמת זווית הדגימה כדי לחתוך את הרקמה קרוב ככל האפשר לרמה עם הרקמה.
5. לאחר שהושג עומק הרקמה הרצוי, התאם את הקריוסטט כך שייקח 5 - 7 מקטעים של הדגימה. הרכיבו את המקטעים על שקופיות זכוכית המסומנות מראש עם תיאורים כגון מזהה עכבר, מקטע רקמות ומספר שקופית על-ידי הורדה מהירה של הצד הטעון של שקופית המיקרוסקופ אל המקטע.
6. הכינו 4% פרפורמלדהיד טרי (PFA). השקיעו את השקופית עם הרקמה בתמיסת PFA למשך 15 דקות כדי לתקן את הרקמה. שטוף את השקופית עם DPBS 3x לאחר הקיבוע.
7. לחלק הרקמה הקבוע כעת בשקופית הזכוכית, הוסף טיפה של 40 μL של אמצעי הרכבה המכיל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), אשר מכתים גרעיני תאים. הניחו בזהירות כיסוי זכוכית בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ על גבי אמצעי ההרכבה וודאו שהרקמה כולה עטופה באמצעי ההרכבה.
8. דמיינו את הרקמה באמצעות DAPI (פליטה (em) ב-359 ננומטר, עירור (excitation) ב-457 ננומטר) ומיקרוסקופ פלואורסצנטי Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm).

תוצאות

MN-anti-miR10b סונתז ואופיין, כפי שתואר קודם לכן¹¹. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת של MN-anti-miR10b מראה את המורפולוגיה והפיזור הפולי-פיזור של פלטפורמת הננו (איור 1B). לפלטפורמת ננו זו יש גודל ממוצע של 25.12 ± 0.34 ננומטר עם פוטנציאל zeta של 13.18 ± 1.47 mV (

Discussion

מספר שלבים קריטיים בשיטות השונות לאימות הצטברות הננו-חלקיקים על פני BBB יכולים להיות מכריעים להצלחת הפרוטוקול. החל מההשתלה האורתוטופית של תאי GBM, חשוב לוודא כי קווי התפרים של הגולגולת נראים לאחר ייבוש העצם; זה מסייע במיקום מדויק של תאי הגידול. עבור קידוח דרך הגולגולת, עדיף...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery