Livraison de nanoparticules d’une charge utile d’oligonucléotide dans un modèle animal de glioblastome multiforme

Résumé

La barrière hémato-encéphalique est un obstacle important à l’administration de traitements pour le glioblastome, une maladie pour laquelle il n’existe aucun remède. Ici, nous rapportons une nanoplateforme thérapeutique d’oxyde de fer guidée par l’image in vivo qui peut contourner cette barrière physiologique en raison de sa taille et s’accumuler dans la tumeur.

Résumé

Le glioblastome multiforme (GBM) est la forme la plus courante et la plus agressive de malignité cérébrale primitive pour laquelle il n’existe aucun remède. La barrière hémato-encéphalique est un obstacle important dans l’administration de thérapies contre le GBM. Il s’agit d’une nano-plateforme d’administration thérapeutique à base d’oxyde de fer, guidée par l’image, capable de contourner cette barrière physiologique en raison de sa taille et de s’accumuler dans la région tumorale, délivrant ainsi sa charge utile. Cette nanoplateforme de 25 nm se compose de nanoparticules d’oxyde de fer recouvertes de dextran réticulé marquées avec un colorant fluorescent Cy5.5 et contenant un oligonucléotide antisens comme charge utile. Le noyau magnétique d’oxyde de fer permet le suivi des nanoparticules par imagerie par résonance magnétique in vivo , tandis que le colorant Cy5.5 permet le suivi par imagerie optique. Ce rapport détaille le suivi de l’accumulation de cette plateforme de nanoparticules (appelée MN-anti-miR10b) dans les tumeurs de glioblastome implantées orthotopiquement après injection intraveineuse. De plus, il donne un aperçu de l’administration in vivo d’oligonucléotides d’ARN, un problème qui a entravé la traduction des thérapies à ARN en clinique.

Introduction

Le glioblastome multiforme (GBM) est le grade le plus élevé d’astrocytome pour lequel il n’existe pratiquement aucun remède. Environ 15 000 personnes reçoivent un diagnostic de glioblastome chaque année, ce qui a une survie médiane lamentable d’environ 15 mois et un taux de survie à 5 ans de 5 %¹. Au cours des dernières décennies, il y a eu une amélioration marginale du pronostic malgré les multiples efforts déployés pour faire progresser les options thérapeutiques. La norme de soins actuelle pour le GBM comprend une résection chirurgicale maximale, lorsque cela est possible, suivie d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie². Le témozolomide (TMZ), la chimiothérapie de choix, a été le dernier traitement du glioblastome dont l’efficacité clinique a été démontrée. cependant, au moins 50% des tumeurs GBM présentent une résistance au TMZ³. Malgré ce régime thérapeutique rigoureux, il existe toujours un besoin clinique important d’améliorer le traitement du glioblastome.

Le développement de traitements pour le GBM et d’autres maladies liées au cerveau est considérablement entravé par la nature sélective de la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est une barrière physiologique composée de cellules endothéliales, de péricytes et d’extrémités des pieds astrocytaires, qui crée la membrane semi-perméable entre le système circulatoire et le cerveau, limitant le libre passage des molécules et des cellules dans le cerveau⁴. Bien qu’elle soit protectrice dans la physiologie normale et essentielle pour l’homéostasie cérébrale, la BHE empêche de nombreux traitements d’atteindre le cerveau, ce qui complique le traitement du GBM. Les efforts visant à améliorer l’administration de produits thérapeutiques contre le GBM ont conduit à la mise au point de véhicules d’administration à base de nanoparticules, à l’amélioration de l’administration de médicaments par ultrasons ciblés et à l’administration de médicaments médiée par les récepteurs ^5,6.

Les nanoparticules sont devenues un moyen prometteur pour développer des traitements pour une myriade de maladies, y compris les cancers. L’application de nanoparticules à des fins d’imagerie et thérapeutiques dans le GBM a été tentée à l’aide de diverses constructions de nanoparticules ^7,8. En mettant l’accent sur l’administration de médicaments au GBM en conjonction avec l’imagerie in vivo de l’administration, l’approche proposée utilise des nanoparticules magnétiques (MN) constituées d’un noyau d’oxyde de fer et recouvertes de dextran pour la stabilité. Les propriétés magnétiques de ces nanoparticules permettent leur détection par imagerie par résonance magnétique (IRM), tandis que la chimie de conjugaison simple au revêtement de dextran aminé permet la conjugaison de fractions thérapeutiques telles que des molécules d’ARN, des fractions de ciblage supplémentaires ou des fractions d’imagerie (telles que le colorant optique proche infrarouge Cy5.5)^9,10. En plus des capacités d’imagerie, la nanoplateforme est capable de prolonger la demi-vie des thérapies à base d’ARN en protégeant l’oligonucléotide des nucléases endogènes, améliorant ainsi l’administration thérapeutique. Ici, l’application de cette nanoplateforme pour l’administration in vivo d’oligonucléotides thérapeutiques (appelés MN-anti-miR10b) au GBM, suivis par imagerie in vivo, est présentée. Auparavant, la capacité de cette nanoplateforme à s’accumuler a été démontrée dans les cellules GBM in vitro, entraînant une perte significative de viabilité des cellules tumorales¹¹. Avant de réaliser des études thérapeutiques in vivo, il est nécessaire de démontrer l’administration in vivo de cette nanoplateforme aux tumeurs GBM dans des modèles animaux. Pour ce faire, des modèles animaux de GBM orthotopique ont été produits, et l’administration intraveineuse du concept a été effectuée, suivie d’une imagerie in vivo. Voici les protocoles de ces études montrant une accumulation dans la région tumorale confirmée par l’imagerie in vivo et la microscopie ex vivo.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan (IACUC). Des souris nues athymiques femelles consanguines ont été achetées chez Jackson Labs (souche #007850) à l’âge de 7 semaines et laissées s’acclimater pendant 1 semaine avant la chirurgie d’implantation. Les souris pesaient environ 21 à 25 g au moment de l’implantation. Des cellules U251 exprimant la luciférase de luciole ont été générées et fournies par le Dr Ana deCarvalho¹².

1. Culture cellulaire et préparation à l’implantation

1. Cultivez des cellules de glioblastome humain marquées à la luciférase, U251 dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant du D-glucose, de la L-glutamine et du pyruvate de sodium et complété par 10 % de sérum de bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C avec 5 % de CO₂.
2. Une fois que les cellules atteignent 70 % de confluence, trypsiniser avec 0,25 % de trypsine/EDTA pendant 1 à 2 min à 37 °C. Utilisez 2 à 4 ml pour une fiole T-75, ou 4 à 6 ml pour une fiole T-175.
3. Une fois que les cellules se sont détachées du flacon, éteignez la réaction avec un rapport de 2:1 de DMEM supplémenté et mélangez doucement par pipetage pour dissocier les cellules en une suspension unicellulaire. Transférez les cellules dans un tube conique et granulez les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
4. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre à l’aide d’une coloration au bleu trypan pour exclure les cellules mortes et calculez le nombre total de cellules vivantes. Granulez à nouveau les cellules, comme décrit ci-dessus.
5. Remettre en suspension la pastille cellulaire à une concentration de 1 x 10⁸ cellules/mL dans du PBS et stocker la suspension cellulaire sur de la glace pour l’implantation intracrânienne.

2. Implantation d’une tumeur orthotopique à main levée

REMARQUE : Ce protocole est adapté d’Irtenkauf et al. (procédure de la Dre Ana deCarvalho ; Centre des tumeurs cérébrales Henry Ford Health Hermelin)¹². Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité pour assurer la sécurité des sujets et des chercheurs. La méthode d’implantation à main levée permet une procédure plus rapide pour obtenir des échantillons de plus grande taille tout en maintenant la qualité de l’implantation intracrânienne. Alternativement, un dispositif stéréotaxique peut être utilisé pour implanter la tumeur aux mêmes coordonnées décrites ci-dessous.

1. Pesez la souris nue et athymique et administrez-lui une solution anesthésique de kétamine/xylazine (100 mg/kg/10 mg/kg) par injection intrapéritonéale avec une seringue de 28 G. Placez la souris dans une cage de récupération sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle. Confirmez l’anesthésie en vérifiant le réflexe de la pédale.
2. Appliquez une pommade ophtalmique pour les yeux, administrez du kétoprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée avec une seringue de 28 G et donnez des coups de poing identificateurs.
3. Stérilisez le site chirurgical au sommet de la tête avec de l’éthanol à 70%, suivi d’un gommage à la bétadine et répétez 3 fois. Ensuite, faites une incision de 5 à 7 mm avec de petits ciseaux chirurgicaux à droite de la ligne médiane de la tête et rétractez la peau avec des pinces fines pour exposer le crâne et les lignes de suture du crâne.
4. Frottez le crâne avec un coton-tige pour enlever le périoste, permettant ainsi l’accès à l’os. Appliquez une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % à l’aide d’un coton-tige neuf pour assécher l’os. À l’aide d’un coton-tige neuf, essuyez l’excès de peroxyde d’hydrogène et toute mousse qui pourrait se former. Répétez cette étape 3 fois jusqu’à ce que le bregma soit visible sur le crâne et que l’os soit suffisamment sec pour le forage. Un crâne suffisamment sec aura des lignes de suture nettement blanchies et des rougeurs réduites dès l’apparition initiale.
5. En ce qui concerne le bregma, mesurez -2,5 mm médial/latéral et -1 mm avant/postérieur avec une règle et marquez le site de forage avec un marqueur. Mesurez à nouveau avant de percer pour vous assurer que la marque est dans la bonne position.
6. Prenez une perceuse de micro-chirurgie électrique (11 000 tr/min) avec une fraise de 0,5 mm et faites soigneusement un trou dans le crâne à l’endroit précédemment marqué. Absorbez tout sang ou liquide qui pourrait s’accumuler sur le site de forage avec un coton-tige frais.
7. Préparez une seringue de 33 G d’un microlitre équipée d’un manchon d’aiguille à une longueur d’aiguille exposée de 3 mm. Prélever 5 μL de la suspension de cellules 1 x 10⁸ cellules/mL préalablement préparée après une brève remise en suspension à l’aide d’une pipette et s’assurer qu’il n’y a pas de bulles dans la solution d’injection. Essuyez soigneusement tout excès de suspension cellulaire laissé à l’extérieur de l’aiguille et du manchon de l’aiguille avec une lingette isopropanol à 70 %.
8. Insérez l’aiguille verticalement dans le site de forage jusqu’à ce que le manchon de l’aiguille arrête l’insertion de l’aiguille. Rétractez soigneusement l’aiguille d’environ 0,5 mm pour créer de l’espace pour l’accumulation des cellules injectées.
9. Injectez lentement la suspension cellulaire sur une période de 1 min. Une fois que le volume complet a été injecté, maintenez l’aiguille en profondeur pendant une minute supplémentaire pour réduire l’efflux de la solution d’injection. Ensuite, rétractez l’aiguille avec précaution.
10. À l’aide d’un coton-tige propre, essuyez tout liquide qui s’accumule au site d’injection, puis appliquez de la cire pour os pour sceller le trou.
11. Fermez l’incision avec un lien vétérinaire et laissez-la sécher. À l’aide d’un coton-tige propre, appliquez de la lidocaïne topique comme analgésique.
12. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie et ambulatoire. Administrer du kétoprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée pendant 2 jours après l’implantation pour la gestion de la douleur.

3. Synthèse de plateformes de nanoparticules

1. Synthétiser et conjuguer les nanoparticules avec Cy5.5 et oligonucléotide (anti-miR10b) comme décrit précédemment¹¹.

4. Administration de MN-anti-miR10b

REMARQUE : Dans cette étude, les injections ont été faites une fois par semaine pendant 6 semaines à partir de 7 jours après l’implantation, mais le même protocole peut être utilisé pour différentes fréquences d’injection.

1. Pesez la souris et calculez le volume de MN-anti-miR10b à administrer à la souris. Les doses de MN-anti-miR10b sont administrées à 20 mg Fe/kg dans les modèles murins de GBM. Par exemple, une souris de 20 g reçoit une dose de 80 μL de 5 mg Fe/mL de MN-anti-miR10b. Les souris témoins reçoivent un volume égal de PBS conforme à ce schéma posologique.
2. Préparez une seringue de 28 G avec la dose de MN-anti-miR10b et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la solution d’injection.
3. Anesthésie la souris sous 2 à 4 % d’isoflurane pour l’induction et 1,5 à 2 % pour l’entretien avec un débit de 1,5 L/min dans une boîte d’induction. Déplacez la souris vers un cône nasal et continuez à administrer l’anesthésie. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie et appliquez une pommade vétérinaire.
4. Stérilisez la queue avec une lingette isopropanol à 70 % et laissez sécher l’excès d’alcool.
5. Faites pivoter la queue pour positionner les veines caudales latérales vers le haut de la queue. Ensuite, en visant la veine, insérez l’aiguille dans la queue et établissez un vide en tirant le piston vers l’arrière.
6. Insérez l’aiguille jusqu’à ce que le sang pénètre dans la seringue, indiquant une entrée réussie dans la veine.
7. Injectez lentement MN-anti-miR10b et rétractez l’aiguille après l’administration complète. Appliquez une pression sur le site d’injection avec de la gaze jusqu’à ce que le saignement cesse.
8. Retirez la souris du cône nasal. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie et ambulatoire.
   REMARQUE : L’administration de nanoparticules en bolus peut provoquer une détresse respiratoire. Surveillez attentivement la souris et appliquez immédiatement de légères compressions thoraciques s’il y a des signes de détresse respiratoire.

5. Imagerie in vivo de bioluminescence et de fluorescence

REMARQUE : L’imagerie in vivo de la bioluminescence et de la fluorescence est effectuée dans le système d’imagerie in vivo (IVIS) avant et 24 h après l’injection de la nanoparticule.

1. Préparer de la D-luciférine filtrée stérile à une concentration de 30 mg/mL dans du PBS sans Mg²⁺ et Ca²⁺.
2. Ouvrez le logiciel de fonctionnement IVIS et lancez l’initialisation pour préparer la machine. Pendant l’initialisation du système, sélectionnez un dossier pour enregistrer les images en sélectionnant Acquisition > Enregistrement automatique dans et définissez le dossier des fichiers à enregistrer.
3. Aux points temporels de l’imagerie, pesez la souris et calculez le volume de D-luciférine à administrer pour une dose de 150 mg/kg. Préparez une seringue de 28 G avec le volume, en protégeant la solution de la lumière directe. Cette étude comprenait une imagerie 2 jours après la chirurgie d’implantation pour confirmer l’ensemencement, et une imagerie hebdomadaire a commencé le 7e jour après l’implantation, immédiatement avant les traitements hebdomadaires.
4. Anesthésie la souris sous 2 % à 4 % d’isoflurane pour l’induction et 1,5 % à 2 % pour l’entretien avec un débit de 1,5 L/min dans une chambre d’induction. Une fois anesthésiée, ébouriffez doucement la souris pour éviter de blesser davantage le site chirurgical et injectez la dose de D-luciférine par voie intrapéritonéale. Laissez la souris récupérer et attendez 10 minutes avant d’imager pour permettre au signal de bioluminescence de se développer et de se stabiliser.
5. Pendant que le signal de bioluminescence se développe, préparez le scanner IVIS pour l’imagerie de bioluminescence. Placez le tapis noir à faible fluorescence sur la platine d’imagerie et configurez le réseau de cônes nasaux pour le nombre de sujets à imager.
6. Dans le logiciel, cliquez sur Assistant d’imagerie. Sélectionnez Imagerie par bioluminescence , puis Ouvrir le filtre. Sur l’écran suivant, sélectionnez Image du sujet et du champ de vision. L’IVIS est maintenant configuré pour l’imagerie par bioluminescence.
7. Au bout de 3 minutes avant l’imagerie, commencez à amorcer la boîte d’induction en laissant le mélange isoflurane/oxygène remplir la boîte. À 2 min avant l’imagerie, placez les souris dans la boîte d’induction pour l’anesthésie.
8. Une fois anesthésiées, déplacez les souris de la boîte d’induction vers l’IVIS pour l’imagerie et allongez-les en position couchée. Fournir une anesthésie d’entretien à l’aide d’isoflurane à 2 % pendant l’imagerie.
9. Une fois les souris placées dans le scanner IVIS, cliquez sur Acquérir la séquence. Prenez une image à l’aide des paramètres d’exposition automatique avec un seuil de signal minimum de 3 000 points. L’imagerie par bioluminescence visualise la localisation des cellules de glioblastome U251 marquées à la luciférase. L’exposition automatique capturera une image dont la durée d’exposition sera calculée en fonction du signal le plus lumineux visible jusqu’à la durée maximale de 5 min définie par l’utilisateur.
   REMARQUE : Une cage typique de souris nécessite une seule image, car l’ensemencement est généralement uniforme. Dans le cas d’une ou plusieurs souris brillantes, les souris peuvent être retirées et une acquisition répétée peut être effectuée pour mieux capturer les signaux des souris sombres.
10. Après l’imagerie par bioluminescence, modifiez les paramètres IVIS pour préparer l’imagerie par épifluorescence et effectuer des balayages de fluorescence.
    1. Dans l’assistant d’imagerie, sélectionnez Fluorescence > paire filtrée avec épi-illumination. Dans l’écran suivant, sélectionnez les sondes à imager, telles que Cy5.5. Sélectionnez le sujet et le champ de vision de l’imagerie. Le scanner IVIS est maintenant configuré pour l’imagerie de fluorescence des sondes sélectionnées dans l’écran précédent.
11. Prenez une image à l’aide des paramètres d’exposition automatique avec un seuil de signal minimum de 6 000 points. L’imagerie de fluorescence Cy5.5 permet de visualiser la localisation de MN-anti-miR10b. L’exposition automatique capturera une image dont la durée d’exposition sera calculée en fonction du signal le plus lumineux visible jusqu’à la durée maximale de 5 min définie par l’utilisateur.
    REMARQUE : L’imagerie par fluorescence prend rarement plus de 1 minute d’exposition, même chez les souris témoins injectées de PBS. Une seule image est toujours suffisante car la déviation du signal entre les souris traitées est faible.
12. Retirez la souris de l’IVIS après l’imagerie. Surveiller jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli de l’anesthésie et de l’ambulatoire.

6. Imagerie par résonance magnétique in vivo

REMARQUE : L’imagerie par résonance magnétique est réalisée avant et 24 h après l’injection de nanoparticules et peut être réalisée chez les mêmes animaux qui subissent une imagerie optique et de bioluminescence.

1. Anesthésier la souris sujette dans une boîte d’induction sous 2 % à 4 % d’isoflurane pour l’induction et 1,5 % à 2 % pour l’entretien avec un débit de 1,5 L/min. Une fois anesthésiée, placez la souris couchée sur le lit d’IRM au-dessus du ballonnet de surveillance respiratoire. Ajustez le cône nasal bien ajusté au museau pour administrer l’anesthésie pendant l’imagerie et appliquez une pommade ophtalmique pour les yeux.
2. Immobilisez et positionnez la tête pour le balayage à l’aide d’une barre d’occlusion et de barres d’oreille.
3. Installez la sonde de température rectale lubrifiée et assurez-vous que la surveillance de la respiration et de la température fonctionnent. Positionnez la bobine de cerveau de souris sur la tête en ajustant les chevilles du lit de souris dans les trous de la bobine et collez la bobine en place pour réduire les mouvements pendant le balayage.
4. Placez un petit tampon de circulation d’eau chaude sur le dessus de la souris pour maintenir la température corporelle pendant l’anesthésie. Prenez soin de prévoir une certaine distance entre la bobine et la couverture chauffante pour limiter la distorsion de l’image par les interférences de l’eau.
5. Déplacez la souris et le lit d’imagerie en position pour la numérisation.
6. Réglez et faites correspondre les bobines IRM en démarrant l’étape de configuration de Wobble dans le logiciel d’acquisition. À l’extrémité de service de l’IRM, utilisez les boutons de réglage et d’allumage de la bobine pour vous assurer que la trace est centrée (accordage) et aussi profonde que possible (correspondance).
7. Acquérez un balayage d’alignement de piste à trois plans et ajustez le lit d’imagerie pour positionner le cerveau à l’isocentre de l’aimant, si nécessaire.
8. Acquérez des scans pondérés 2D T₂ pour détecter l’agent injecté dans la tumeur avec les paramètres suivants : temps de répétition (TR) = 2500 ms, temps d’écho (TE) = 25 ms, champ de vision (FOV) 20 x 20 mm, 18 coupes coronales, écart de coupe de 0,2 mm, résolution dans le plan de 150 x 150 μm, épaisseur de tranche de 0,5 mm.
9. Obtenez une carte B0 de l’ensemble du cerveau pour calculer une cale localisée à l’aide de l’utilitaire Mapshim. Ensuite, utilisez des images pondérées 3D T₂ pour visualiser les nanoparticules avec TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 mm, résolution 100 μm isotrope.
10. Acquérez la carte T₂^* pour une imagerie supplémentaire des nanoparticules en utilisant l’image pondérée 2D T₂ comme référence pour le balayage de position sur la tumeur. Utilisation TR = 800 ms, TE = 3,5 ms. FOV 20 x 20 mm, 5 coupes coronales, pas d’écart de tranche. Résolution dans le plan 100 μm dans le plan. Acquérez 10 images d’écho positives avec un espacement temporel d’écho de 5 ms.
11. Surveillez la respiration et la température corporelle tout au long des séquences d’imagerie et ajustez l’isoflurane et la température de l’eau si nécessaire.
12. Après l’imagerie, retirez la souris de l’appareil d’IRM et placez-la dans une cage de récupération chauffée. Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie et de l’ambulatoire.

7. Imagerie de bioluminescence et de fluorescence ex vivo

1. Effectuer une imagerie de bioluminescence et de fluorescence ex vivo dans l’IVIS, similaire à l’imagerie in vivo . Effectuez les étapes d’initialisation et de réglage de l’analyse IVIS comme décrit ci-dessus.
2. Au point final expérimental, peser la souris et calculer le volume de D-luciférine à administrer pour une dose de 150 mg/kg. Injectez la dose de D-luciférine et effectuez une imagerie en direct 10 minutes après l’injection, comme décrit précédemment.
3. Après l’imagerie finale de bioluminescence et de fluorescence in vivo , euthanasiez rapidement la souris par luxation cervicale alors qu’elle était encore sous anesthésie, disséquez la souris et collectez les principaux organes, y compris le cerveau, sur une boîte de Pétri.
4. Placez la boîte de Pétri avec les organes excisés dans le scanner IVIS et imagez les organes avec des modalités de bioluminescence et de fluorescence en utilisant les mêmes paramètres d’acquisition que l’imagerie in vivo .
5. Congelez rapidement tous les organes nécessaires à une analyse plus approfondie en OCT en abaissant lentement le cryomoule avec l’échantillon dans l’OCT dans une piscine peu profonde d’azote liquide à l’aide d’une longue pince jusqu’à ce que l’OCT devienne complètement blanc. Ne laissez pas l’azote liquide entrer en contact avec l’OCT liquide ou abaissez le moule trop rapidement, car des bulles de l’OCT se produiront. Conservez les échantillons congelés à -80 °C.
6. Stockez le cerveau contenant la tumeur dans l’OCT et la congélation instantanée pour la cryosection. Conserver à -80 °C jusqu’à ce que vous ayez besoin d’analyse.

8. Microscopie à fluorescence

1. Préparez le cryostat pour la cryosection. Réglez la température de la chambre et de la tête de l’échantillon entre -15 °C et -20 °C.
2. Sortez le cerveau congelé en OCT du stockage à -80 °C et placez-le à l’intérieur de la chambre du cryostat. Laissez les échantillons se réchauffer à la température de la chambre (-20 °C) avant de les sectionner.
3. À l’aide d’un rasoir à un seul tranchant, on a coupé le cerveau coronalement au site d’injection. Ceci est généralement visible sous la forme d’une fossette à la surface du cerveau. Montez l’échantillon sur le disque de l’échantillon à l’aide d’une petite quantité d’OCT pour positionner le côté coupé du cerveau à sectionner. Appliquez une pression suffisante avec le poids refroidi à l’intérieur de la chambre pour assurer un montage stable de l’échantillon.
4. Déplacez l’échantillon monté et le disque d’échantillon sur la tête d’échantillon en préparation du sectionnement. Coupez le tissu à la profondeur souhaitée en prenant des sections de 20 μm, en ajustant l’angle de l’échantillon pour sectionner le tissu aussi près que possible du niveau du tissu.
5. Une fois que la profondeur de tissu souhaitée a été atteinte, ajustez le cryostat pour prendre des sections de 5 à 7 μm de l’échantillon. Montez les sections sur des lames de verre pré-étiquetées avec des descripteurs tels que l’identification de la souris, le tissu sectionné et le numéro de la lame en abaissant rapidement le côté chargé de la lame de microscope sur la section.
6. Préparez du paraformaldéhyde frais à 4 % (PFA). Immergez la lame avec du tissu dans la solution de PFA pendant 15 minutes pour fixer le tissu. Rincez la lame avec DPBS 3x après fixation.
7. À la section de tissu maintenant fixée sur la lame de verre, ajoutez une goutte de 40 μL de milieu de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), qui colore les noyaux cellulaires. Placez avec précaution une lamelle en verre de 24 mm x 50 mm sur le support de montage et assurez-vous que tout le tissu a été enfermé dans le support de montage.
8. Visualisez le tissu à l’aide de la microscopie à fluorescence DAPI (émission (em) à 359 nm, excitation (ex) à 457 nm) et Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm).

Résultats

MN-anti-miR10b a été synthétisé et caractérisé, comme décrit précédemment¹¹. La microscopie électronique à transmission de MN-anti-miR10b montre la morphologie et la polydispersité de la nanoplateforme (Figure 1B). Cette nano-plate-forme a une taille moyenne de 25,12 ± 0,34 nm avec un potentiel zêta de 13,18 ± 1,47 mV (Figure 1C,D). Dans ces études, des so...

Discussion

Plusieurs étapes critiques à travers les différentes méthodes de validation de l’accumulation des nanoparticules à travers la BHE peuvent être décisives pour le succès du protocole. En commençant par l’implantation orthotopique de cellules GBM, il est important de s’assurer que les lignes de suture du crâne sont visibles après séchage de l’os ; Cela aide au placement précis des cellules tumorales. Pour percer le crâne, il est préférable d’appliquer une légère ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery