多形性胶质母细胞瘤动物模型中寡核苷酸有效载荷的纳米颗粒递送

摘要

血脑屏障是胶质母细胞瘤治疗的一个重大障碍，胶质母细胞瘤是一种无法治愈的疾病。在这里，我们 报道了一种 体内图像引导的氧化铁治疗性纳米平台，该平台可以凭借大小绕过这一生理屏障并在肿瘤中积累。

摘要

多形性胶质母细胞瘤 （GBM） 是原发性脑恶性肿瘤最常见和最具侵袭性的形式，目前尚无治愈方法。血脑屏障是向 GBM 提供治疗的重大障碍。这里报道的是一个图像引导的、基于氧化铁的治疗递送纳米平台，能够凭借大小绕过这一生理屏障并在肿瘤区域积累，传递其有效载荷。该 25 nm 纳米平台由交联葡聚糖包被的氧化铁纳米颗粒组成，用 Cy5.5 荧光染料标记，并含有反义寡核苷酸作为有效载荷。磁性氧化铁芯可通过 体内磁共振 成像跟踪纳米颗粒，而 Cy5.5 染料可通过光学成像进行跟踪。本报告详细介绍了静脉注射后该纳米颗粒平台（称为 MN-anti-miR10b）在原位植入的胶质母细胞瘤肿瘤中的积累监测。此外，它还提供了对 RNA 寡核苷酸 体内递送的 见解，这是一个阻碍 RNA 治疗药物向临床转化的问题。

引言

多形性胶质母细胞瘤 （GBM） 是最高级别的星形细胞瘤，几乎没有治愈方法。每年约有 15,000 人被诊断出患有胶质母细胞瘤，中位生存期约为 15 个月，5 年生存率为 5%^1。在过去的几十年里，尽管做出了多种努力来推进治疗选择，但预后仍略有改善。目前 GBM 的护理标准包括在可行的情况下进行最大手术切除，然后进行放疗和化疗²。替莫唑胺 （TMZ） 是首选化疗药物，是胶质母细胞瘤的最新疗法，被发现显示出显着的临床疗效;然而，至少 50% 的 GBM 肿瘤显示 TMZ 耐药³。尽管有这种严格的治疗方案，但临床上仍然存在对改进胶质母细胞瘤治疗的重大需求。

血脑屏障 （BBB） 的选择性严重阻碍了 GBM 和其他脑相关疾病的疗法开发。BBB 是由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞脚端组成的生理屏障，它在循环系统和大脑之间形成半透膜，限制分子和细胞自由进入大脑⁴。虽然 BBB 在正常生理机能中具有保护作用并且对大脑稳态至关重要，但它会阻止许多疗法到达大脑，使 GBM 的治疗复杂化。加强向 GBM 提供治疗药物的努力导致了基于纳米颗粒的递送载体、聚焦超声药物递送增强和受体介导的药物递送的发展

研究方案

所有涉及动物受试者的程序均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。在 7 周龄时从 Jackson Labs（菌株 #007850）购买雌性近交无胸腺裸鼠，并在植入手术前 1 周适应。小鼠植入时约为 21-25 g。表达萤火虫荧光素酶的 U251 细胞由 Ana deCarvalho 博士生成并提供¹²。

1. 细胞培养和植入准备

1. 在含有 D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠并补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养荧光素酶标记的人胶质母细胞瘤细胞 U251，在 37 °C 和 5% CO₂ 下。
2. 一旦细胞达到 70% 汇合，在 37 °C 下用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 胰蛋白酶消化 1-2 分钟。 T-75 培养瓶使用 2-4 mL，T-175 培养瓶使用 4-6 mL。
3. 细胞从培养瓶中分离后，用 2：1 比例的补充 DMEM 淬灭反应，并通过移液轻轻混合，将细胞解离成单细胞悬液。将细胞转移到锥形管中，并以 300 x g 离心 5 分钟使细胞沉淀。
4. 小心吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于 1x 磷酸盐....

讨论

验证纳米颗粒在 BBB 中积累的不同方法中的几个关键步骤对于方案的成功可能具有决定性意义。从 GBM 细胞的原位植入开始，重要的是要确保在干燥骨骼后可以看到颅骨的缝合线;这有助于肿瘤细胞的准确放置。要钻穿颅骨，最好对钻孔部位施加轻微的压力并开始钻孔，以在骨骼中留下浅印。一旦在正确的位置做出初始标记，就更容易钻孔，钻孔滑移最小。突破颅骨后立即?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery