多形性胶质母细胞瘤动物模型中寡核苷酸有效载荷的纳米颗粒递送

摘要

血脑屏障是胶质母细胞瘤治疗的一个重大障碍，胶质母细胞瘤是一种无法治愈的疾病。在这里，我们 报道了一种 体内图像引导的氧化铁治疗性纳米平台，该平台可以凭借大小绕过这一生理屏障并在肿瘤中积累。

摘要

多形性胶质母细胞瘤 （GBM） 是原发性脑恶性肿瘤最常见和最具侵袭性的形式，目前尚无治愈方法。血脑屏障是向 GBM 提供治疗的重大障碍。这里报道的是一个图像引导的、基于氧化铁的治疗递送纳米平台，能够凭借大小绕过这一生理屏障并在肿瘤区域积累，传递其有效载荷。该 25 nm 纳米平台由交联葡聚糖包被的氧化铁纳米颗粒组成，用 Cy5.5 荧光染料标记，并含有反义寡核苷酸作为有效载荷。磁性氧化铁芯可通过 体内磁共振 成像跟踪纳米颗粒，而 Cy5.5 染料可通过光学成像进行跟踪。本报告详细介绍了静脉注射后该纳米颗粒平台（称为 MN-anti-miR10b）在原位植入的胶质母细胞瘤肿瘤中的积累监测。此外，它还提供了对 RNA 寡核苷酸 体内递送的 见解，这是一个阻碍 RNA 治疗药物向临床转化的问题。

引言

多形性胶质母细胞瘤 （GBM） 是最高级别的星形细胞瘤，几乎没有治愈方法。每年约有 15,000 人被诊断出患有胶质母细胞瘤，中位生存期约为 15 个月，5 年生存率为 5%^1。在过去的几十年里，尽管做出了多种努力来推进治疗选择，但预后仍略有改善。目前 GBM 的护理标准包括在可行的情况下进行最大手术切除，然后进行放疗和化疗²。替莫唑胺 （TMZ） 是首选化疗药物，是胶质母细胞瘤的最新疗法，被发现显示出显着的临床疗效;然而，至少 50% 的 GBM 肿瘤显示 TMZ 耐药³。尽管有这种严格的治疗方案，但临床上仍然存在对改进胶质母细胞瘤治疗的重大需求。

血脑屏障 （BBB） 的选择性严重阻碍了 GBM 和其他脑相关疾病的疗法开发。BBB 是由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞脚端组成的生理屏障，它在循环系统和大脑之间形成半透膜，限制分子和细胞自由进入大脑⁴。虽然 BBB 在正常生理机能中具有保护作用并且对大脑稳态至关重要，但它会阻止许多疗法到达大脑，使 GBM 的治疗复杂化。加强向 GBM 提供治疗药物的努力导致了基于纳米颗粒的递送载体、聚焦超声药物递送增强和受体介导的药物递送的发展 ^5,6。

纳米颗粒已成为开发包括癌症在内的多种疾病疗法的有前途的媒介。已尝试使用各种纳米颗粒构建体将纳米颗粒应用于 GBM 中的成像和治疗目的 ^7,8。为了将药物递送到 GBM 并结合递送的体内成像，所提出的方法利用由氧化铁核心组成并被葡聚糖覆盖以实现稳定性的磁性纳米颗粒 （MN）。这些纳米颗粒的磁性使其能够通过磁共振 （MR） 成像进行检测，而与胺化葡聚糖涂层的简单共轭化学允许结合治疗部分，例如 RNA 分子、额外的靶向部分或成像部分（例如 Cy5.5 近红外光学染料）^9,10.除了成像功能外，纳米平台还能够通过保护寡核苷酸免受内源性核酸酶的侵害来延长 RNA 疗法的半衰期，从而改善治疗递送。在这里，介绍了这种纳米平台在体内将治疗性寡核苷酸（称为 MN-anti-miR10b）递送到 GBM 中的应用，并通过体内成像进行监测。以前，这种纳米平台的积累能力在体外 GBM 细胞中得到证实，导致肿瘤细胞活力显着丧失¹¹。在进行治疗性体内研究之前，有必要在动物模型中证明该纳米平台在体内递送至 GBM 肿瘤。为此，制作了原位 GBM 动物模型，并进行了构建体的静脉内给药，然后进行了体内成像。此处概述了这些研究的方案，这些研究显示通过体内成像和离体显微镜证实了肿瘤区域的积累。

研究方案

所有涉及动物受试者的程序均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。在 7 周龄时从 Jackson Labs（菌株 #007850）购买雌性近交无胸腺裸鼠，并在植入手术前 1 周适应。小鼠植入时约为 21-25 g。表达萤火虫荧光素酶的 U251 细胞由 Ana deCarvalho 博士生成并提供¹²。

1. 细胞培养和植入准备

1. 在含有 D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠并补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养荧光素酶标记的人胶质母细胞瘤细胞 U251，在 37 °C 和 5% CO₂ 下。
2. 一旦细胞达到 70% 汇合，在 37 °C 下用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 胰蛋白酶消化 1-2 分钟。 T-75 培养瓶使用 2-4 mL，T-175 培养瓶使用 4-6 mL。
3. 细胞从培养瓶中分离后，用 2：1 比例的补充 DMEM 淬灭反应，并通过移液轻轻混合，将细胞解离成单细胞悬液。将细胞转移到锥形管中，并以 300 x g 离心 5 分钟使细胞沉淀。
4. 小心吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。用血细胞计数器使用台盼蓝染色对细胞进行计数，以排除死细胞并计算活细胞的总数。如上所述，再次沉淀细胞。
5. 在 PBS 中将细胞沉淀重悬至 1 x 10⁸ 个细胞/mL 的浓度，并将细胞悬液储存在冰上以进行颅内植入。

2. 徒手原位肿瘤植入术

注意：该协议改编自 Irtenkauf 等人（Ana deCarvalho 博士的程序;Henry Ford Health Hermelin 脑肿瘤中心）¹²。所有步骤都应在生物安全柜中进行，以确保受试者和研究人员的安全。徒手植入方法允许更快的手术以获得更大的样本量，同时保持颅内植入的质量。或者，可以使用立体定位装置在下面描述的相同坐标处植入肿瘤。

1. 称量裸体、无胸腺的小鼠，并用 100G 注射器腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪 （100 mg/kg/10mg/kg） 的麻醉溶液 （28 mg/kg）。将鼠标放在加热垫顶部的恢复笼中以保持体温。通过检查踏板反射来确认麻醉。
2. 涂抹眼药膏，用 5G 注射器皮下注射酮洛芬 （28 mg/kg），并打耳孔。
3. 用 70% 乙醇对头顶的手术部位进行消毒，然后用 betadine 擦洗并重复 3 次。然后，用小手术剪刀在头部中线右侧做一个 5-7 毫米的切口，并用细镊子缩回皮肤，露出颅骨的颅骨和缝合线。
4. 用棉签擦洗颅骨以去除骨膜，从而进入骨骼。使用新棉签涂抹 3% 过氧化氢溶液以干燥骨头。使用新的棉签擦去多余的过氧化氢和可能形成的任何泡沫。重复此步骤 3 次，直到前囟在颅骨上可见并且骨骼足够干燥以进行钻孔。足够干燥的颅骨将具有明显变白的缝合线，并且从最初的外观开始就减少了发红。
5. 关于前囟，用尺子测量内侧/外侧 -2.5 毫米和前/后 -1 毫米，并用记号笔标记钻孔部位。钻孔前再次测量以确保标记位于正确的位置。
6. 取带有 11,000 毫米钻头毛刺的电动显微手术钻 （0.5 RPM），小心地在先前标记的颅骨上打一个孔。用新鲜棉签吸收可能在钻孔现场积聚的任何血液或液体。
7. 准备一个装有针套的 33 G 微升注射器，外露针头长度为 3 毫米。用移液管短暂重悬后，吸取 5 μL 先前制备的 1 x 10⁸ 个细胞/mL 细胞悬液，并确保注射溶液中没有气泡。用 70% 异丙醇擦拭布小心擦去针头和针套外部残留的多余细胞悬液。
8. 将针垂直插入钻孔部位，直到针套停止进一步插入针。小心地将针头缩回约 0.5 毫米，为注射的细胞创造空间以积累。
9. 在 1 分钟内缓慢注射细胞悬液。注射满体积后，将针头保持在深度再一分钟，以减少注射液的流出。然后，小心地缩回针头。
10. 用干净的棉签擦去注射部位积聚的任何液体，然后涂上骨蜡密封孔。
11. 用兽医粘合剂封闭切口并使其干燥。用干净的棉签涂抹局部利多卡因作为镇痛药。
12. 监控鼠标，直到完全恢复和可以走动。植入后皮下注射酮洛芬 （5 mg/kg） 2 天以控制疼痛。

3. 纳米颗粒平台合成

1. 如前所述，用 Cy5.5 和寡核苷酸（抗 miR10b）合成和偶联纳米颗粒¹¹。

4. MN 抗 miR10b 给药

注意：在本研究中，从植入后 7 天开始，每周注射一次，持续 6 周，但相同的方案可用于各种注射频率。

1. 称量小鼠并计算要施用给小鼠的 MN 抗 miR10b 的体积。在小鼠GBM模型中，MN抗miR10b的剂量为20mg Fe / kg。例如，一只 20 g 小鼠接受 80 μL 剂量的 5 mg Fe/mL MN-抗 miR10b。对照小鼠接受与该剂量方案一致的等体积的 PBS。
2. 准备 28G 剂量为 MN-anti-miR10b 的注射器，确保注射液中没有气泡。
3. 在诱导箱中以 1.5 L/min 的流速在 2%-4% 异氟醚下麻醉小鼠用于诱导和 1.5%-2% 用于维持。将鼠标移动到鼻锥并继续进行麻醉。检查麻醉深度并涂抹兽医药膏。
4. 用 70% 异丙醇湿巾对尾部消毒，并让多余的酒精干燥。
5. 旋转尾部以将尾侧静脉定位到尾部顶部。然后，瞄准静脉，将针头插入尾部并通过拉回柱塞建立真空。
6. 插入针头，直到血液进入注射器，表明成功进入静脉。
7. 缓慢注射 MN-anti-miR10b 并在完全分娩后缩回针头。用纱布对注射部位施加压力，直到出血停止。
8. 从鼻锥中取出鼠标。监控鼠标，直到完全恢复和可以走动。
   注意：纳米颗粒的推注给药可能会导致呼吸窘迫。仔细监测小鼠，如果有呼吸窘迫的迹象，请立即进行轻微的胸外按压。

5. 体内 生物发光和荧光成像

注意：在注射纳米颗粒之前和之后 24 小时，在体内成像系统 （IVIS） 中进行体内生物发光和荧光成像。

1. 在不含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的 PBS 中制备浓度为 30 mg/mL 的无菌过滤 D-荧光素。
2. 打开 IVIS 操作软件并开始初始化以准备本机。在系统初始化时，通过选择 采集>自动保存到 来选择要保存图像的文件夹，然后定义要保存的文件的文件夹。
3. 在成像时间点，称量小鼠并计算 D-荧光素的体积，剂量为 150 mg/kg。准备一个 28G 容量的注射器，保护溶液免受阳光直射。这项研究包括植入手术后 2 天的影像学检查以确认接种，并在植入后第 7 天开始每周成像，然后再进行每周治疗。
4. 在诱导室中，在 2%-4% 异氟醚下麻醉小鼠用于诱导，在 1.5%-2% 下用于维持。麻醉后，轻轻擦拭鼠标以避免进一步伤害手术部位，并腹膜内注射 D-荧光素的剂量。让鼠标恢复并等待 10 分钟后再成像，以使生物发光信号发展和稳定。
5. 在生物发光信号发展的同时，准备用于生物发光成像的 IVIS 扫描仪。将黑色低荧光垫放在成像台上，并为要成像的受试者数量配置鼻锥阵列。
6. 在软件中，单击 Imaging Wizard（成像向导）。选择 Bioluminescence Imaging（生物发光成像 ），然后选择 Open Filter（打开过滤器）。在下一个屏幕上，选择 Imaging Subject and Field of View。IVIS 现在已设置为生物发光成像。
7. 在成像前 3 分钟，让异氟醚/氧混合物填充盒子，开始灌注感应盒。成像前 2 分钟，将小鼠放入诱导箱中进行麻醉。
8. 麻醉后，将小鼠从诱导盒移至 IVIS 进行成像，并将每只小鼠置于俯卧位。在成像过程中使用 2% 异氟醚提供维持麻醉。
9. 将小鼠放入 IVIS 扫描仪后，单击 Acquire Sequence。使用最小信号阈值为 3,000 个计数的自动曝光设置拍摄图像。生物发光成像可视化了荧光素酶标记的 U251 胶质母细胞瘤细胞的定位。自动曝光将捕获图像，其曝光长度根据视图中最亮的信号计算，最长可达用户定义的最大长度 5 分钟。
   注意：典型的小鼠笼子需要单个图像，因为接种通常是均匀的。在有一只或多只明亮小鼠的情况下，可以移除小鼠，并可以进行重复采集以更好地捕获来自暗淡小鼠的信号。
10. 生物发光成像后，更改 IVIS 设置以准备落射荧光成像并进行荧光扫描。
    1. 在 Imaging Wizard（成像向导）中，选择 Fluorescence > Filtered Pair with Epi-Illumination（荧光 Filtered Pair with Epi-Illumination）。在下一个屏幕中，选择要成像的探针，例如 Cy5.5。选择成像主体和视野。现在，IVIS 扫描仪已设置为对上一个屏幕中选择的探针进行荧光成像。
11. 使用最小信号阈值为 6,000 个计数的自动曝光设置拍摄图像。Cy5.5 荧光成像可视化了 MN 抗 miR10b 的定位。自动曝光将捕获图像，其曝光长度根据视图中最亮的信号计算，最长可达用户定义的最大长度 5 分钟。
    注意：荧光成像很少需要超过 1 分钟的曝光时间，即使在注射 PBS 的对照小鼠中也是如此。单个图像总是足够的，因为治疗小鼠之间的信号偏差很小。
12. 成像后从 IVIS 中取出鼠标。监测直到从麻醉和门诊中完全恢复。

6. 体内 磁共振成像

注：MR 成像在纳米颗粒注射之前和之后 24 小时进行，并且可以在接受光学和生物发光成像的相同动物中进行。

1. 在 2%-4% 异氟醚下，以 1.5 L/min 的流速在 2%-4% 异氟醚和 1.5%-2% 的维持下，在诱导箱中麻醉受试者小鼠。麻醉后，将小鼠俯卧在呼吸监测球囊顶部的 MRI 床上。将鼻锥紧贴鼻子，以便在成像过程中提供麻醉并涂抹眼药膏。
2. 使用咬杆和耳杆固定并定位头部以进行扫描。
3. 安装润滑的直肠温度探头，并确保呼吸和温度监测正常工作。将鼠标床上的钉子安装到线圈上的孔中，将鼠标脑线圈放在头上，然后将线圈用胶带固定到位，以减少扫描过程中的移动。
4. 在鼠标顶部放置一个小的温水循环垫，以在麻醉时保持体温。注意在线圈和加热毯之间留出一定的距离，以限制水干扰对图像的扭曲。
5. 将鼠标和成像床移动到扫描位置。
6. 通过在采集软件中启动 Wobble 设置步骤来调整和匹配 MRI 线圈。在 MRI 的服务端，使用线圈上的 tune 和 match 旋钮确保迹线居中 （调谐） 并尽可能深入 （match）。
7. 如有必要，获取三平面定位器扫描并调整成像床以将大脑定位在磁体的等中心。
8. 获取 2D T₂ 加权扫描以使用以下参数检测肿瘤中注射的试剂：重复时间 （TR） = 2500 ms，回波时间 （TE） = 25 ms，视野 （FOV） 20 x 20 mm，18 个冠状切片，0.2 mm 切片间隙，150 x 150 μm 平面内分辨率，0.5 mm 切片厚度。
9. 获取整个大脑的 B0 映射，以使用 Mapshim 实用程序计算局部填充码。然后，使用 3D T₂ 加权图像以 TR = 30 ms、TE = 10 ms、FOV 20 x 15 x 12 mm、分辨率 100 μm 各向同性可视化纳米颗粒。
10. 使用 2D T₂ 加权图像作为肿瘤位置扫描的参考，获取 T₂^* 图以进行进一步的纳米颗粒成像。使用 TR = 800 毫秒，TE = 3.5 毫秒。FOV 20 x 20 毫米，5 个冠状切片，无切片间隙。平面分辨率 平面内 100 μm。采集 10 张回波图像，回波时间间隔为 5 ms。
11. 在整个成像序列中监测呼吸和体温，并在必要时调整异氟醚和水温。
12. 成像后，从 MRI 扫描仪中取出鼠标并将其放入加热的恢复笼中。监测鼠标，直到它从麻醉和门诊中完全恢复。

7. 离体 生物发光和荧光成像

1. 在 IVIS 中进行 离体 生物发光和荧光成像，类似于 体内 成像。如上所述执行 IVIS 初始化和扫描设置步骤。
2. 在实验终点，称量小鼠并计算 D-荧光素的体积，剂量为 150 mg/kg。如前所述，注射 D-荧光素剂量并在注射后 10 分钟进行实时成像。
3. 在最终 体内 生物发光和荧光成像后，在麻醉下通过颈椎脱位快速对小鼠实施安乐死，解剖小鼠，并将包括大脑在内的主要器官收集在培养皿上。
4. 将带有切除器官的培养皿放入 IVIS 扫描仪中，并使用与 体内 成像相同的采集设置以生物发光和荧光模式对器官进行成像。
5. 用长镊子将装有 OCT 样品的低温模具缓慢放入浅液氮池中，直到 OCT 完全变白，从而快速冷冻在 OCT 中进一步分析所需的任何器官。不要让液氮接触液体 OCT 或过快降低模具，否则 OCT 会发生鼓泡。将冷冻样品储存在 -80 °C。
6. 将含有肿瘤的大脑储存在 OCT 中并快速冷冻以进行冷冻切片。储存在 -80 °C 直到需要分析。

8. 荧光显微镜

1. 准备用于冷冻切片的低温恒温器。将腔室和样品头温度设置在 -15 °C 和 -20 °C 之间。
2. 将 OCT 中的快速冷冻大脑从 -80 °C 储存中取出，并将其放入低温恒温器室内。切片前让样品升温至腔室温度 （-20 °C）。
3. 使用单刃剃须刀在注射部位冠状切割大脑。这通常在大脑表面可见为酒窝。使用少量 OCT 将样品固定在标本盘上，以定位要切片的大脑的切割侧。在腔室内使用冷却砝码施加足够的压力，以确保样品的稳定安装。
4. 将已安装的样品和标本盘移动到标本头上，为切片做准备。通过取 20 μm 切片将组织修剪至所需深度，调整样品的角度，使组织切片尽可能接近与组织齐平。
5. 达到所需的组织深度后，调整低温恒温器以取 5 - 7 μm 的样品切片。通过将显微镜载玻片的带电侧快速降低到切片上，将切片安装到预先标有描述符（如小鼠 ID、组织切片和载玻片编号）的载玻片上。
6. 制作新鲜的 4% 多聚甲醛 （PFA）。将载玻片与组织一起浸入 PFA 溶液中 15 分钟以固定组织。固定后用 DPBS 冲洗载玻片 3 次。
7. 在载玻片上现已固定的组织切片中，加入一滴 40 μL 含有 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的封固剂，可对细胞核进行染色。小心地将 24 mm x 50 mm 玻璃盖玻片放在封固剂顶部，并确保整个组织都包裹在封固剂中。
8. 使用 DAPI（359 nm 发射 （em），457 nm 激发 （ex））和 Cy5.5（ex 683 nm，em 703 nm）荧光显微镜观察组织。

结果

如前所述，合成并表征了 MN 抗 miR10b¹¹。MN 抗 miR10b 的透射电子显微镜显示了纳米平台的形态和多分散性（图 1B）。该纳米平台的平均尺寸为 25.12 ± 0.34 nm，zeta 电位为 13.18 ± 1.47 mV（图 1C、D）。在这些研究中，按照上述方案原位植入裸体无胸腺小鼠 U251 人胶质母细胞瘤细胞。全身静脉?...

讨论

验证纳米颗粒在 BBB 中积累的不同方法中的几个关键步骤对于方案的成功可能具有决定性意义。从 GBM 细胞的原位植入开始，重要的是要确保在干燥骨骼后可以看到颅骨的缝合线;这有助于肿瘤细胞的准确放置。要钻穿颅骨，最好对钻孔部位施加轻微的压力并开始钻孔，以在骨骼中留下浅印。一旦在正确的位置做出初始标记，就更容易钻孔，钻孔滑移最小。突破颅骨后立即?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery