Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

Özet

Kan-beyin bariyeri, tedavisi olmayan bir hastalık olan glioblastoma için tedavilerin uygulanmasında önemli bir engeldir. Burada, boyut nedeniyle bu fizyolojik bariyeri atlayabilen ve tümör içinde birikebilen in vivo görüntü kılavuzluğunda demir oksit terapötik nano bir platform sunuyoruz.

Özet

Glioblastoma multiforme (GBM), tedavisi olmayan primer beyin malignitesinin en yaygın ve agresif formudur. Kan-beyin bariyeri, tedavilerin GBM'ye uygulanmasında önemli bir engeldir. Burada bildirilen, boyut ve tümör bölgesinde birikme nedeniyle bu fizyolojik engeli atlayabilen ve yükünü iletebilen, görüntü kılavuzlu, demir oksit bazlı bir terapötik dağıtım nano platformudur. Bu 25 nm nano platform, Cy5.5 floresan boya ile etiketlenmiş ve faydalı yük olarak antisens oligonükleotid içeren çapraz bağlı dekstran kaplı demir oksit nanopartiküllerinden oluşur. Manyetik demir oksit çekirdek, nanopartiküllerin in vivo manyetik rezonans görüntüleme yoluyla izlenmesini sağlarken, Cy5.5 boyası optik görüntüleme ile izlemeye izin verir. Bu rapor, intravenöz enjeksiyonu takiben ortotopik olarak implante edilen glioblastoma tümörlerinde bu nanopartikül platformunun (MN-anti-miR10b olarak adlandırılır) birikiminin izlenmesini detaylandırır. Ek olarak, RNA terapötiklerinin kliniğe çevrilmesini engelleyen bir sorun olan RNA oligonükleotidlerinin in vivo iletimi hakkında bilgi sağlar.

Giriş

Glioblastoma multiforme (GBM), neredeyse tedavisi olmayan en yüksek astrositom derecesidir. Yılda yaklaşık 15.000 kişiye glioblastoma teşhisi konmaktadır, bu da yaklaşık 15 aylık kasvetli bir medyan sağkalım ve 5 yıllık sağkalım oranı %^5'tir1. Son yıllarda, terapötik seçenekleri ilerletmek için çok sayıda çabaya rağmen prognozda marjinal bir iyileşme olmuştur. GBM için mevcut bakım standardı, mümkün olduğunda maksimal cerrahi rezeksiyonu, ardından radyoterapi ve kemoterapiyi içerir². Tercih edilen kemoterapi olan temozolomid (TMZ), kayda değer klinik etkinlik gösterdiği keşfedilen glioblastoma için en son tedaviydi; bununla birlikte, GBM tümörlerinin en az %50'si TMZ direnci gösterir³. Bu titiz terapötik rejime rağmen, gelişmiş glioblastoma tedavisi için hala önemli bir klinik ihtiyaç vardır.

GBM ve diğer beyinle ilgili hastalıklar için terapötiklerin geliştirilmesi, kan-beyin bariyerinin (BBB) seçici doğası nedeniyle önemli ölçüde engellenmektedir. BBB, dolaşım sistemi ile beyin arasında yarı geçirgen zarı oluşturan, moleküllerin ve hücrelerin beyne serbest geçişini kısıtlayan, endotel hücreleri, perisitler ve astrosit ayak uçlarından oluşan fizyolojik bir bariyerdir⁴. Normal fizyolojide koruyucu ve beyin homeostazı için kritik öneme sahip olan BBB, birçok terapötiğin beyne ulaşmasını engelleyerek GBM tedavisini zorlaştırır. Terapötiklerin GBM'ye verilmesini geliştirme çabaları, nanopartikül bazlı dağıtım araçlarının geliştirilmesine, odaklanmış ultrason ilaç dağıtımının geliştirilmesine ve reseptör aracılı ilaç dağıtımına^yol açmıştır ^5,6.

Nanopartiküller, kanserler de dahil olmak üzere sayısız hastalık için terapötik geliştirmek için umut verici bir ortam olarak ortaya çıkmıştır. Nanopartiküllerin GBM'de görüntüleme ve terapötik amaçlar için uygulanması, çeşitli nanopartikül yapıları ^7,8 kullanılarak denenmiştir. Teslimatın in vivo görüntülenmesi ile birlikte ilaçların GBM'ye verilmesine odaklanan önerilen yaklaşım, bir demir oksit çekirdeğinden oluşan ve stabilite için dekstran ile kaplanmış manyetik nanopartikülleri (MN) kullanır. Bu nanopartiküllerin manyetik özellikleri, manyetik rezonans (MR) görüntüleme ile tespit edilmelerini sağlarken, aminlenmiş dekstran kaplamaya basit konjugasyon kimyası, RNA molekülleri, ek hedefleme kısımları veya görüntüleme kısımları (Cy5.5 yakın kızılötesi optik boya gibi) gibi terapötik kısımların konjugasyonuna izin ^verir9,10. Görüntüleme yeteneklerine ek olarak, nano platform, oligonükleotidi endojen nükleazlardan koruyarak ve terapötik uygulamayı iyileştirerek RNA terapötiklerinin yarı ömrünü uzatabilir. Burada, terapötik oligonükleotidlerin (MN-anti-miR10b olarak adlandırılır) GBM'ye in vivo olarak verilmesi için bu nano platformun in vivo görüntüleme ile izlenmesi sunulmaktadır. Daha önce, bu nano platformun birikme kabiliyeti, in vitro GBM hücrelerinde gösterilmiş ve tümör hücrelerinin canlılığında önemli bir kayba neden olmuştur¹¹. Terapötik in vivo çalışmalar yapmadan önce, bu nano platformun hayvan modellerinde GBM tümörlerine in vivo olarak verildiğini göstermek gerekir. Bunu başarmak için, ortotopik GBM hayvan modelleri üretildi ve yapının intravenöz uygulaması yapıldı ve ardından in vivo görüntüleme yapıldı. Burada, in vivo görüntüleme ve ex vivo mikroskopi ile doğrulanan tümör bölgesinde birikimi gösteren bu çalışmaların protokolleri özetlenmiştir.

Protokol

Hayvan deneklerle ilgili tüm prosedürler Michigan Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dişi soylu atimik çıplak fareler, 7 haftalıkken Jackson Labs'tan (suş # 007850) satın alındı ve implantasyon ameliyatından önce 1 hafta boyunca alışmalarına izin verildi. Fareler implant sırasında yaklaşık 21-25 g idi. Ateşböceği lusiferazı eksprese eden U251 hücreleri, Dr. Ana deCarvalho¹² tarafından üretildi ve sağlandı.

1. Hücre kültürü ve implantasyon için hazırlık

1. Kültür lusiferaz etiketli, insan glioblastoma hücreleri, Dulbecco'nun D-glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat içeren Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) U251 ve% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile% 5 CO 2_ile% 37 ° C'de.
2. Hücreler %70 birleşmeye ulaştığında, 37 ° C'de 1-2 dakika boyunca% 0.25 tripsin / EDTA ile tripsine edin. Bir T-75 şişesi için 2-4 mL veya bir T-175 şişesi için 4-6 mL kullanın.
3. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, reaksiyonu 2: 1 oranında takviye edilmiş DMEM ile söndürün ve hücreleri tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için pipetleyerek nazikçe karıştırın. Hücreleri konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
4. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin. Ölü hücreleri dışlamak ve toplam canlı hücre sayısını hesaplamak için tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri bir hemositometre ile sayın. Hücreleri tekrar peletleyin, yukarıda tarif edildiği gibi.
5. Hücre peletini PBS'de 1 x 10⁸ hücre / mL konsantrasyona yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu intrakraniyal implantasyon için buz üzerinde saklayın.

2. Serbest el ortotopik tümör implantasyonu

NOT: Bu protokol Irtenkauf ve ark. (Dr. Ana deCarvalho'nun prosedürü; Henry Ford Sağlık Hermelin Beyin Tümörü Merkezi)¹². Hem denekler hem de araştırmacılar için güvenliği sağlamak için tüm adımlar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Serbest el implantasyon yöntemi, intrakraniyal implantasyonun kalitesini korurken daha büyük numune boyutları elde etmek için daha hızlı bir prosedüre izin verir. Alternatif olarak, tümörü aşağıda açıklanan aynı koordinatlarda implante etmek için stereotaksik bir cihaz kullanılabilir.

1. Çıplak, atimik fareyi tartın ve 28G şırınga ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla anestezik bir ketamin / ksilazin çözeltisi (100 mg / kg / 10 mg / kg) uygulayın. Vücut ısısını korumak için fareyi bir ısıtma yastığının üzerindeki bir kurtarma kafesine yerleştirin. Pedal refleksini kontrol ederek anesteziyi onaylayın.
2. Oftalmik göz merhemi uygulayın, ketoprofen'i (5 mg / kg) 28G şırınga ile deri altına uygulayın ve tanımlayıcı kulak zımbaları verin.
3. Başın üst kısmındaki cerrahi bölgeyi %70 etanol ile sterilize edin, ardından betadin fırçalayın ve 3 kez tekrarlayın. Daha sonra başın orta hattının sağına küçük cerrahi makaslarla 5-7 mm'lik bir kesi yapın ve kafatasının kafa ve dikiş hatlarını ortaya çıkarmak için cildi ince forsepslerle geri çekin.
4. Periosteumu çıkarmak için kafatasını pamuklu çubukla ovalayın ve kemiğe erişim sağlayın. Kemiği kurutmak için yeni bir pamuklu çubuk kullanarak% 3'lük bir hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın. Yeni bir pamuklu çubuk kullanarak fazla hidrojen peroksiti ve oluşabilecek köpüğü silin. Kafatasında bregma görünene ve kemik delme için yeterince kuruyana kadar bu adımı 3 kez tekrarlayın. Yeterince kuru bir kafatası, keskin bir şekilde beyazlatılmış dikiş hatlarına ve başlangıç görünümünden itibaren azaltılmış kızarıklığa sahip olacaktır.
5. Bregma ile ilgili olarak, bir cetvel ile -2,5 mm medial/lateral ve -1 mm ön/arka ölçün ve matkap bölgesini bir işaretleyici ile işaretleyin. İşaretin doğru konumda olduğundan emin olmak için delmeden önce tekrar ölçün.
6. 0,5 mm'lik matkap çapağı olan bir elektrikli mikro cerrahi matkabı (11.000 RPM) alın ve daha önce işaretlenmiş olan kafatasında dikkatlice bir delik açın. Matkap bölgesinde birikebilecek kan veya sıvıyı yeni bir pamuklu çubukla emdirin.
7. 3 mm'lik açıkta kalan iğne uzunluğuna kadar bir iğne manşonu ile donatılmış 33G mikrolitrelik bir şırınga hazırlayın. Bir pipetle kısa bir süre yeniden süspanse ettikten sonra önceden hazırlanmış 1 x 10⁸ hücre / mL hücre süspansiyonundan 5 μL çekin ve enjeksiyon solüsyonunda kabarcık olmadığından emin olun. İğnenin ve iğne manşonunun dışında kalan fazla hücre süspansiyonunu %70 izopropanol mendille dikkatlice silin.
8. İğne manşonu, iğnenin daha fazla yerleştirilmesini durdurana kadar iğneyi matkap bölgesine dikey olarak sokun. Enjekte edilen hücrelerin birikmesi için alan yaratmak için iğneyi yaklaşık 0,5 mm dikkatlice geri çekin.
9. Hücre süspansiyonunu 1 dakikalık bir süre boyunca yavaşça enjekte edin. Tam hacim enjekte edildikten sonra, enjeksiyon çözeltisinin akışını azaltmak için iğneyi bir dakika daha derinlikte tutun. Ardından iğneyi dikkatlice geri çekin.
10. Temiz bir pamuklu çubukla, enjeksiyon bölgesinde biriken sıvıyı silin ve ardından deliği kapatmak için kemik mumu uygulayın.
11. Kesiği bir veteriner bağı ile kapatın ve kurumasını bekleyin. Temiz bir pamuklu çubukla, analjezik olarak topikal lidokain uygulayın.
12. Tamamen iyileşene ve yürüyene kadar fareyi izleyin. Ağrı yönetimi için implantasyondan sonraki 2 gün boyunca deri altından ketoprofen (5 mg / kg) uygulayın.

3. Nanopartikül platform sentezi

1. Nanopartikülleri daha önce tarif edildiği gibi Cy5.5 ve oligonükleotid (anti-miR10b) ile sentezleyin ve konjuge^{edin 11}.

4. MN-anti-miR10b uygulaması

NOT: Bu çalışmada, enjeksiyonlar implantasyondan 7 gün sonra başlayarak 6 hafta boyunca haftada bir kez yapılmıştır, ancak aynı protokol çeşitli enjeksiyon frekansları için kullanılabilir.

1. Fareyi tartın ve fareye uygulanacak MN-anti-miR10b hacmini hesaplayın. MN-anti-miR10b dozları, murin GBM modellerinde 20 mg Fe / kg'da verilir. Örneğin, 20 g'lık bir fare, 80 μL'lik bir 5 mg Fe / mL MN-anti-miR10b dozu alır. Kontrol fareleri, bu dozaj şemasına uygun olarak eşit miktarda PBS alır.
2. MN-anti-miR10b dozu ile 28G'lik bir şırınga hazırlayın ve enjeksiyon solüsyonunda kabarcık olmadığından emin olun.
3. Bir indüksiyon kutusunda 1,5 L / dak akış hızı ile fareyi indüksiyon için %2-4 izofluran ve bakım için %1,5-%2 altında uyuşturun. Fareyi bir burun konisine getirin ve anestezi vermeye devam edin. Anestezi derinliğini kontrol edin ve veteriner merhemi uygulayın.
4. Kuyruğu %70 izopropanol mendille sterilize edin ve fazla alkolün kurumasını bekleyin.
5. Lateral kaudal damarları kuyruğun üst kısmına yerleştirmek için kuyruğu döndürün. Ardından, damarı hedefleyerek iğneyi kuyruğa sokun ve pistonu geri çekerek bir vakum oluşturun.
6. İğneyi, kan şırıngaya girene kadar sokun, bu da damara başarılı bir şekilde girildiğini gösterir.
7. MN-anti-miR10b'yi yavaşça enjekte edin ve teslimat tamamlandıktan sonra iğneyi geri çekin. Kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine gazlı bezle baskı uygulayın.
8. Fareyi burun konisinden çıkarın. Tamamen iyileşene ve yürüyene kadar fareyi izleyin.
   NOT: Nanopartiküllerin bolus uygulaması solunum sıkıntısına neden olabilir. Fareyi dikkatlice izleyin ve solunum sıkıntısı belirtileri varsa hemen hafif göğüs kompresyonları uygulayın.

5. İn vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme

NOT: İn vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme, nanopartikül enjekte edilmeden önce ve 24 saat sonra In Vivo Görüntüleme Sisteminde (IVIS) gerçekleştirilir.

1. Mg^{2 +} ve Ca^{2 +} olmadan PBS'de 30 mg / mL konsantrasyonda steril filtrelenmiş D-lusiferin hazırlayın.
2. IVIS işlem yazılımını açın ve makineyi hazırlamak için başlatmaya başlayın. Sistem başlatılırken, Edinme > Otomatik Kaydet'i seçerek görüntüleri kaydetmek için bir klasör seçin ve kaydedilecek dosyalar için klasörü tanımlayın.
3. Görüntüleme zaman noktalarında, fareyi tartın ve 150 mg / kg'lık bir dozaj için uygulanacak D-lusiferin hacmini hesaplayın. Çözeltiyi doğrudan ışıktan koruyarak hacimli 28G'lik bir şırınga hazırlayın. Bu çalışma, tohumlamayı doğrulamak için implantasyon ameliyatından 2 gün sonra görüntülemeyi içeriyordu ve haftalık görüntüleme, haftalık tedavilerden hemen önce implanttan sonraki 7. günde başladı.
4. Bir indüksiyon odasında 1,5 L / dk akış hızı ile fareyi indüksiyon için %2-4 izofluran ve bakım için %1,5-%2 altında anestezi altına uygulayın. Anestezi uygulandıktan sonra, cerrahi bölgenin daha fazla yaralanmasını önlemek için fareyi nazikçe fırçalayın ve D-lusiferin dozunu intraperitoneal olarak enjekte edin. Farenin iyileşmesine izin verin ve biyolüminesans sinyalinin gelişmesine ve stabilize olmasına izin vermek için görüntülemeden önce 10 dakika bekleyin.
5. Biyolüminesans sinyali gelişirken, IVIS tarayıcısını biyolüminesans görüntüleme için hazırlayın. Siyah düşük floresan matı görüntüleme tablasına yerleştirin ve burun konisi dizisini görüntülenecek konu sayısına göre yapılandırın.
6. Yazılımda, Imaging Wizard (Görüntüleme Sihirbazı) öğesine tıklayın. Biyolüminesans Görüntüleme'yi ve ardından Filtreyi Aç'ı seçin. Bir sonraki ekranda, Imaging Subject (Görüntüleme Konusu) ve Field of View (Görüş Alanı) öğesini seçin. IVIS artık biyolüminesans görüntüleme için ayarlanmıştır.
7. Görüntülemeden 3 dakika önce, izofluran / oksijen karışımının kutuyu doldurmasına izin vererek indüksiyon kutusunu astarlamaya başlayın. Görüntülemeden 2 dakika önce, fareleri anestezi için indüksiyon kutusuna yerleştirin.
8. Anestezi uygulandıktan sonra, fareleri görüntüleme için indüksiyon kutusundan IVIS'e taşıyın ve her birini yüzüstü pozisyonda yatırın. Görüntüleme sırasında% 2 izofluran kullanarak idame anestezisi sağlayın.
9. Fareler IVIS tarayıcıya yerleştirildikten sonra, Sırayı Al'a tıklayın. Minimum 3.000 sayım sinyal eşiği ile otomatik pozlama ayarlarını kullanarak bir görüntü çekin. Biyolüminesans görüntüleme, lusiferaz işaretli U251 glioblastoma hücrelerinin lokalizasyonunu görselleştirir. Otomatik pozlama, kullanıcı tarafından tanımlanan maksimum 5 dakikalık uzunluğa kadar, görüntüdeki en parlak sinyale göre hesaplanan pozlama uzunluğuna sahip bir görüntü yakalar.
   NOT: Tipik bir fare kafesi, tohumlama genellikle tek tip olduğu için tek bir görüntü gerektirir. Bir veya daha fazla parlak farenin olduğu durumlarda, fareler çıkarılabilir ve loş farelerden gelen sinyalleri daha iyi yakalamak için tekrar bir alım yapılabilir.
10. Biyolüminesans görüntülemeden sonra, epi-floresan görüntülemeyi hazırlamak ve floresan taramaları yapmak için IVIS ayarlarını değiştirin.
    1. Görüntüleme Sihirbazı'nda, Floresan > Epi-Aydınlatma ile Filtrelenmiş Çift'i seçin. Bir sonraki ekranda, Cy5.5 gibi görüntülenecek probları seçin. Görüntüleme konusunu ve görüş alanını seçin. IVIS tarayıcısı artık önceki ekranda seçilen probların floresan görüntülemesi için ayarlanmıştır.
11. Minimum 6.000 sayım sinyal eşiği ile otomatik pozlama ayarlarını kullanarak bir görüntü çekin. Cy5.5 floresan görüntüleme, MN-anti-miR10b'nin lokalizasyonunu görselleştirir. Otomatik pozlama, kullanıcı tarafından tanımlanan maksimum 5 dakikalık uzunluğa kadar, görüntüdeki en parlak sinyale göre hesaplanan pozlama uzunluğuna sahip bir görüntü yakalar.
    NOT: Floresan görüntüleme, kontrol PBS enjekte edilen farelerde bile nadiren 1 dakikadan daha uzun sürer. Tedavi edilen fareler arasındaki sinyal sapması küçük olduğu için tek bir görüntü her zaman yeterlidir.
12. Görüntülemeden sonra fareyi IVIS'ten çıkarın. Anestezi ve ayaktan tamamen iyileşene kadar izleyin.

6. İn vivo manyetik rezonans görüntüleme

NOT: MR görüntüleme, nanopartikül enjeksiyonundan önce ve 24 saat sonra yapılır ve optik ve biyolüminesans görüntülemeye tabi tutulan aynı hayvanlarda yapılabilir.

1. Denek fareyi, indüksiyon için %2-%4 izofluran ve bakım için %1,5-%2 altında 1,5 L/dk akış hızıyla bir indüksiyon kutusunda uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra, fareyi yüzüstü solunum izleme balonunun üzerindeki MRI yatağına yerleştirin. Görüntüleme sırasında anestezi sağlamak için burun konisini buruna sıkıca yerleştirin ve oftalmik göz merhemi uygulayın.
2. Bir ısırma çubuğu ve kulak çubukları kullanarak tarama için kafayı hareketsiz hale getirin ve konumlandırın.
3. Yağlanmış rektal sıcaklık probunu takın ve solunum ve sıcaklık izlemenin çalıştığından emin olun. Fare yatağındaki mandalları bobin üzerindeki deliklere takarak fare beyin bobinini başın üzerine yerleştirin ve tarama sırasında hareketi azaltmak için bobini yerine bantlayın.
4. Anestezi altındayken vücut ısısını korumak için farenin üstüne küçük bir ılık su sirkülasyon pedi yerleştirin. Su paraziti nedeniyle görüntünün bozulmasını önlemek için bobin ile ısıtma battaniyesi arasında biraz mesafe bırakmaya dikkat edin.
5. Fareyi ve görüntüleme yatağını tarama için uygun konuma getirin.
6. Alım yazılımındaki Wobble kurulum adımını başlatarak MRI bobinlerini ayarlayın ve eşleştirin. MRG'nin servis ucunda, izin ortalandığından (akort) ve mümkün olduğunca derin (eşleşme) olduğundan emin olmak için bobin üzerindeki ayar ve kibrit düğmelerini kullanın.
7. Üç düzlemli bir lokalizatör taraması edinin ve gerekirse beyni mıknatısın izomerkez noktasına konumlandırmak için görüntüleme yatağını ayarlayın.
8. Aşağıdaki parametrelerle tümöre enjekte edilen ajanı tespit etmek için 2D T₂ ağırlıklı taramalar elde edin: tekrarlama süresi (TR) = 2500 ms, yankı süresi (TE) = 25 ms, görüş alanı (FOV) 20 x 20 mm, 18 koronal dilim, 0,2 mm dilim aralığı, 150 x 150 μm düzlem içi çözünürlük, 0,5 mm dilim kalınlığı.
9. Mapshim yardımcı programını kullanarak lokalize bir şim hesaplamak için tüm beynin bir B0 haritasını edinin. Ardından, TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 mm, çözünürlük 100 μm izotropik olan nanopartikülleri görselleştirmek için 3D T₂ ağırlıklı görüntüleri kullanın.
10. Tümör üzerinde pozisyon taraması için referans olarak 2D T₂ ağırlıklı görüntüyü kullanarak daha fazla nanopartikül görüntüleme için T₂^* haritasını edinin. TR = 800 ms, TE = 3,5 ms kullanın. FOV 20 x 20 mm, 5 koronal dilim, dilim boşluğu yok. Düzlemde çözünürlük: Düzlemde 100 μm. 5 ms yankı zaman aralığı ile 10 pozitif yankı görüntüsü elde edin.
11. Görüntüleme dizileri boyunca solunumu ve vücut ısısını izleyin ve gerekirse izofluran ve su sıcaklığını ayarlayın.
12. Görüntülemeden sonra, fareyi MRI tarayıcısından çıkarın ve ısıtılmış bir kurtarma kafesine yerleştirin. Anesteziden ve ayaktan tamamen iyileşene kadar fareyi izleyin.

7. Ex vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme

1. İn vivo görüntülemeye benzer şekilde IVIS'te ex vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme gerçekleştirin. IVIS başlatma ve tarama ayarı adımlarını yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
2. Deneysel son noktada, fareyi tartın ve 150 mg / kg'lık bir dozaj için uygulanacak D-lusiferin hacmini hesaplayın. D-lusiferin dozunu enjekte edin ve daha önce tarif edildiği gibi enjeksiyondan 10 dakika sonra canlı görüntüleme yapın.
3. Son in vivo biyolüminesans ve floresan görüntülemeden sonra, hala anestezi altındayken fareyi servikal çıkık ile hızlı bir şekilde ötenazi yapın, fareyi disseke edin ve beyin de dahil olmak üzere ana organları bir Petri kabında toplayın.
4. Eksize edilmiş organları içeren Petri kabını IVIS tarayıcısına yerleştirin ve in vivo görüntüleme ile aynı edinim ayarlarını kullanarak organları hem biyolüminesans hem de floresan modaliteleriyle görüntüleyin.
5. OCT'de daha fazla analiz için gerekli olan tüm organları, OCT'deki numune ile kriyokalıbı, OCT tamamen beyaza dönene kadar uzun forseps ile sığ bir sıvı nitrojen havuzuna yavaşça indirerek dondurun. OCT'nin kabarcıklanması meydana geleceğinden, sıvı nitrojenin sıvı OCT'ye dokunmasına veya kalıbı çok hızlı bir şekilde indirmesine izin vermeyin. Dondurulmuş numuneleri -80 °C'de saklayın.
6. Tümörü içeren beyni OCT'de saklayın ve kriyoseksiyon için flaş dondurma yapın. Analiz için ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.

8. Floresan mikroskobu

1. Kriyostatı kriyoseksiyon için hazırlayın. Hazne ve numune kafası sıcaklıklarını -15 °C ile -20 °C arasında ayarlayın.
2. OCT'de donmuş beyni -80 °C'lik depodan çıkarın ve kriyostat odasına yerleştirin. Kesitlere ayırmadan önce numunelerin hazne sıcaklığına (-20 °C) ısınmasına izin verin.
3. Tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak beyni enjeksiyon bölgesinde koronal olarak kesin. Bu genellikle beynin yüzeyinde bir çukur olarak görülür. Beynin kesilecek tarafını konumlandırmak için az miktarda OCT kullanarak numuneyi numune diskine monte edin. Numunenin dengeli bir şekilde monte edilmesini sağlamak için haznenin içindeki soğutulmuş ağırlıkla yeterli basınç uygulayın.
4. Takılan numuneyi ve numune diskini, kesit almaya hazırlanırken numune kafasına taşıyın. 20 μm'lik kesitler alarak dokuyu istenen derinliğe kadar kesin, dokuyu dokuyla mümkün olduğunca aynı hizada olacak şekilde kesit alacak şekilde numunenin açısını ayarlayın.
5. İstenen doku derinliğine ulaşıldığında, kriyostatı numunenin 5-7 μm'lik bölümlerini alacak şekilde ayarlayın. Mikroskop lamının yüklü tarafını bölümün üzerine hızlı bir şekilde indirerek bölümleri, fare kimliği, doku kesitli ve slayt numarası gibi tanımlayıcılarla önceden etiketlenmiş cam slaytlara monte edin.
6. Taze %4 paraformaldehit (PFA) yapın. Dokuyu sabitlemek için slaytı doku ile PFA çözeltisine 15 dakika batırın. Sabitlemeden sonra sürgüyü DPBS 3x ile durulayın.
7. Cam slayt üzerindeki şimdi sabitlenmiş doku bölümüne, hücre çekirdeklerini boyayan 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren 40 μL'lik bir montaj ortamı damlası ekleyin. Montaj ortamının üzerine dikkatlice 24 mm x 50 mm'lik bir cam lamel yerleştirin ve tüm dokunun montaj ortamıyla kaplandığından emin olun.
8. DAPI (359 nm'de emisyon (em), 457 nm'de uyarma (ex)) ve Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm) floresan mikroskobu kullanarak dokuyu görselleştirin.

Sonuçlar

MN-anti-miR10b, daha önce tarif edildiği gibi sentezlendi ve karakterize edildi¹¹. MN-anti-miR10b'nin transmisyon elektron mikroskobu, nano platformun morfolojisini ve polidispersitesini gösterir (Şekil 1B). Bu nano platformun ortalama büyüklüğü 25.12 ± 0.34 nm olup, zeta potansiyeli 13.18 ± 1.47 mV'dir (Şekil 1C,D). Bu çalışmalarda, çıplak atimik fareler...

Tartışmalar

BBB boyunca nanopartiküllerin birikimini doğrulamak için farklı yöntemler arasında birkaç kritik adım, protokolün başarısı için belirleyici olabilir. GBM hücrelerinin ortotopik implantasyonundan başlayarak, kemik kuruduktan sonra kafatasının dikiş çizgilerinin görünür olmasını sağlamak önemlidir; Bu, tümör hücrelerinin doğru yerleştirilmesine yardımcı olur. Kafatasını delmek için, matkap bölgesine hafif bir basınç uygulamak ve kemikte sığ bir izle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Cell culture reagent for U251
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT	For tissue collection
10 µL, Neuros Syringe, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4	Hamilton	65460-06	Syringe for intracranial implantation of tumor cells
3M Vetbond	3M	1469SB	Tissue adhesive for surgical site closure
4% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	J199943-K2	Tissue fixing solution
70% isopropoyl alcohol wipe	Cardinal	MW-APL	Topical antiseptic wipe for tumor implantation and tail vein injection
Aperio Versa	Leica		For scanning of stained tissue section slides
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Topical antiseptic for tumor implantation
BioSpec 70/30	Bruker		Magnetic resonance imaging scanner
Bone Wax	Medline	DYNJBW25	Bone wax for sealing implantation site
Burrs for Micro drill	F.S.T.	19007-05	Drill burr used to make hole in skull for tumor implantation
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Tissue mounting media containing DAPI stain
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	Cell culture media for U251
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	Sugical tool for tumor implantation
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	Cell culture media supplement for U251
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	Sugical tool for tumor implantation
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Topical analgesic for surgical site
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Drill used to make hole in skull for tumor implantation
Insulin syringe 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Syringe for D-Luciferin injection and tail vein injection of nanoparticles
Isoflurane	Covetrus	11695067772	Anethesia
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	Anethesia apparatus
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	Bioluminescence and fluorescence imaging scanner
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrate for bioluminescence imaging
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	10004027	Anesthetic for tumor implantation surgery
Ketofen (Ketoprofen)	Zoetis	10004031	Analgesic for tumor implantation surgery
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
PBS	Gibco	14190-144	Cell culture reagent and cell suspension solution for implantation of U251
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic for cell culture media for U251
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	Opthalmic eye ointment for protection during tumor implantation
Ruler	F.S.T.	18000-30	Used to measure drill site for implanation
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Collection mold for collecting tissue samples
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Freezing compound for collecting tissue samples
U-251 MG cell line human	Millapore Sigma	9063001	Human glioblastoma cell line
Xylazine Injectable Solution, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralytic for tumor implantation surgery