تلطيخ مناعي كامل التثبيت والعد التلقائي لخلايا العقدة الشبكية للفأر

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء عزل شبكية العين الفأرية بالكامل وإجراء التلوين المناعي لتسمية جميع خلايا العقدة الشبكية (RGCs). يتبع العملية التصوير والعد التلقائي ل RGCs باستخدام البرامج القائمة على الذكاء الاصطناعي ، مما يوفر طريقة بسيطة وسريعة ودقيقة لقياس RGCs في شبكية الفأر بأكملها.

Abstract

الجلوكوما هو سبب رئيسي للعمى على مستوى العالم ، ويتميز بآلية مسببة للأمراض معقدة تجعل استعادة الرؤية صعبة. تعمل الفئران كنماذج حيوانية قيمة لدراسة التسبب في الجلوكوما وعلاجها بسبب خلفيتها الجينية المتجانسة نسبيا والخلايا العقدية الشبكية (RGCs) ، والتي تشبه هيكليا تلك الموجودة في البشر. يتطلب التقييم الدقيق لضرر RGC ونتائج العلاج في نماذج الجلوكوما في الفئران تحديد رقم RGC عبر شبكية العين بأكملها. يحدد هذا البروتوكول طريقة شاملة تتضمن عزل شبكية العين بأكملها ، وتصنيف RGCs بأجسام مضادة محددة ، والعد التلقائي السريع والدقيق ل RGCs باستخدام برنامج قائم على الذكاء الاصطناعي. يسمح النهج المبسط بالقياس الكمي الفعال والدقيق لأعداد RGC في شبكية العين ، مما يسهل تقييم تنكس RGC والتدخلات العلاجية المحتملة. من خلال تمكين الباحثين من تقييم مدى تلف RGC ، يساهم هذا البروتوكول في فهم أعمق للتسبب في الجلوكوما ويساعد في تطوير استراتيجيات علاجية فعالة لإدارة ومنع فقدان البصر.

Introduction

يتميز الجلوكوما بالموت التدريجي للخلايا العقدية ، مما يشكل تحديا كبيرا لاستعادة البصر^1،2. يعد هذا المرض محورا رئيسيا لأبحاث طب العيون نظرا لانتشاره وتأثيره على الرؤية³. نماذج الماوس لا غنى عنها في الجلوكوما
البحث بسبب خلفيتها الجينية المتجانسة ، وقدرتها الإنجابية العالية ، وتشابه خصائص الخلايا العقدية مع البشر⁴. الهدف الأساسي من هذه الطريقة هو تحديد الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) بدقة في نماذج الفئران ، وهو أمر ضروري لفهم التسبب في الجلوكوما وتطوير العلاجات ذات الصلة.

ينبع الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية من الحاجة إلى طريقة موثوقة وفعالة لتقييم تنكس RGC في نماذج الماوس. غالبا ما توفر الطرق التقليدية ، مثل وضع العلامات على RGCs في أقسام الشبكية ، نتائج غير موثوقة بسبب التوزيع غير المنتظم ل RGCs في شبكية^{العين 5}. يعكس القياس الكمي ل RGCs عبر شبكية العين بأكملها بشكل أفضل التغييرات في أعدادها وهو أمر بالغ الأهمية لتقييم تطور المرض والتدخلات العلاجية.

تقدم هذه الطريقة العديد من المزايا مقارنة بالتقنيات البديلة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون العد اليدوي لخلايا العقدة الشبكية (RGCs) في شبكية العين البالغة الطبيعية ، والتي تحتوي على 40,000 إلى 60,000 RGCs ، مضيعة للوقت وعرضة للخطأ ^6,7,8. يسمح برنامج العد التلقائي ل RGC الذي طورناه بالعد الدقيق في أقل من 3 دقائق ، مما قد يوفر للباحثين قدرا كبيرا من الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البرنامج المستند إلى الذكاء الاصطناعي المستخدم في العد التلقائي يقلل من التحيز ويعزز قابلية التكرار.

علاوة على ذلك ، توفر هذه التقنية نهجا موحدا لتقييم تنكس RGC عبر نماذج الفئران المختلفة والظروف التجريبية ، مما يساهم ببيانات قيمة في مجال أبحاث الجلوكوما. تتوافق الطريقة مع الدراسات الأخرى التي تؤكد على أهمية تحليل شبكية العين بالكامل لفهم تغيرات الشبكية في الأمراض⁹.

لمساعدة القراء على تحديد ما إذا كانت هذه الطريقة مناسبة لتطبيقها ، من المهم ملاحظة أن هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للباحثين الذين يدرسون تنكس الخلايا العقدية الشبكية (RGC) في نماذج الفئران من الجلوكوما أو أمراض الشبكية الأخرى. هذه الطريقة قابلة للتكيف مع الإعدادات التجريبية المختلفة وتوفر درجة عالية من الدقة والكفاءة في عد RGC ، مما يجعلها مثالية لكل من الدراسات الصغيرة والكبيرة الحجم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التصميم المباشر للبروتوكول وتوافر البرامج سهلة الاستخدام يجعله في متناول الباحثين ذوي مستويات متفاوتة من الخبرة في تحليل الشبكية.

Protocol

امتثل الإجراء لإرشادات جمعية البحوث في مجال الرؤية وطب العيون لاستخدام في البحث وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) التابعة للمستشفى الشعبي لمقاطعة سيتشوان. تم استخدام ذكور الفئران C57Bl / 6J (شهران من العمر) في هذه الدراسة. يوضح الشكل 1 الإجراء العام الموصوف هنا. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. عزل شبكية العين كاملة

1. التضحية بالحيوانات
   1. التضحية بالفئران باستخدام خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) (الشكل 2 أ). قبل خلع عنق الرحم ،
      تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (3٪ -5٪ في الأكسجين) أو عن طريق الحقن داخل الصفاق لخليط الكيتامين / الزيلازين.
2. الاستئصال ومعالجة مقلة العين
   1. ضع علامة على حافة القرنية على الجانب الظهري من مقلة العين بعلامة زرقاء لتذكر الاتجاه أثناء التشريح اللاحق.
   2. قم بإزالة الأنسجة العضلية المتبقية المرتبطة بمقلة العين بالمقص. انقل مقلة العين المنزوعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق دائري القاع سعة 2 مل مملوء ب 1x PBS لشطف قصير (الشكل 2 ج).
3. تثبيت
   1. انقل مقلة العين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق دائري القاع سعة 2 مل يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) طازج للتثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق (الشكل 2 د).
   2. قم بعمل شق صغير (حوالي 1-2 مم) على القرنية باستخدام مقص ناعم تحت مجهر تشريح.
   3. ضع مقلة العين مرة أخرى في المثبت لمزيد من التثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة (الشكل 2 د).
4. إزالة القرنية والعدسة ^1,9
   1. قم بعمل شق صغير بطول 1 مم تقريبا حول طيفي القرنية ، الحدود بين القرنية والصلبة ، باستخدام مقص جراحي دقيق.
   2. قم بقص محيط القرنية بعناية ، واستئصالها بالكامل لكشف الهياكل الأساسية.
   3. استخدم ملقطا دقيقا لإمساك العدسة برفق ورفعها بعناية من الأنسجة المحيطة لمنع تلف شبكية العين. الحفاظ على السلامة الهيكلية لشبكية العين من خلال عملية دقيقة.
   4. انقل واقية العين إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق لمزيد من المعالجة.
      ملاحظة: استئصال القرنية واستخرج العدسة بكفاءة أكبر باستخدام تقنية "الشق المتقاطع"¹⁰. اصنع شقين متعامدين عبر القرنية واستخدم الملقط لاستخراج العدسة.
5. شق الصلبة
   1. قم بقص شق دقيق في الصلبة بمقص عيون ناعم لتسهيل خطوات التشريح اللاحقة (الشكل 2J).
6. فصل الشبكية
   1. أدخل ملقطا بأسنان في الشق بين الصلبة والشبكية. أمسك حافة الصلبة برفق ، وتجنب القوة المفرطة لمنع تمزق الأنسجة.
   2. قم بتكبير الشق تدريجيا عن طريق تحريك الملقط على طول الحدود بين الصلبة وشبكية العين بحركات يد بطيئة وثابتة. استخدم الجزء المسنن من الملقط لفصل الصلبة بعناية عن شبكية العين ، مما يضمن عدم تلف شبكية العين (الشكل 2J).
7. قطع الشبكية
   1. قسم شبكية العين إلى أربعة لوحات متساوية الحجم تقريبا باستخدام مقص حاد. تأكد من أن الجروح في منتصف الطريق تقريبا نحو العصب البصري وموجهة بزاوية 90 درجة من بعضها البعض.
8. تنظيف شبكية العين
   1. افتح شبكية العين المقطوعة برفق باستخدام فرشاة ذات شعيرات ناعمة ، وقم بإزالة الحطام بدقة من سطحها (الشكل 2 ك).
9. التثبيت النهائي
   1. انقل شبكية العين المعزولة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 4٪ PFA طازج باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها. اسمح بالتثبيت على الجليد لمدة 5 ساعات إضافية إلى طوال الليل للحفاظ على الأنسجة.

2. تلطيخ المناعة

1. غسل
   1. اغسل شبكية العين المعزولة بالكامل في 1x PBS مع تحريك لطيف لمدة 5 دقائق. تجاهل حل PBS. كرر هذه العملية مرتين لإزالة المثبت والحطام المتبقية.
2. حظر
   1. اغمر شبكية العين المغسولة في محلول عازل مانع (1x PBS مع 4٪ مصل حمار عادي (NDS) و 0.2٪ Triton X-100) لمدة 30 دقيقة لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة وتعزيز النفاذية (الشكل 3 أ).
3. حضانة الأجسام المضادة الأولية
   1. استبدل المخزن المؤقت للحجب بالجسم المضاد الأولي BRN3A (المخفف 1: 200 في المخزن المؤقت للحظر). احتضان شبكية العين طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح بارتباط مستضد محدد بالجسم المضاد (الشكل 3 ب).
4. غسل
   1. اغسل شبكية العين ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق لكل منها لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة وتقليل تلطيخ الخلفية (الشكل 3C).
5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
   1. احتضان شبكية العين بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب مترافق Alexa594 أو Alexa488 (مخفف 1: 300) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لتصور المستضدات المستهدفة (الشكل 3 د).
6. غسل
   1. قم بإجراء ثلاث غسلات متتالية مع 1x PBS لمدة 5 دقائق لكل منها لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة وتقليل الارتباط غير المحدد.
7. تصاعد
   1. انقل شبكية العين الملطخة بالمناعة برفق إلى شريحة مجهر زجاجي ، وقم بتسطيحها بعناية لتقليل الطي أو التشويه.
   2. ضع قطرة صغيرة من وسيط التثبيت المضاد للبهتان على مركز شبكية العين ، مما يضمن التوزيع المتساوي عبر الأنسجة.
   3. ضع غطاء بعناية فوق شبكية العين المثبتة ، وتجنب فقاعات الهواء (الشكل 3E ، F).

3. معالجة الصور

ملاحظة: قم باستيراد الصورة إلى برنامج العد التلقائي RGC وابدأ العد. يمكن الحصول على عدد الخلايا الإيجابية BRN3A لشبكية العين بأكملها في دقائق. قم بتنزيل برنامج AutoCount من GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). اتبع خطوات التثبيت التفصيلية للبرنامج أدناه:

1. قم بتنزيل التعليمات البرمجية من رابط GitHub . سيتلقى المرء ملفا باسم "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". قم بفك ضغط هذا الملف.
2. قم بتنزيل الملفات الضرورية من القرص السحابي (انظر جدول المواد) وفك ضغطها. الملف الذي تم تنزيله يسمى "yolov5_cpu". قم بفك ضغط هذه الحزمة إلى المجلد الحالي لتجنب المشكلات غير المتوقعة.
3. حدد موقع ملف التكوين من الخطوة 1 وقم بتعديل محتواه للإشارة إلى المسار "yolov5_cpu".
   ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم وضع "yolov5_cpu" الذي تم تنزيله في "D:\1me\yolov5_cpu_"، فقم بتغيير الملف "config.ini" في الخطوة 1 إلى "D:/1me/yolov5_cpu" (استخدم / بدلا من \). (الشكل 4 أ).
4. افتح الواجهة الرسومية بالنقر فوق userinterface.exe. قد يكون التحميل الأولي بطيئا (يتم تشغيله كمسؤول) (الشكل 4 ب).
5. بعد فتح البرنامج ، تحقق مما إذا كان ملف الطراز "pmse_plus.pt" موجودا في الدليل الجذر لمحرك الأقراص C. إذا لم يكن موجودا ، فانسخه إلى هذا الدليل.
   ملاحظة: يوجد ملف النموذج "pmse_plus.pt" في مجلد الأوزان في المجلد "yolov5"، الموجود في مجلد RGCs ذكي للقياس الكمي (الشكل 4C).
6. قم بإعداد الصور المراد اكتشافها.
   ملاحظة: يسمح البرنامج بقراءة صورة واحدة أو خمس صور فقط في المرة الواحدة. ستؤدي قراءة المزيد إلى حدوث خطأ.

4. العد الآلي للخلايا

1. افتح برنامج العد (الشكل 5 أ).
2. انقر فوق فتح الصورة لاستيراد الصورة (الشكل 5 ب).
3. انقر فوق RUN للسماح للبرنامج بحساب الخلايا تلقائيا (الشكل 5C).
   ملاحظة: سيقوم البرنامج بتمييز الخلايا التي تم عدها بمربع أحمر ويعرض عدد الخلايا في الزاوية اليمنى العليا (الشكل 5 د).

النتائج

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل منهجية التلوين المناعي الكامل لشبكية العين ، مما يضمن التحضير الدقيق للأنسجة ، وحضانة الأجسام المضادة الدقيقة ، وعد الخلايا الآلي الموثوق. يسهل الإجراء وضع العلامات القوية وتحديد الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) ، مما يتيح تقييما دقيقا للمجموع...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحديد جميع الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) في شبكية الفأر ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة تطور تنكس RGC في نماذج الفئران لدراسات الجلوكوما. شبكية الفأر عبارة عن نسيج عصبي رقيق⁵ ، ويتطلب عزل شبكية العين الكاملة عن عيون الفأر ممارسة متكرر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100