小鼠视网膜神经节细胞的全支架免疫染色和自动计数

摘要

该方案描述了分离整个小鼠视网膜并进行免疫染色以标记所有视网膜神经节细胞 （RGC） 的程序。该过程之后，使用基于 AI 的软件对 RGC 进行成像和自动计数，提供了一种简单、快速和准确的方法来量化整个小鼠视网膜中的 RGC。

摘要

青光眼是全球失明的主要原因，其特点是复杂的致病机制，使视力恢复具有挑战性。小鼠是研究青光眼发病机制和治疗的有价值的动物模型，因为它们的遗传背景和视网膜神经节细胞 （RGC） 在结构上类似于人类。准确评估小鼠青光眼模型中的 RGC 损伤和治疗结果需要确定整个视网膜的 RGC 数量。该协议概述了一种全面的方法，包括分离整个视网膜、用特异性抗体标记 RGC 以及使用基于 AI 的程序快速、准确地自动计数 RGC。简化的方法允许高效、精确地量化小鼠视网膜中的 RGC 数量，有助于评估 RGC 变性和潜在的治疗干预。通过使研究人员能够评估 RGC 损伤的程度，该协议有助于更深入地了解青光眼的发病机制，并有助于制定有效的治疗策略来管理和预防视力丧失。

引言

青光眼的特征是神经节细胞进行性死亡，这对视力恢复构成重大挑战 ^1,2。由于其患病率和对视力的影响，这种疾病是眼科研究的重点³。小鼠模型在青光眼中是必不可少的
研究，因为它们的遗传背景同质化、生殖能力高以及它们的神经节细胞特性与人类相似⁴.该方法的主要目标是准确量化小鼠模型中的视网膜神经节细胞 （RGC），这对于了解青光眼的发病机制和开发相关治疗方法至关重要。

开发这项技术的基本原理源于需要一种可靠且有效的方法来评估小鼠模型中的 RGC 变性。由于 RGC 在视网膜中的分布不均匀，传统方法（例如在视网膜切片中标记 RGC）通常提供不可靠的结果⁵。量化整个视网膜的 RGC 可以更好地反映其数量的变化，对于评估疾病进展和治疗干预至关重要。

与其他技术相比，这种方法具有几个优点。例如，在包含 40,000 至 60,000 个 RGC 的正常成年小鼠视网膜中手动计数视网膜神经节细胞 （RGC） 可能非常耗时且容易出错 ^6,7,8<....

研究方案

该程序符合视觉与眼科学研究会关于使用动物进行研究的指南，并获得了四川省人民医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究使用 C57Bl/6J 雄性小鼠 （2 个月大）。 图 1 说明了此处描述的整个过程。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 分离整体安装视网膜

1. 动物祭祀
   1. 使用颈椎脱位处死小鼠（遵循机构批准的方案）（图 2A）。颈椎脱位前，
      通过吸入异氟醚（3%-5% 的氧气）或通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物来麻醉小鼠。
2. 眼球摘除术和眼球处理
   1. 用蓝色记号笔在眼球背侧标记角膜边缘，以在随后的解剖过程中记住方向。
   2. 用剪刀去除附着在眼球上的残留肌肉组织。将去核的眼球转移到装有 1x PBS 的 2 mL 圆底微量离心管中进行短暂冲洗（图 2C）。
3. 固定
   1. 将眼球转移到另一个含有新鲜制备的 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 2 mL 圆底微量离心管中，在 4 °C 下固定 ....

讨论

该方案提供了一种确定小鼠视网膜中所有视网膜神经节细胞 （RGC） 的方法，可用于监测青光眼研究小鼠模型中 RGC 变性的进展。小鼠视网膜是一种脆弱的神经组织⁵ ，从小鼠眼睛中分离出整个视网膜需要反复练习。在实验过程中，发现注视时间显着影响视网膜形态。对于 2 周龄左右的小鼠，由于巩膜薄而弱，20 分钟的固定时间足以获得良好的结果。然而.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100