小鼠视网膜神经节细胞的全支架免疫染色和自动计数

摘要

该方案描述了分离整个小鼠视网膜并进行免疫染色以标记所有视网膜神经节细胞 （RGC） 的程序。该过程之后，使用基于 AI 的软件对 RGC 进行成像和自动计数，提供了一种简单、快速和准确的方法来量化整个小鼠视网膜中的 RGC。

摘要

青光眼是全球失明的主要原因，其特点是复杂的致病机制，使视力恢复具有挑战性。小鼠是研究青光眼发病机制和治疗的有价值的动物模型，因为它们的遗传背景和视网膜神经节细胞 （RGC） 在结构上类似于人类。准确评估小鼠青光眼模型中的 RGC 损伤和治疗结果需要确定整个视网膜的 RGC 数量。该协议概述了一种全面的方法，包括分离整个视网膜、用特异性抗体标记 RGC 以及使用基于 AI 的程序快速、准确地自动计数 RGC。简化的方法允许高效、精确地量化小鼠视网膜中的 RGC 数量，有助于评估 RGC 变性和潜在的治疗干预。通过使研究人员能够评估 RGC 损伤的程度，该协议有助于更深入地了解青光眼的发病机制，并有助于制定有效的治疗策略来管理和预防视力丧失。

引言

青光眼的特征是神经节细胞进行性死亡，这对视力恢复构成重大挑战 ^1,2。由于其患病率和对视力的影响，这种疾病是眼科研究的重点³。小鼠模型在青光眼中是必不可少的
研究，因为它们的遗传背景同质化、生殖能力高以及它们的神经节细胞特性与人类相似⁴.该方法的主要目标是准确量化小鼠模型中的视网膜神经节细胞 （RGC），这对于了解青光眼的发病机制和开发相关治疗方法至关重要。

开发这项技术的基本原理源于需要一种可靠且有效的方法来评估小鼠模型中的 RGC 变性。由于 RGC 在视网膜中的分布不均匀，传统方法（例如在视网膜切片中标记 RGC）通常提供不可靠的结果⁵。量化整个视网膜的 RGC 可以更好地反映其数量的变化，对于评估疾病进展和治疗干预至关重要。

与其他技术相比，这种方法具有几个优点。例如，在包含 40,000 至 60,000 个 RGC 的正常成年小鼠视网膜中手动计数视网膜神经节细胞 （RGC） 可能非常耗时且容易出错 ^6,7,8。我们开发的 RGC 自动计数软件可在不到 3 分钟的时间内进行准确计数，从而可能为研究人员节省大量时间。此外，用于自动计数的基于 AI 的软件可最大限度地减少偏差并提高可重复性。

此外，该技术提供了一种标准化方法来评估不同小鼠模型和实验条件下的 RGC 变性，为青光眼研究领域贡献了有价值的数据。该方法与其他强调整体视网膜分析对了解疾病视网膜变化重要性的研究一致⁹。

为了帮助读者确定这种方法是否适合他们的应用，重要的是要注意，该技术对于在青光眼或其他视网膜疾病的小鼠模型中研究视网膜神经节细胞 （RGC） 变性的研究人员特别有利。该方法适用于各种实验设置，并在 RGC 计数中提供高度的准确性和效率，使其成为小规模和大规模研究的理想选择。此外，该方案的简单设计和用户友好的软件的可用性使其适用于在视网膜分析方面具有不同专业知识水平的研究人员。

研究方案

该程序符合视觉与眼科学研究会关于使用动物进行研究的指南，并获得了四川省人民医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究使用 C57Bl/6J 雄性小鼠 （2 个月大）。 图 1 说明了此处描述的整个过程。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 分离整体安装视网膜

1. 动物祭祀
   1. 使用颈椎脱位处死小鼠（遵循机构批准的方案）（图 2A）。颈椎脱位前，
      通过吸入异氟醚（3%-5% 的氧气）或通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物来麻醉小鼠。
2. 眼球摘除术和眼球处理
   1. 用蓝色记号笔在眼球背侧标记角膜边缘，以在随后的解剖过程中记住方向。
   2. 用剪刀去除附着在眼球上的残留肌肉组织。将去核的眼球转移到装有 1x PBS 的 2 mL 圆底微量离心管中进行短暂冲洗（图 2C）。
3. 固定
   1. 将眼球转移到另一个含有新鲜制备的 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 2 mL 圆底微量离心管中，在 4 °C 下固定 10 分钟（图 2D）。
   2. 在解剖显微镜下用细剪刀在角膜上做一个小切口（约 1-2 毫米）。
   3. 将眼球放回固定剂中，在 4 °C 下进一步固定 3 小时以保持组织形态（图 2D）。
4. 去除角膜和晶状体 ^1,9
   1. 使用精细的手术剪刀在角膜缘（角膜和巩膜之间的边界）周围做一个约 1 毫米的小切口。
   2. 小心地切开角膜的圆周，将其完全切除以露出底层结构。
   3. 使用细镊子轻轻抓住并小心地将晶状体从周围组织中提起，以防止损伤视网膜。通过精细的操作保持视网膜的结构完整性。
   4. 将眼罩转移到微量离心管中进行进一步处理。
      注意：使用“交叉裂缝”技术更有效地切除角膜并提取晶状体¹⁰。在角膜上划两个垂直的缝隙，用镊子拔出晶状体。
5. 巩膜切口
   1. 用细眼剪刀在巩膜上切出一个精确的缝隙，以方便后续的解剖步骤（图 2J）。
6. 视网膜分离
   1. 将带齿的镊子插入巩膜和视网膜之间的切口。轻轻抓住巩膜的边缘，避免用力过大，以防止撕裂组织。
   2. 通过缓慢、稳定的手部运动沿巩膜和视网膜之间的边界移动镊子来逐渐扩大切口。使用镊子的齿状部分小心地将巩膜与视网膜分开，确保视网膜不受损伤（图 2J）。
7. 视网膜切割
   1. 使用锋利的剪刀将视网膜分成四个大小大致相等的皮瓣。确保切口大约朝向视神经的一半，并且彼此成 90° 角。
8. 视网膜清洁
   1. 使用软毛刷轻轻展开解剖的视网膜，并小心翼翼地去除其表面的碎屑（图 2K）。
9. 最终固定
   1. 使用一次性巴斯德移液器将分离的视网膜转移到含有新鲜 4% PFA 的微量离心管中。在冰上再固定 5 小时至过夜以保存组织。

2. 免疫染色

1. 洗涤
   1. 在 1x PBS 中轻轻搅拌洗涤分离的全安装视网膜 5 分钟。丢弃 PBS 溶液。重复此过程两次以去除残留的固定剂和碎屑。
2. 阻塞
   1. 将洗涤后的视网膜浸入封闭缓冲溶液（1x PBS 与 4% 正常驴血清 （NDS） 和 0.2% Triton X-100）中 30 分钟，以防止非特异性抗体结合并增强透化（图 3A）。
3. 一抗孵育
   1. 用一抗 BRN3A（在封闭缓冲液中以 1：200 稀释）替换封闭缓冲液。将视网膜在 4 °C 下孵育过夜，以允许特异性抗原 - 抗体结合（图 3B）。
4. 洗涤
   1. 用 1x PBS 洗涤视网膜 3 次，每次 5 分钟，以去除未结合的一抗并减少背景染色（图 3C）。
5. 二抗孵育
   1. 在室温下将视网膜与 Alexa594 或 Alexa488 偶联的抗兔二抗（稀释 1：300）孵育 2 小时，以观察靶抗原（图 3D）。
6. 洗涤
   1. 用 1x PBS 连续洗涤 3 次，每次 5 分钟，以去除多余的二抗并尽量减少非特异性结合。
7. 安装
   1. 轻轻地将免疫染色的视网膜转移到玻璃显微镜载玻片上，小心地将其压平以尽量减少折叠或变形。
   2. 将一小滴抗褪色封片剂涂抹在视网膜中心，确保均匀分布于整个组织。
   3. 小心地将盖玻片放在已安装的视网膜上，避免气泡（图 3E，F）。

3. 图像处理

注意：将图像导入 RGC 自动计数软件并开始计数。可以在几分钟内获得整个视网膜的 BRN3A 阳性细胞数量。从 GitHub 下载 AutoCount 软件 （https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs）。请按照以下软件的详细安装步骤进行操作：

1. 从 GitHub 链接下载代码。用户将收到一个名为 “Intelligent-quantifying-RGCs.zip” 的文件。解压缩此文件。
2. 从 云硬盘 下载必要的文件（参见 材料表）并解压。下载的文件名为 “yolov5_cpu”。将此包解压缩到当前文件夹以避免意外问题。
3. 找到步骤 1 中的 Config 文件，并修改其内容以指向 “yolov5_cpu” 路径。
   注意：例如，如果下载的“yolov5_cpu”放在“D：\1me\yolov5_cpu_”中，请将步骤 1 中的“config.ini”文件更改为“D：/1me/yolov5_cpu”（使用 / 而不是 \）。（图 4A）。
4. 单击 userinterface.exe 打开图形界面。初始加载可能很慢（以管理员身份运行）（图 4B）。
5. 打开软件后，验证 “pmse_plus.pt” 模型文件是否存在于驱动器 C 的根目录中。如果不存在，请将其复制到此目录。
   注意：“pmse_plus.pt”模型文件位于“yolov5”文件夹的 weights 文件夹中，位于提取的 Intelligent-quantifying RGCs 文件夹中（图 4C）。
6. 准备要检测的图像。
   注意：该软件一次只允许读取一张或五张图片。读取更多将导致错误。

4. 自动细胞计数

1. 打开计数软件（图 5A）。
2. 单击 OPEN IMAGE 以导入图像（图 5B）。
3. 单击 RUN 以允许软件自动计数细胞（图 5C）。
   注意：软件将用红色方框标记计数的细胞，并在右上角显示细胞计数（图 5D）。

结果

该方案详细介绍了小鼠视网膜整体免疫染色的方法，确保细致的组织制备、精确的抗体孵育和可靠的自动细胞计数。该程序有助于对视网膜神经节细胞 （RGC） 进行稳健的标记和定量，从而能够在各种实验环境中准确评估细胞群。该方法用于计数野生型和青光眼模型小鼠中的 RGC，产生一致的结果。代表性结果表明，正常成年小鼠在 2 个月大时的 RGC 数量约为 45,000 个（

讨论

该方案提供了一种确定小鼠视网膜中所有视网膜神经节细胞 （RGC） 的方法，可用于监测青光眼研究小鼠模型中 RGC 变性的进展。小鼠视网膜是一种脆弱的神经组织⁵ ，从小鼠眼睛中分离出整个视网膜需要反复练习。在实验过程中，发现注视时间显着影响视网膜形态。对于 2 周龄左右的小鼠，由于巩膜薄而弱，20 分钟的固定时间足以获得良好的结果。然而...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100