Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

Riepilogo

Questo protocollo descrive la procedura per isolare la retina di topo a montaggio intero ed eseguire l'immunocolorazione per marcare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC). Il processo è seguito dall'imaging e dal conteggio automatico delle RGC utilizzando un software basato sull'intelligenza artificiale, fornendo un metodo semplice, veloce e accurato per quantificare le RGC nell'intera retina del topo.

Abstract

Il glaucoma è una delle principali cause di cecità a livello globale, caratterizzata da un complesso meccanismo patogenetico che rende difficile il ripristino della vista. I topi fungono da preziosi modelli animali per lo studio della patogenesi e del trattamento del glaucoma grazie al loro background genetico relativamente omogeneo e alle cellule gangliari retiniche (RGC), che assomigliano strutturalmente a quelle dell'uomo. Una valutazione accurata del danno da RGC e degli esiti del trattamento nei modelli murini di glaucoma richiede la determinazione del numero di RGC in tutta la retina. Questo protocollo delinea un metodo completo che prevede l'isolamento dell'intera retina, l'etichettatura delle RGC con anticorpi specifici e il conteggio automatico rapido e accurato delle RGC utilizzando un programma basato sull'intelligenza artificiale. L'approccio semplificato consente una quantificazione efficiente e precisa del numero di RGC nelle retine di topo, facilitando la valutazione della degenerazione RGC e i potenziali interventi terapeutici. Consentendo ai ricercatori di valutare l'entità del danno da RGC, questo protocollo contribuisce a una comprensione più profonda della patogenesi del glaucoma e aiuta a sviluppare strategie di trattamento efficaci per gestire e prevenire la perdita della vista.

Introduzione

Il glaucoma è caratterizzato dalla progressiva morte delle cellule ganglionari, che rappresenta una sfida significativa per il ripristino della vista ^1,2. Questa malattia è uno dei principali obiettivi della ricerca oftalmica a causa della sua prevalenza e del suo impatto sulla vista³. I modelli murini sono indispensabili nel glaucoma
ricerca a causa del loro background genetico omogeneo, dell'elevata capacità riproduttiva e della somiglianza delle loro proprietà delle cellule gangliari con gli esseri umani⁴. L'obiettivo principale di questo metodo è quantificare con precisione le cellule gangliari retiniche (RGC) in modelli murini, il che è essenziale per comprendere la patogenesi del glaucoma e sviluppare trattamenti pertinenti.

La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica deriva dalla necessità di un metodo affidabile ed efficiente per valutare la degenerazione della RGC nei modelli murini. I metodi tradizionali, come la marcatura delle RGC nelle sezioni retiniche, spesso forniscono risultati inaffidabili a causa della distribuzione non uniforme delle RGC nella retina⁵. La quantificazione delle RGC nell'intera retina riflette meglio i cambiamenti nel loro numero ed è fondamentale per valutare la progressione della malattia e gli interventi terapeutici.

Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche alternative. Ad esempio, il conteggio manuale delle cellule gangliari retiniche (RGC) in una normale retina di topo adulto, che contiene da 40.000 a 60.000 RGC, può richiedere molto tempo ed essere soggetto a errori ^6,7,8. Il software per il conteggio automatico RGC che abbiamo sviluppato consente un conteggio accurato in meno di 3 minuti, consentendo ai ricercatori di risparmiare una notevole quantità di tempo. Inoltre, il software basato sull'intelligenza artificiale utilizzato per il conteggio automatico riduce al minimo le distorsioni e migliora la riproducibilità.

Inoltre, questa tecnica fornisce un approccio standardizzato per valutare la degenerazione della RGC in diversi modelli murini e condizioni sperimentali, contribuendo con dati preziosi al campo della ricerca sul glaucoma. Il metodo è in linea con altri studi che sottolineano l'importanza dell'analisi della retina a montaggio intero per comprendere i cambiamenti retinici nelle malattie⁹.

Per aiutare i lettori a determinare se questo metodo è adatto alla loro applicazione, è importante notare che questa tecnica è particolarmente vantaggiosa per i ricercatori che studiano la degenerazione delle cellule gangliari retiniche (RGC) in modelli murini di glaucoma o altre malattie retiniche. Il metodo è adattabile a varie configurazioni sperimentali e offre un alto grado di accuratezza ed efficienza nel conteggio RGC, rendendolo ideale sia per studi su piccola che su larga scala. Inoltre, il design semplice del protocollo e la disponibilità di software di facile utilizzo lo rendono accessibile a ricercatori con diversi livelli di esperienza nell'analisi della retina.

Protocollo

La procedura è conforme alle linee guida dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'utilizzo degli animali nella ricerca ed è stata approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Ospedale popolare provinciale del Sichuan. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6J (di 2 mesi). La Figura 1 illustra la procedura generale qui descritta. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento di retine a montaggio intero

1. Sacrificio animale
   1. Sacrificare i topi usando la lussazione cervicale (seguendo protocolli approvati istituzionalmente) (Figura 2A). Prima della lussazione cervicale,
      Anestetizzare i topi inalando isoflurano (3%-5% in ossigeno) o mediante iniezione intraperitoneale della miscela ketamina/xilazina.
2. Enucleazione ed elaborazione del bulbo oculare
   1. Segna il bordo della cornea sul lato dorsale del bulbo oculare con un pennarello blu per ricordare l'orientamento durante la successiva dissezione.
   2. Rimuovere i tessuti muscolari residui attaccati al bulbo oculare con le forbici. Trasferire il bulbo oculare enucleato in una provetta da microcentrifuga a fondo tondo da 2 mL riempita con 1x PBS per un breve risciacquo (Figura 2C).
3. Fissazione
   1. Trasferire il bulbo oculare in un'altra provetta per microcentrifuga a fondo tondo da 2 ml contenente il 4% di paraformaldeide (PFA) appena prodotta per il fissaggio a 4 °C per 10 minuti (Figura 2D).
   2. Praticare una piccola incisione (circa 1-2 mm) sulla cornea utilizzando forbici sottili al microscopio da dissezione.
   3. Riposizionare il bulbo oculare nel fissativo per un'ulteriore fissazione a 4 °C per 3 ore per preservare la morfologia del tessuto (Figura 2D).
4. Rimozione della cornea e del cristallino ^1,9
   1. Praticare una piccola incisione di circa 1 mm attorno al limbus corneale, il confine tra la cornea e la sclera, utilizzando le forbici chirurgiche sottili.
   2. Tagliare con cura la circonferenza della cornea, asportandola completamente per esporre le strutture sottostanti.
   3. Usa una pinza sottile per afferrare delicatamente e sollevare con cura la lente dai tessuti circostanti per evitare danni alla retina. Mantenere l'integrità strutturale della retina con un'operazione delicata.
   4. Trasferire l'oculare in una provetta da microcentrifuga per un'ulteriore elaborazione.
      NOTA: Asportare la cornea ed estrarre la lente in modo più efficiente utilizzando la tecnica della "fessura a croce"¹⁰. Fai due fessure perpendicolari sulla cornea e usa una pinza per estrarre la lente.
5. Incisione sclerale
   1. Tagliare una fessura precisa nella sclera con forbici oftalmiche fini per facilitare le successive fasi di dissezione (Figura 2J).
6. Separazione della retina
   1. Inserire una pinza con i denti nell'incisione tra la sclera e la retina. Afferrare delicatamente il bordo della sclera, evitando una forza eccessiva per evitare di strappare il tessuto.
   2. Ingrandire gradualmente l'incisione muovendo la pinza lungo il confine tra la sclera e la retina con movimenti lenti e costanti della mano. Utilizzare la parte dentata della pinza per separare accuratamente la sclera dalla retina, assicurandosi che la retina non venga danneggiata (Figura 2J).
7. Taglio retina
   1. Dividi la retina in quattro lembi di dimensioni più o meno uguali usando forbici affilate. Assicurarsi che i tagli siano circa a metà strada verso il nervo ottico e orientati a 90° l'uno dall'altro.
8. Pulizia della retina
   1. Aprire delicatamente la retina sezionata utilizzando uno spazzolino a setole morbide e rimuovere meticolosamente i detriti dalla sua superficie (Figura 2K).
9. Fissaggio finale
   1. Trasferire la retina isolata in una provetta da microcentrifuga contenente PFA fresco al 4% utilizzando una pipetta Pasteur monouso. Lasciare fissare il ghiaccio per altre 5 ore o durante la notte per la conservazione dei tessuti.

2. Immunocolorazione

1. Lavaggio
   1. Lavare la retina isolata a montaggio intero in 1x PBS con una leggera agitazione per 5 minuti. Eliminare la soluzione PBS. Ripetere questo processo due volte per rimuovere i residui di fissativo e i detriti.
2. Inceppamento
   1. Immergere la retina lavata in una soluzione tampone bloccante (1x PBS con il 4% di siero d'asino normale (NDS) e 0,2% di Triton X-100) per 30 minuti per prevenire il legame di anticorpi aspecifici e migliorare la permeabilizzazione (Figura 3A).
3. Incubazione degli anticorpi primari
   1. Sostituire il tampone di blocco con l'anticorpo primario BRN3A (diluito 1:200 nel tampone di blocco). Incubare la retina per una notte a 4 °C per consentire il legame specifico antigene-anticorpo (Figura 3B).
4. Lavaggio
   1. Lavare la retina tre volte con 1x PBS per 5 minuti ciascuna per rimuovere gli anticorpi primari non legati e ridurre la colorazione di fondo (Figura 3C).
5. Incubazione secondaria degli anticorpi
   1. Incubare la retina con l'anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con Alexa594 o Alexa488 (diluito 1:300) per 2 ore a temperatura ambiente per visualizzare gli antigeni bersaglio (Figura 3D).
6. Lavaggio
   1. Eseguire tre lavaggi consecutivi con 1x PBS per 5 minuti ciascuno per rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso e ridurre al minimo il legame aspecifico.
7. Montante
   1. Trasferire delicatamente la retina immunocolorata su un vetrino da microscopio, appiattendola con cura per ridurre al minimo il piegamento o la distorsione.
   2. Applicare una piccola goccia di terreno di montaggio anti-sbiadimento al centro della retina, assicurando una distribuzione uniforme su tutto il tessuto.
   3. Posizionare con cura un vetrino coprioggetti sulla retina montata, evitando bolle d'aria (Figura 3E, F).

3. Elaborazione delle immagini

NOTA: Importare l'immagine nel software di conteggio automatico RGC e iniziare a contare. Il numero di cellule BRN3A-positive per l'intera retina può essere ottenuto in pochi minuti. Scarica il software AutoCount da GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Seguire i passaggi di installazione dettagliati per il software di seguito:

1. Scaricare il codice dal collegamento GitHub . Si riceverà un file chiamato "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Decomprimi questo file.
2. Scaricare i file necessari dal disco cloud (vedere Tabella dei materiali) e decomprimerli. Il file scaricato è denominato "yolov5_cpu". Decomprimi questo pacchetto nella cartella corrente per evitare problemi imprevisti.
3. Individuare il file di configurazione del passaggio 1 e modificarne il contenuto in modo che punti al percorso "yolov5_cpu".
   NOTA: Ad esempio, se il "yolov5_cpu" scaricato viene inserito in "D:\1me\yolov5_cpu_", modificare il file "config.ini" nel passaggio 1 in "D:/1me/yolov5_cpu" (utilizzare / invece di \). (Figura 4A).
4. Apri l'interfaccia grafica cliccando su userinterface.exe. Il caricamento iniziale potrebbe essere lento (eseguito come amministratore) (Figura 4B).
5. Dopo aver aperto il software, verificare se il file del modello "pmse_plus.pt" è presente nella directory principale dell'unità C. Se non è presente, copiarlo in questa directory.
   NOTA: Il file del modello "pmse_plus.pt" si trova nella cartella dei pesi della cartella "yolov5", che si trova nella cartella degli RGC di quantificazione intelligente estratta (Figura 4C).
6. Preparare le immagini da rilevare.
   NOTA: Il software consente di leggere solo una o cinque immagini alla volta. Leggere di più comporterà un errore.

4. Conteggio automatico delle celle

1. Aprire il software di conteggio (Figura 5A).
2. Fare clic su APRI IMMAGINE per importare l'immagine (Figura 5B).
3. Fare clic su RUN per consentire al software di contare automaticamente le celle (Figura 5C).
   NOTA: Il software contrassegnerà le celle contate con una casella quadrata rossa e visualizzerà il conteggio delle celle nell'angolo in alto a destra (Figura 5D).

Risultati

Questo protocollo descrive in dettaglio la metodologia per l'immunocolorazione a montaggio intero delle retine di topo, garantendo una meticolosa preparazione dei tessuti, un'incubazione precisa degli anticorpi e un conteggio automatizzato affidabile delle cellule. La procedura facilita la marcatura e la quantificazione robusta delle cellule gangliari retiniche (RGC), consentendo una valutazione accurata delle popolazioni cellulari in vari contesti sperimentali. Il metodo è stato utiliz...

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo per determinare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC) in una retina di topo, che può essere utilizzato per monitorare la progressione della degenerazione RGC in modelli murini per studi sul glaucoma. La retina del topo è un tessuto nervoso delicato⁵ e isolare le retine a montatura intera dagli occhi del topo richiede una pratica ripetuta. Durante la sperimentazione, è stato riscontrato che il tempo di fissazione influis...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100