Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

Riepilogo

Questo protocollo descrive la procedura per isolare la retina di topo a montaggio intero ed eseguire l'immunocolorazione per marcare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC). Il processo è seguito dall'imaging e dal conteggio automatico delle RGC utilizzando un software basato sull'intelligenza artificiale, fornendo un metodo semplice, veloce e accurato per quantificare le RGC nell'intera retina del topo.

Abstract

Il glaucoma è una delle principali cause di cecità a livello globale, caratterizzata da un complesso meccanismo patogenetico che rende difficile il ripristino della vista. I topi fungono da preziosi modelli animali per lo studio della patogenesi e del trattamento del glaucoma grazie al loro background genetico relativamente omogeneo e alle cellule gangliari retiniche (RGC), che assomigliano strutturalmente a quelle dell'uomo. Una valutazione accurata del danno da RGC e degli esiti del trattamento nei modelli murini di glaucoma richiede la determinazione del numero di RGC in tutta la retina. Questo protocollo delinea un metodo completo che prevede l'isolamento dell'intera retina, l'etichettatura delle RGC con anticorpi specifici e il conteggio automatico rapido e accurato delle RGC utilizzando un programma basato sull'intelligenza artificiale. L'approccio semplificato consente una quantificazione efficiente e precisa del numero di RGC nelle retine di topo, facilitando la valutazione della degenerazione RGC e i potenziali interventi terapeutici. Consentendo ai ricercatori di valutare l'entità del danno da RGC, questo protocollo contribuisce a una comprensione più profonda della patogenesi del glaucoma e aiuta a sviluppare strategie di trattamento efficaci per gestire e prevenire la perdita della vista.

Introduzione

Il glaucoma è caratterizzato dalla progressiva morte delle cellule ganglionari, che rappresenta una sfida significativa per il ripristino della vista ^1,2. Questa malattia è uno dei principali obiettivi della ricerca oftalmica a causa della sua prevalenza e del suo impatto sulla vista³. I modelli murini sono indispensabili nel glaucoma
ricerca a causa del loro background genetico omogeneo, dell'elevata capacità riproduttiva e della somiglianza delle loro proprietà delle cellule gangliari con gli esseri umani⁴. L'obiettivo princ....

Protocollo

La procedura è conforme alle linee guida dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'utilizzo degli animali nella ricerca ed è stata approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Ospedale popolare provinciale del Sichuan. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6J (di 2 mesi). La Figura 1 illustra la procedura generale qui descritta. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento di retine a montaggio intero

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo per determinare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC) in una retina di topo, che può essere utilizzato per monitorare la progressione della degenerazione RGC in modelli murini per studi sul glaucoma. La retina del topo è un tessuto nervoso delicato⁵ e isolare le retine a montatura intera dagli occhi del topo richiede una pratica ripetuta. Durante la sperimentazione, è stato riscontrato che il tempo di fissazione influis.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100