Иммуноокрашивание по всему массиву и автоматический подсчет ганглиозных клеток сетчатки мыши

Резюме

Этот протокол описывает процедуру выделения сетчатки мыши целиком и выполнения иммуноокрашивания для мечения всех ганглиозных клеток сетчатки (РГК). За этим процессом следует визуализация и автоматический подсчет RGC с помощью программного обеспечения на основе искусственного интеллекта, что обеспечивает простой, быстрый и точный метод количественного определения RGC во всей сетчатке мыши.

Аннотация

Глаукома является ведущей причиной слепоты во всем мире, характеризуясь сложным патогенным механизмом, который затрудняет восстановление зрения. Мыши служат ценными животными моделями для изучения патогенеза и лечения глаукомы благодаря их относительно однородному генетическому фону и ганглиозным клеткам сетчатки (РГК), которые структурно напоминают таковые у человека. Точная оценка повреждения РГК и результатов лечения в моделях глаукомы у мышей требует определения числа РГК по всей сетчатке. Этот протокол описывает комплексный метод, включающий изоляцию всей сетчатки, мечение РГК специфическими антителами и быстрый и точный автоматический подсчет РГК с помощью программы на основе искусственного интеллекта. Оптимизированный подход позволяет эффективно и точно количественно определять количество РГК в сетчатке мышей, облегчая оценку дегенерации РГК и потенциальных терапевтических вмешательств. Позволяя исследователям оценить степень повреждения РГК, этот протокол способствует более глубокому пониманию патогенеза глаукомы и помогает в разработке эффективных стратегий лечения для управления и предотвращения потери зрения.

Введение

Глаукома характеризуется прогрессирующей гибелью ганглиозных клеток, что представляет собой значительную проблему для восстановления зрения ^1,2. Это заболевание находится в центре внимания офтальмологических исследований из-за его распространенности и влияния на зрение³. Модели мышей незаменимы при глаукоме
исследования в связи с их однородным генетическим фоном, высокой репродуктивной способностью и сходством свойств ганглиозных клеток с человеческими⁴. Основной целью этого метода является точное количественное определение га....

протокол

Процедура соответствовала рекомендациям Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии по использованию животных в исследованиях и была одобрена Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Народной больницы провинции Сычуань. В данном исследовании использовались мыши-самцы C57Bl/6J (в возрасте 2 месяцев). На рисунке 1 показана общая процедура, описанная здесь. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Изоляция сетчатки целиком

1. Жертвоприн....

Результаты

В этом протоколе подробно описана методология полного иммуноокрашивания сетчатки мышей, обеспечивающая тщательную подготовку тканей, точную инкубацию антител и надежный автоматический подсчет клеток. Эта процедура способствует надежной маркировке и количественн?.......

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает метод определения всех ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в сетчатке мыши, который может быть использован для мониторинга прогрессирования дегенерации РГК на мышиных моделях для изучения глаукомы. Сетчатка мыши является нежной^не?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100