Иммуноокрашивание по всему массиву и автоматический подсчет ганглиозных клеток сетчатки мыши

Резюме

Этот протокол описывает процедуру выделения сетчатки мыши целиком и выполнения иммуноокрашивания для мечения всех ганглиозных клеток сетчатки (РГК). За этим процессом следует визуализация и автоматический подсчет RGC с помощью программного обеспечения на основе искусственного интеллекта, что обеспечивает простой, быстрый и точный метод количественного определения RGC во всей сетчатке мыши.

Аннотация

Глаукома является ведущей причиной слепоты во всем мире, характеризуясь сложным патогенным механизмом, который затрудняет восстановление зрения. Мыши служат ценными животными моделями для изучения патогенеза и лечения глаукомы благодаря их относительно однородному генетическому фону и ганглиозным клеткам сетчатки (РГК), которые структурно напоминают таковые у человека. Точная оценка повреждения РГК и результатов лечения в моделях глаукомы у мышей требует определения числа РГК по всей сетчатке. Этот протокол описывает комплексный метод, включающий изоляцию всей сетчатки, мечение РГК специфическими антителами и быстрый и точный автоматический подсчет РГК с помощью программы на основе искусственного интеллекта. Оптимизированный подход позволяет эффективно и точно количественно определять количество РГК в сетчатке мышей, облегчая оценку дегенерации РГК и потенциальных терапевтических вмешательств. Позволяя исследователям оценить степень повреждения РГК, этот протокол способствует более глубокому пониманию патогенеза глаукомы и помогает в разработке эффективных стратегий лечения для управления и предотвращения потери зрения.

Введение

Глаукома характеризуется прогрессирующей гибелью ганглиозных клеток, что представляет собой значительную проблему для восстановления зрения ^1,2. Это заболевание находится в центре внимания офтальмологических исследований из-за его распространенности и влияния на зрение³. Модели мышей незаменимы при глаукоме
исследования в связи с их однородным генетическим фоном, высокой репродуктивной способностью и сходством свойств ганглиозных клеток с человеческими⁴. Основной целью этого метода является точное количественное определение ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в мышиных моделях, что имеет важное значение для понимания патогенеза глаукомы и разработки соответствующих методов лечения.

Обоснование разработки этого метода проистекает из потребности в надежном и эффективном методе оценки дегенерации RGC в мышиных моделях. Традиционные методы, такие как мечение РГК в срезах сетчатки, часто дают ненадежные результаты из-за неравномерного распределения РГК в сетчатке⁵. Количественная оценка РГК по всей сетчатке лучше отражает изменения в их количестве и имеет решающее значение для оценки прогрессирования заболевания и терапевтических вмешательств.

Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с альтернативными методами. Например, ручной подсчет ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в нормальной сетчатке взрослой мыши, которая содержит от 40 000 до 60 000 ГСК, может занять много времени и подвержен ^{ошибкам.} Разработанное нами программное обеспечение для автоматического подсчета RGC позволяет проводить точный подсчет менее чем за 3 минуты, что потенциально экономит исследователям значительное количество времени. Кроме того, программное обеспечение на основе искусственного интеллекта, используемое для автоматического подсчета, сводит к минимуму смещение и улучшает воспроизводимость.

Кроме того, этот метод обеспечивает стандартизированный подход к оценке дегенерации РГК на различных моделях мышей и экспериментальных условиях, внося ценные данные в область исследований глаукомы. Этот метод согласуется с другими исследованиями, которые подчеркивают важность анализа всей сетчатки для понимания изменений сетчатки при заболеваниях⁹.

Чтобы помочь читателям определить, подходит ли этот метод для их применения, важно отметить, что этот метод особенно полезен для исследователей, изучающих дегенерацию ганглиозных клеток сетчатки (ГСК) у мышей с глаукомой или другими заболеваниями сетчатки. Метод адаптируется к различным экспериментальным установкам и обеспечивает высокую степень точности и эффективности подсчета RGC, что делает его идеальным как для небольших, так и для крупномасштабных исследований. Кроме того, простой дизайн протокола и наличие удобного программного обеспечения делают его доступным для исследователей с разным уровнем знаний в области анализа сетчатки.

протокол

Процедура соответствовала рекомендациям Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии по использованию животных в исследованиях и была одобрена Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Народной больницы провинции Сычуань. В данном исследовании использовались мыши-самцы C57Bl/6J (в возрасте 2 месяцев). На рисунке 1 показана общая процедура, описанная здесь. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Изоляция сетчатки целиком

1. Жертвоприношение животных
   1. Принесите мышей в жертву с помощью вывиха шейки матки (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) (рисунок 2A). До вывиха шейки матки,
      Обезболивайте мышей путем вдыхания изофлурана (3-5% кислорода) или внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина/ксилазина.
2. Энуклеация и обработка глазного яблока
   1. Отметьте синим маркером край роговицы на тыльной стороне глазного яблока, чтобы запомнить ориентацию при последующем рассечении.
   2. Удалите ножницами остаточные мышечные ткани, прикрепленные к глазному яблоку. Перенесите энуклеированное глазное яблоко в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл с круглым дном, наполненную 1x PBS, для кратковременного промывания (рис. 2C).
3. Фиксация
   1. Перенесите глазное яблоко в другую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл с круглым дном, содержащую свежеприготовленный 4% параформальдегид (PFA) для фиксации при 4 °C в течение 10 минут (рисунок 2D).
   2. Сделайте небольшой разрез (примерно 1-2 мм) на роговице с помощью тонких ножниц под препарирующим микроскопом.
   3. Поместите глазное яблоко обратно в фиксатор для дальнейшей фиксации при 4 °C в течение 3 ч, чтобы сохранить морфологию ткани (Рисунок 2D).
4. Удаление роговицы и хрусталика ^1,9
   1. Сделайте небольшой разрез примерно 1 мм вокруг роговичного лимба, границы между роговицей и склерой, с помощью тонких хирургических ножниц.
   2. Аккуратно разрежьте по окружности роговицы, иссекая ее полностью, чтобы обнажить нижележащие структуры.
   3. С помощью тонких щипцов аккуратно захватите и осторожно приподнимите хрусталик из окружающих тканей, чтобы предотвратить повреждение сетчатки. Поддерживайте структурную целостность сетчатки с помощью деликатных операций.
   4. Переложите наглазник в микроцентрифужную пробирку для дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иссекайте роговицу и извлекайте хрусталик более эффективно, используя технику «перекрестной щели»¹⁰. Сделайте два перпендикулярных разреза поперек роговицы и с помощью щипцов извлеките хрусталик.
5. Склеральный разрез
   1. Вырежьте точный разрез в склере тонкими офтальмологическими ножницами, чтобы облегчить последующие этапы рассечения (Рисунок 2J).
6. Отделение сетчатки
   1. Вставьте щипцы зубами в разрез между склерой и сетчаткой. Аккуратно возьмитесь за край склеры, избегая чрезмерной силы, чтобы не допустить разрыва ткани.
   2. Постепенно увеличивайте разрез, перемещая щипцы вдоль границы между склерой и сетчаткой медленными, уверенными движениями рук. Используйте зубчатую часть щипцов, чтобы аккуратно отделить склеру от сетчатки, убедившись, что сетчатка не повреждена (Рисунок 2J).
7. Резка сетчатки глаза
   1. Разделите сетчатку на четыре примерно одинаковых по размеру лоскута с помощью острых ножниц. Убедитесь, что разрезы находятся примерно на полпути к зрительному нерву и ориентированы под углом 90° друг к другу.
8. Чистка сетчатки глаза
   1. Аккуратно разверните рассеченную сетчатку с помощью щетки с мягкой щетиной и тщательно удалите мусор с ее поверхности (Рисунок 2K).
9. Окончательная фиксация
   1. Перенесите изолированную сетчатку в микроцентрифужную пробирку, содержащую свежий 4% ПФА, с помощью одноразовой пипетки Пастера. Оставьте фиксацию на льду еще на 5 часов или на ночь для сохранения тканей.

2. Иммуноокрашивание

1. Стирка
   1. Промойте изолированную цельную сетчатку в 1x PBS с легким перемешиванием в течение 5 минут. Откажитесь от раствора PBS. Повторите этот процесс дважды, чтобы удалить остаточный фиксатор и мусор.
2. Блокировка
   1. Погрузите отмытую сетчатку в блокирующий буферный раствор (1x PBS с 4% нормальной сывороткой крови осляка (NDS) и 0,2% Triton X-100) на 30 минут, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител и усилить проникновение (рис. 3A).
3. Первичная инкубация антител
   1. Замените блокирующий буфер первичным антителом BRN3A (разведенным в соотношении 1:200 в блокирующем буфере). Инкубируйте сетчатку в течение ночи при 4 °C, чтобы обеспечить связывание специфических антиген-антител (рис. 3B).
4. Стирка
   1. Промойте сетчатку три раза 1x PBS в течение 5 минут каждый, чтобы удалить несвязанные первичные антитела и уменьшить фоновое окрашивание (Рисунок 3C).
5. Вторичная инкубация антител
   1. Инкубируйте сетчатку с помощью Alexa594- или Alexa488-конъюгированного вторичного антитела против кролика (разбавленного 1:300) в течение 2 ч при комнатной температуре, чтобы визуализировать целевые антигены (рис. 3D).
6. Стирка
   1. Выполните три последовательных промывки 1x PBS в течение 5 минут каждое, чтобы удалить избыток вторичных антител и свести к минимуму неспецифическое связывание.
7. Установка
   1. Аккуратно перенесите окрашенную иммуновитамином сетчатку на предметное стекло микроскопа, осторожно сплющив ее, чтобы свести к минимуму складчатость или искажение.
   2. Нанесите небольшую каплю средства для защиты от выцветания в центр сетчатки, обеспечивая равномерное распределение по тканям.
   3. Осторожно расположите покровный стекло на установленной сетчатке, избегая попадания пузырьков воздуха (рис. 3E, F).

3. Обработка изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Импортируйте изображение в программу автоматического подсчета RGC и начните подсчет. Количество BRN3A-положительных клеток для всей сетчатки может быть получено за считанные минуты. Загрузите программное обеспечение AutoCount с GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Следуйте приведенным ниже инструкциям по установке программного обеспечения:

1. Скачайте код по ссылке GitHub . Вы получите файл с именем "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Распакуйте этот файл.
2. Скачайте необходимые файлы с облачного диска (см. Таблицу материалов) и распакуйте их. Скачанный файл называется "yolov5_cpu". Распакуйте этот пакет в текущую папку, чтобы избежать непредвиденных проблем.
3. Найдите файл конфигурации из шага 1 и измените его содержимое, указав на путь «yolov5_cpu».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если загруженный "yolov5_cpu" помещен в "D:\1me\yolov5_cpu_", измените файл "config.ini" на шаге 1 на "D:/1me/yolov5_cpu" (используйте / вместо \). (Рисунок 4А).
4. Откройте графический интерфейс, нажав на userinterface.exe. Первоначальная загрузка может быть медленной (запуск от имени администратора) (рис. 4B).
5. После открытия программного обеспечения проверьте, присутствует ли файл модели "pmse_plus.pt" в корневом каталоге диска C. Если его нет, скопируйте его в этот каталог.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Файл модели "pmse_plus.pt" находится в папке weights папки "yolov5", которая находится в извлеченной папке Intelligent-quantifying RGCs (Рисунок 4C).
6. Подготовьте изображения, которые будут обнаружены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение позволяет считывать только одну или пять картинок одновременно. Чтение большего количества приведет к ошибке.

4. Автоматический подсчет ячеек

1. Откройте программу для подсчета (рисунок 5A).
2. Нажмите кнопку ОТКРЫТЬ ИЗОБРАЖЕНИЕ , чтобы импортировать изображение (Рисунок 5B).
3. Нажмите кнопку RUN , чтобы программное обеспечение автоматически подсчитало ячейки (Рисунок 5C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение отметит подсчитанные ячейки красным квадратным прямоугольником и отобразит количество ячеек в правом верхнем углу (Рисунок 5D).

Результаты

В этом протоколе подробно описана методология полного иммуноокрашивания сетчатки мышей, обеспечивающая тщательную подготовку тканей, точную инкубацию антител и надежный автоматический подсчет клеток. Эта процедура способствует надежной маркировке и количественн?...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает метод определения всех ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в сетчатке мыши, который может быть использован для мониторинга прогрессирования дегенерации РГК на мышиных моделях для изучения глаукомы. Сетчатка мыши является нежной^не?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100