Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

요약

이 프로토콜은 전체 마운트 마우스 망막을 분리하고 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 표지하기 위해 면역염색을 수행하는 절차를 설명합니다. 그 다음에는 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 망막 신경절 세포를 이미징하고 자동으로 계수하여 전체 마우스 망막에서 망막 신경절 세포를 정량화하는 간단하고 빠르며 정확한 방법을 제공합니다.

초록

녹내장은 전 세계적으로 실명의 주요 원인이며, 시력 회복을 어렵게 만드는 복잡한 병원성 메커니즘이 특징입니다. 생쥐는 상대적으로 균질한 유전적 배경과 구조적으로 인간의 망막 신경절 세포(RGC)와 유사하기 때문에 녹내장의 발병 기전 및 치료를 연구하는 데 유용한 동물 모델 역할을 합니다. 생쥐 녹내장 모델에서 망막 신경절 손상 및 치료 결과를 정확하게 평가하려면 망막 전체에 걸친 망막 신경절 수치를 측정해야 합니다. 이 프로토콜은 망막 전체 분리, 특정 항체로 망막 신경절 세포를 라벨링, AI 기반 프로그램을 사용하여 망막 신경절 세포를 빠르고 정확하게 자동 계수하는 것과 관련된 포괄적인 방법을 설명합니다. 간소화된 접근법을 통해 생쥐 망막의 망막 신경절 수를 효율적이고 정밀하게 정량화할 수 있어 망막 신경절 변성 및 잠재적인 치료 개입을 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 망막 신경절 손상 정도를 평가할 수 있도록 함으로써 녹내장 발병 기전에 대한 깊은 이해에 기여하고 시력 상실을 관리하고 예방하기 위한 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 도움이 됩니다.

서문

녹내장은 신경절 세포의 점진적인 사멸을 특징으로 하며, 이는 시력 회복에 심각한 문제를 제기합니다 ^1,2. 이 질환은 유병률과 시력에 미치는 영향으로 인해 안과 연구의 주요 초점입니다³. 마우스 모델은 녹내장에 없어서는 안될 필수 요소입니다.
이들의 동질적인 유전적 배경, 높은 번식능력, 인간과의 신경절세포 특성의 유사성으로 인한 연구⁴. 이 방법의 주요 목표는 마우스 모델에서 망막 신경절 세포(RGC)를 정확하게 정량화하는 것이며, 이는 녹내장의 발병 기전을 이해하고 관련 치료법을 개발하는 데 필수적입니다.

이 기술을 개발하게 된 배경은 마우스 모델에서 망막 신경절 세포 변성을 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 효율적인 방법의 필요성에서 비롯됩니다. 망막 절편에서 망막 신경절 세포를 표지하는 것과 같은 전통적인 방법은 망막에서 망막 신경절 세포의 불균일한 분포로 인해 종종 신뢰할 수 없는 결과를 제공한다⁵. 망막 신경절 세포를 전체적으로 정량화하는 ....

프로토콜

이 시술은 동물을 연구에 사용하기 위한 시력 및 안과 연구 협회(Association for Research in Vision and Ophthalmology)의 지침을 준수했으며 쓰촨성 인민병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 C57Bl/6J 수컷 마우스(2개월령)가 사용되었습니다. 그림 1 은 여기에 설명된 전체 절차를 보여줍니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 전체 산속 망막의 분리

1. 동물 희생
   1. 자궁 경부 탈구를 사용하여 마우스를 희생시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름)(그림 2A). 경추 탈구가 발생하기 전,
      이소플루란(산소 중 3%-5%)을 흡입하거나 케타민/자일라진 혼합물의 복강 내 주사로 마우스를 마취시킵니다.
2. 적출 및 안구 처리
   1. 안구의 등쪽에 있는 각막의 가장자리를 파란색 마커로 표시하여 후속 절제 시 방향을 기억합니다....

토론

이 프로토콜은 생쥐 망막의 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 측정하는 방법을 제공하며, 이는 녹내장 연구를 위해 생쥐 모델에서 망막 신경절 변성의 진행을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 생쥐의 망막은 섬세한^{신경 조직이며}5, 생쥐의 눈에서 전체 산속 망막을 분리하려면 반복적인 연습이 필요하다. 실험 중에 고정 시간이 망막 형태에 큰 영향을 미.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100