Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

요약

이 프로토콜은 전체 마운트 마우스 망막을 분리하고 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 표지하기 위해 면역염색을 수행하는 절차를 설명합니다. 그 다음에는 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 망막 신경절 세포를 이미징하고 자동으로 계수하여 전체 마우스 망막에서 망막 신경절 세포를 정량화하는 간단하고 빠르며 정확한 방법을 제공합니다.

초록

녹내장은 전 세계적으로 실명의 주요 원인이며, 시력 회복을 어렵게 만드는 복잡한 병원성 메커니즘이 특징입니다. 생쥐는 상대적으로 균질한 유전적 배경과 구조적으로 인간의 망막 신경절 세포(RGC)와 유사하기 때문에 녹내장의 발병 기전 및 치료를 연구하는 데 유용한 동물 모델 역할을 합니다. 생쥐 녹내장 모델에서 망막 신경절 손상 및 치료 결과를 정확하게 평가하려면 망막 전체에 걸친 망막 신경절 수치를 측정해야 합니다. 이 프로토콜은 망막 전체 분리, 특정 항체로 망막 신경절 세포를 라벨링, AI 기반 프로그램을 사용하여 망막 신경절 세포를 빠르고 정확하게 자동 계수하는 것과 관련된 포괄적인 방법을 설명합니다. 간소화된 접근법을 통해 생쥐 망막의 망막 신경절 수를 효율적이고 정밀하게 정량화할 수 있어 망막 신경절 변성 및 잠재적인 치료 개입을 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 망막 신경절 손상 정도를 평가할 수 있도록 함으로써 녹내장 발병 기전에 대한 깊은 이해에 기여하고 시력 상실을 관리하고 예방하기 위한 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 도움이 됩니다.

서문

녹내장은 신경절 세포의 점진적인 사멸을 특징으로 하며, 이는 시력 회복에 심각한 문제를 제기합니다 ^1,2. 이 질환은 유병률과 시력에 미치는 영향으로 인해 안과 연구의 주요 초점입니다³. 마우스 모델은 녹내장에 없어서는 안될 필수 요소입니다.
이들의 동질적인 유전적 배경, 높은 번식능력, 인간과의 신경절세포 특성의 유사성으로 인한 연구⁴. 이 방법의 주요 목표는 마우스 모델에서 망막 신경절 세포(RGC)를 정확하게 정량화하는 것이며, 이는 녹내장의 발병 기전을 이해하고 관련 치료법을 개발하는 데 필수적입니다.

이 기술을 개발하게 된 배경은 마우스 모델에서 망막 신경절 세포 변성을 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 효율적인 방법의 필요성에서 비롯됩니다. 망막 절편에서 망막 신경절 세포를 표지하는 것과 같은 전통적인 방법은 망막에서 망막 신경절 세포의 불균일한 분포로 인해 종종 신뢰할 수 없는 결과를 제공한다⁵. 망막 신경절 세포를 전체적으로 정량화하는 것은 망막 신경절 세포의 개체 수 변화를 더 잘 반영하며, 이는 질병 진행 및 치료적 개입을 평가하는 데 매우 중요합니다.

이 방법은 대체 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 예를 들어, 40,000 - 60,000개의 망막 신경절 세포를 포함하는 정상 성인 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC)를 수동으로 계수하는 것은 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉽습니다 ^6,7,8. 당사가 개발한 자동 망막 신경절 계수 소프트웨어를 사용하면 3분 이내에 정확하게 계수할 수 있어 연구자들의 시간을 크게 절약할 수 있습니다. 또한 자동 계수에 사용되는 AI 기반 소프트웨어는 편향을 최소화하고 재현성을 향상시킵니다.

또한 이 기술은 다양한 마우스 모델 및 실험 조건에서 망막 신경절 변성을 평가하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공하여 녹내장 연구 분야에 귀중한 데이터를 제공합니다. 이 방법은 질병의 망막 변화를 이해하기 위한 전산 망막 분석의 중요성을 강조하는 다른 연구와 일치한다⁹.

독자가 이 방법이 자신의 응용 분야에 적합한지 여부를 결정하는 데 도움이 되도록 이 기술은 녹내장 또는 기타 망막 질환의 마우스 모델에서 망막 신경절 세포(RGC) 변성을 연구하는 연구자에게 특히 유리하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 방법은 다양한 실험 설정에 적용할 수 있으며 망막 신경절 세포 계수에서 높은 수준의 정확도와 효율성을 제공하므로 소규모 및 대규모 연구 모두에 이상적입니다. 또한 프로토콜의 간단한 설계와 사용자 친화적인 소프트웨어의 가용성으로 인해 망막 분석에 대한 다양한 수준의 전문 지식을 가진 연구원이 액세스할 수 있습니다.

프로토콜

이 시술은 동물을 연구에 사용하기 위한 시력 및 안과 연구 협회(Association for Research in Vision and Ophthalmology)의 지침을 준수했으며 쓰촨성 인민병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 C57Bl/6J 수컷 마우스(2개월령)가 사용되었습니다. 그림 1 은 여기에 설명된 전체 절차를 보여줍니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 전체 산속 망막의 분리

1. 동물 희생
   1. 자궁 경부 탈구를 사용하여 마우스를 희생시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름)(그림 2A). 경추 탈구가 발생하기 전,
      이소플루란(산소 중 3%-5%)을 흡입하거나 케타민/자일라진 혼합물의 복강 내 주사로 마우스를 마취시킵니다.
2. 적출 및 안구 처리
   1. 안구의 등쪽에 있는 각막의 가장자리를 파란색 마커로 표시하여 후속 절제 시 방향을 기억합니다.
   2. 안구에 붙어있는 잔류 근육 조직을 가위로 제거합니다. 적출된 안구를 1x PBS로 채워진 2mL 둥근 바닥 미세 원심분리기 튜브로 옮겨 잠시 헹궈냅니다(그림 2C).
3. 고정
   1. 안구를 4°C에서 10분 동안 고정하기 위해 갓 만든 4% 파라포름알데히드(PFA)가 들어 있는 다른 2mL 둥근 바닥 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다(그림 2D).
   2. 해부 현미경으로 가는 가위를 사용하여 각막을 작게 절개(약 1-2mm)합니다.
   3. 조직 형태를 보존하기 위해 4°C에서 3시간 동안 추가로 고정하기 위해 안구를 고정액에 다시 넣습니다(그림 2D).
4. 각막과 수정체 제거 ^1,9
   1. 가는 수술용 가위를 사용하여 각막과 공막 사이의 경계인 각막 림부 주위를 약 1mm의 작은 절개를 합니다.
   2. 각막 둘레를 조심스럽게 자르고 완전히 절제하여 아래 구조를 노출시킵니다.
   3. 미세한 집게를 사용하여 주변 조직에서 수정체를 부드럽게 잡고 조심스럽게 들어 올려 망막의 손상을 방지합니다. 섬세한 조작으로 망막의 구조적 무결성을 유지합니다.
   4. 추가 처리를 위해 아이컵을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
      참고: 각막을 절제하고 "크로스 슬릿" 기법을 사용하여 수정체를 보다 효율적으로 추출합니다¹⁰. 각막을 가로질러 두 개의 수직 슬릿을 만들고 겸자를 사용하여 수정체를 추출합니다.
5. 공막 절개
   1. 미세한 안과 가위로 공막의 정확한 틈새를 잘라 후속 절개 단계를 용이하게 합니다(그림 2J).
6. 망막 분리
   1. 공막과 망막 사이의 절개 부위에 이빨이 있는 겸자를 삽입합니다. 조직이 찢어지는 것을 방지하기 위해 과도한 힘을 가하지 않도록 공막의 가장자리를 부드럽게 잡습니다.
   2. 천천히 꾸준한 손동작으로 공막과 망막 사이의 경계를 따라 겸자를 움직여 절개 부위를 서서히 확대합니다. 겸자의 톱니 부분을 사용하여 공막을 망막에서 조심스럽게 분리하여 망막이 손상되지 않도록 합니다(그림 2J).
7. 망막 절단
   1. 날카로운 가위를 사용하여 망막을 대략 같은 크기의 4개의 플랩으로 나눕니다. 절개가 시신경을 향해 대략 절반 정도 있고 서로 90° 방향인지 확인합니다.
8. 망막 세척
   1. 부드러운 칫솔모를 사용하여 절개된 망막을 부드럽게 펴고 표면의 이물질을 꼼꼼하게 제거합니다(그림 2K).
9. 최종 고정
   1. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 분리된 망막을 새로운 4% PFA가 포함된 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 조직 보존을 위해 추가로 5시간에서 하룻밤 동안 얼음에 고정하십시오.

2. 면역염색

1. 세탁
   1. 1x PBS에서 5분 동안 부드러운 교반으로 고립된 전체 마운트 망막을 세척합니다. PBS 솔루션을 폐기합니다. 이 과정을 두 번 반복하여 잔류 정착액과 부스러기를 제거합니다.
2. 블로킹
   1. 세척된 망막을 차단 완충 용액(4% 일반 당나귀 혈청(NDS) 및 0.2% Triton X-100이 포함된 PBS 1개)에 30분 동안 담그면 비특이적 항체 결합을 방지하고 투과성을 향상시킬 수 있습니다(그림 3A).
3. 1차 항체 배양
   1. 차단 완충액을 1차 항체 BRN3A(차단 완충액에서 1:200 희석)로 교체합니다. 특정 항원-항체 결합을 허용하기 위해 4°C에서 밤새 망막을 배양합니다(그림 3B).
4. 세탁
   1. 1x PBS로 각각 5분씩 망막을 3회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거하고 배경 염색을 줄입니다(그림 3C).
5. 2차 항체 배양
   1. 상온에서 2시간 동안 Alexa594 또는 Alexa488 접합 항토끼 2차 항체(1:300으로 희석)로 망막을 배양하여 표적 항원을 시각화합니다(그림 3D).
6. 세탁
   1. 1x PBS로 각각 5분씩 3회 연속 세척하여 과도한 2차 항체를 제거하고 비특이적 결합을 최소화합니다.
7. 장착
   1. 면역 염색된 망막을 유리 현미경 슬라이드에 부드럽게 옮기고 접힘이나 뒤틀림을 최소화하기 위해 조심스럽게 평평하게 만듭니다.
   2. 페이드 방지 장착 매체를 망막 중앙에 소량 떨어뜨려 조직 전체에 고르게 분포되도록 합니다.
   3. 기포를 피하면서 장착된 망막 위에 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다(그림 3E,F).

3. 이미지 처리

알림: 이미지를 RGC 자동 계산 소프트웨어로 가져오고 계산을 시작합니다. 전체 망막에 대한 BRN3A 양성 세포의 수는 몇 분 안에 얻을 수 있습니다. GitHub(https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs)에서 AutoCount 소프트웨어를 다운로드합니다. 아래 소프트웨어에 대한 자세한 설치 단계를 따르십시오.

1. GitHub 링크에서 코드를 다운로드합니다. 하나는 "Intelligent-quantifying-RGCs.zip"라는 파일을 받게됩니다. 이 파일의 압축을 풉니다.
2. 클라우드 디스크에서 필요한 파일을 다운로드하고(자료 표 참조) 압축을 풉니다. 다운로드한 파일의 이름은 "yolov5_cpu"입니다. 예기치 않은 문제를 방지하려면 이 패키지를 현재 폴더에 압축을 풉니다.
3. 1단계에서 구성 파일을 찾아 "yolov5_cpu" 경로를 가리키도록 내용을 수정합니다.
   참고: 예를 들어 다운로드한 "yolov5_cpu"가 "D:\1me\yolov5_cpu_"에 있는 경우 1단계의 "config.ini" 파일을 "D:/1me/yolov5_cpu"로 변경합니다(\ 대신 / 사용). (그림 4A).
4. userinterface.exe를 클릭하여 그래픽 인터페이스를 엽니다. 초기 로딩이 느릴 수 있습니다(관리자 권한으로 실행)(그림 4B).
5. 소프트웨어를 연 후 "pmse_plus.pt" 모델 파일이 C 드라이브의 루트 디렉토리에 있는지 확인합니다. 없는 경우 이 디렉토리에 복사합니다.
   참고: "pmse_plus.pt" 모델 파일은 추출된 Intelligent-quantifying RGCs 폴더에 있는 "yolov5" 폴더의 weights 폴더에 있습니다(그림 4C).
6. 감지할 이미지를 준비합니다.
   참고: 이 소프트웨어는 한 번에 하나 또는 5개의 사진만 읽을 수 있습니다. 더 많이 읽으면 오류가 발생합니다.

4. 자동 세포 계수

1. 계수 소프트웨어를 엽니다(그림 5A).
2. OPEN IMAGE를 클릭하여 이미지를 가져옵니다(그림 5B).
3. RUN을 클릭하면 소프트웨어가 자동으로 셀 수를 계산할 수 있습니다(그림 5C).
   알림: 소프트웨어는 계산된 셀을 빨간색 사각형 상자로 표시하고 오른쪽 상단 모서리에 셀 수를 표시합니다(그림 5D).

결과

이 프로토콜은 마우스 망막의 전체 마운트 면역염색을 위한 방법론을 자세히 설명하여 세심한 조직 준비, 정확한 항체 배양 및 신뢰할 수 있는 자동 세포 계수를 보장합니다. 이 절차는 망막 신경절 세포(RGC)의 강력한 라벨링 및 정량화를 용이하게 하여 다양한 실험 상황에서 세포 집단을 정확하게 평가할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 야생형 및 녹내장 모델링 마우스...

토론

이 프로토콜은 생쥐 망막의 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 측정하는 방법을 제공하며, 이는 녹내장 연구를 위해 생쥐 모델에서 망막 신경절 변성의 진행을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 생쥐의 망막은 섬세한^{신경 조직이며}5, 생쥐의 눈에서 전체 산속 망막을 분리하려면 반복적인 연습이 필요하다. 실험 중에 고정 시간이 망막 형태에 큰 영향을 미...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100