A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تمتلك Exosomes إمكانات سريرية كبيرة ، لكن تطبيقها العملي محدود بسبب سهولة إزالة الجسم الحي وضعف الاستقرار. تقدم الإبر الدقيقة حلا من خلال تمكين التسليم الموضعي عن طريق ثقب الحواجز الفسيولوجية والحفاظ على الحالة الجافة ، وبالتالي معالجة قيود إعطاء الإكسوسوم وتوسيع فائدتها السريرية.

Abstract

تمتلك الإكسوسومات ، باعتبارها "الجيل التالي" من العلاجات الحيوية الناشئة ونواقل توصيل الأدوية ، إمكانات هائلة في مجالات طبية حيوية متنوعة ، تتراوح من توصيل الأدوية والطب التجديدي إلى تشخيص الأمراض والعلاج المناعي للأورام. ومع ذلك ، فإن التخليص السريع عن طريق حقن البلعة التقليدية وضعف استقرار الإكسوسومات يحد من تطبيقها السريري. تعمل الإبر الدقيقة كحل يطيل وقت بقاء الإكسوسومات في موقع الإدارة ، وبالتالي الحفاظ على تركيز الدواء وتسهيل التأثيرات العلاجية المستدامة. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك الإبر الدقيقة أيضا القدرة على الحفاظ على استقرار المواد النشطة بيولوجيا. لذلك ، نقدم رقعة إبرة مجهرية لتحميل وتوصيل الإكسوسومات ونشارك الطرق ، بما في ذلك عزل الإكسوسومات ، وتصنيع ، وتوصيف بقع الإبر الدقيقة المحملة بالإكسوسوم. تم تصنيع رقع الإبرة الدقيقة باستخدام تريهالوز وحمض الهيالورونيك كمواد طرف والبولي فينيل بيروليدون كمادة داعمة من خلال طريقة صب من خطوتين. أظهرت الإبر الدقيقة قوة ميكانيكية قوية ، مع نصائح قادرة على تحمل 2 N. تم استخدام جلد الخنزير لمحاكاة جلد الإنسان ، وذابت أطراف الإبر الدقيقة تماما في غضون 60 ثانية بعد ثقب الجلد. أظهرت الإكسوسومات المنبعثة من الإبر الدقيقة مورفولوجيا وحجم الجسيمات وبروتينات العلامات والوظائف البيولوجية المماثلة لتلك الموجودة في الإكسوسومات الطازجة ، مما مكن الخلايا المتغصنة من امتصاص وتعزيز نضجها.

Introduction

تم اقتراح Exosomes ، وهي حويصلات صغيرة تطلقها الخلايا في المصفوفة خارج الخلية ، كعلاجات حيوية محتملة ونواقل توصيل الأدوية لعلاج العديد من الأمراض والسرطانات1. أثناء عملية التكوين الحيوي ، تغلف الإكسوسومات جزيئات نشطة بيولوجيا مختلفة من داخل الخلايا ، بما في ذلك البروتينات الوظيفية والأحماض النووية2. نتيجة لذلك ، عندما تمتصها الخلايا المتلقية أثناء عملية النقل ، فإن الإكسوسومات لديها القدرة على تعديل التعبير الجيني والوظائف الخلوية في الخلايا المستهدفة3. كنوع من رسول المعلومات الطبيعية ، تم الاستفادة الكاملة من exosomes في تجديد الأنسجة ، وتنظيم المناعة ، وكناقل توصيل4. من خ....

Protocol

لا تتطلب هذه الدراسة تصريحا أخلاقيا لأن جلد الخنزير المستخدم في التجارب الموصوفة في القسم 3 تم شراؤه كآذان خنازير صالحة للأكل من السوق ولم يتم الحصول عليه من التجارب.

1. عزل الإكسوسومات

  1. زراعة الخلايا
    1. زراعة خلايا سرطان المبيض الظهارية للفأر ID8 في وسط زراعة النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ محلول بنسلين ستربتومايسين (100×) (انظر جدول المواد) في أطباق بتري بقطر 15 سم.
    2. احتضان خلايا ID8 في حاضنة CO2 (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى تصل كثافة الخلية إلى 90٪.
  2. عزل الإكسوسوم....

النتائج

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل exosomes وتصنيع وتوصيف رقعة exo@MN. يوضح الشكل 1 المخطط الانسيابي للعملية لتصنيع رقعة exo@MN. تم خلط الإكسوسومات مع تريهالوز و HA ، ثم تمت إضافة الخليط إلى قالب الإبرة الدقيقة والطرد المركزي. سهلت هذه العملية تجميع الإكسوسومات عند أطراف الإبرة ، مما عزز الإطل.......

Discussion

حاليا ، تشمل الطرق الرئيسية لعزل الإكسوسومات الطرد المركزي الفائق ، والطرد المركزي المتدرج الكثافة ، والترشيح الفائق ، وهطول الأمطار ، والخرز المغناطيسي المناعي ، وعلم الموائع الدقيقة24. نظرا لقدرة التحميل المحدودة للإبر الدقيقة الناتجة عن مساحة طرف الإبرة الصغيرة ، من الضر.......

Disclosures

H. C. ، F.L.Q ، و S.J.M هم مخترعون في طلب براءة اختراع تم تقديمه بناء على البيانات الواردة في هذه المخطوطة. HC هو المؤسس العلمي لشركة Medcraft Biotech. شركه.

Acknowledgements

تقدر FQ الدعم المقدم من برنامج البحث والتطوير الرائد في تشجيانغ (2022C03031) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFA0910103) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (22274141 ، 22074080) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة شاندونغ (ZR2022ZD28) وبرنامج تايشان للباحثين في مقاطعة شاندونغ (tsqn201909106). ويقر صاحب البلاغ بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82202329). يقر المؤلفون باستخدام الأدوات في المرفق الأساسي للأجهزة المشتركة في معهد هانغتشو للطب (HIM) ، الأكاديمية الصينية للعلوم.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100x penicillin-streptomycin solutionsJrunbio ScientificMA0110Cell culture
180 kDa pre-stained protein markerThermo26616Western blotting
3% Uranyl acetateHenan Ruixin Experimental SuppliesGZ02625Morphological characterization of exosomes
3D printerBMF technologynanoArch S130Mold preparation
4%–20% precast gelGenscriptExpressPlus PAGE GELWestern blotting
5× SDS-PAGE loading bufferTitan04048254Western blotting
Anti-mouse Alix antibodyBiolegend12422-1-APWestern blotting
Anti-mouse CD63 antibodyBiolegendab217345Western blotting
APC anti-mouse CD80 antibodyBiolegend104713Antibody
Auto fine coaterZIZHUJBA5-100Morphological characterization of microneedle
BCA assay kitBeyotimeP0012Protein concentration assay
CentrifugeThermo FisherMuitifuge X1R proCell centrifuge
Circulating water vacuum pumpYuhua InstrumentSHZ-D(III)Filtration
CO2 incubatorEppendorfCellXpert C170Cell culture
Confocal laser scanning microscopeNikonA1HD25Fluorescence imaging
Copper meshBeijing Zhongjingkeyi Technology JF-ZJKY/300Morphological characterization of exosomes
D- (+) -Trehalose dihydrateAladdin5138-23-4Fabrication of microneedle 
Dulbecco’s modified Eagle’s mediumMeilunbioMA0212Cell culture
Dulbecco’s phosphate-buffered salineMeilunbioMA0010Cell culture
Electrophoresis systemBio-radPowerPac-basicWestern blotting
Fetal bovine serumJrunbio ScientificJR100Cell culture
FITC anti-mouse CD11c antibodyBiolegend117305Antibody
Flow cytometryBDLSR FortessaFluorescence detection
Gel imagerCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
HRP-conjugated anti-rabbit IgGCST7074SWestern blotting
HTL resinBMF technologyMold preparation
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)Bloomage Biotechnology9004-61-9Fabrication of microneedle 
Immersion oilNikonMXA22168Fluorescence imaging
Ion cleanerJEOLEC-52000ICMorphological characterization of exosomes
MicroscopeOlympusCKX53Observe the microneedle tip dissolving process
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8MeisenCTCC CC90105Cell culture
Nanoparticle tracking analysisParticle MetrixZetaViewSize analysis of exosomes
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibodyBiolegend107619Antibody
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotimeST507Protease inhibitors
Plasma cleanerHefei Kejing Material TechnologyPDC-36GFabrication of microneedle 
PolydimethylsiloxaneDow Corning9016-00-6Mold preparation
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)Aladdin9003-39-8Fabrication of microneedle 
Prism GraphPadVersion 9Statistical analysis
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western blotting
Quick-snap centrifugeBeckman344619Exosomes extraction
RIPA lysis bufferApplygenC1053Lysis membrane
Roswell park memorial institute 1640MeilunbioMA0548Cell culture
Scanning electron microscopeJEOLJSM-IT800Morphological characterization of microneedle
Stereo microscopeOlympusSZX16Characterization of morphology
Super ECL detection reagentApplygenP1030Western blotting
Tensile meterInstron68SC-05Mechanical testing
Transmission electron microscopeJEOLJEM-2100plusMorphological characterization of exosomes
Tris buffered salineSangon BiotechJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosomes extraction
Ultrafiltration tubeMilliporeUFC910096Exosomes concentration
Vacuum drying ovenShanghai Yiheng TechnologyDZF-6024Fabrication of microneedle
Vacuum filtration systemBiosharpBS-500-XTFiltration

References

  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved