JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Экзосомы обладают значительным клиническим потенциалом, но их практическое применение ограничено из-за легкого клиренса in vivo и плохой стабильности. Микроиглы представляют собой решение, обеспечивающее локализованную доставку путем прокола физиологических барьеров и сохранения в сухом состоянии, тем самым устраняя ограничения введения экзосом и расширяя их клиническую полезность.

Аннотация

Экзосомы, как новые биотерапевтические средства «следующего поколения» и векторы доставки лекарств, обладают огромным потенциалом в различных областях биомедицины, начиная от доставки лекарств и регенеративной медицины и заканчивая диагностикой заболеваний и иммунотерапией опухолей. Однако быстрый клиренс при традиционной болюсной инъекции и плохая стабильность экзосом ограничивают их клиническое применение. Микроиглы служат раствором, который продлевает время пребывания экзосом в месте введения, тем самым поддерживая концентрацию препарата и способствуя длительному терапевтическому эффекту. Кроме того, микроиглы также обладают способностью поддерживать стабильность биоактивных веществ. Поэтому мы представляем пластырь с микроиглами для загрузки и доставки экзосом и делимся методами, включая выделение экзосом, изготовление и характеристику нагруженных экзосомами микроигольчатых пластырей. Пластыри с микроиглами были изготовлены с использованием трегалозы и гиалуроновой кислоты в качестве материалов наконечника и поливинилпирролидона в качестве основного материала с помощью двухэтапного метода литья. Микроиглы продемонстрировали высокую механическую прочность, а наконечники были способны выдержать 2 Н. Для имитации человеческой кожи использовалась свиная кожа, и кончики микроигл полностью расплавились в течение 60 с после прокола кожи. Экзосомы, высвобождаемые из микроигл, демонстрировали морфологию, размер частиц, маркерные белки и биологические функции, сопоставимые с таковыми у свежих экзосом, что позволяло дендритным клеткам поглощать и способствовать их созреванию.

Введение

Экзосомы, которые представляют собой небольшие везикулы, высвобождаемые клетками во внеклеточный матрикс, были предложены в качестве потенциальных биотерапевтических средств и векторов доставки лекарств для лечения ряда заболеваний и видоврака. В процессе биогенеза экзосомы инкапсулируют различные биологически активные молекулы из клеток, включая функциональные белки и нуклеиновыекислоты. В результате, поглощаемые клетками-реципиентами в процессе транспортировки, экзосомы обладают способностью модулировать экспрессию генов и клеточные функциив клетках-мишенях. В качестве своего рода естественного посланника информации экзосомы были в полной мере использованы в регенерации тканей, иммунной регуляции и вкачестве носителя доставки. С помощью инженерных методов специфические лиганды могут быть обогащены на поверхности экзосом, что позволяет индукционизировать или ингибировать сигнальные события в клетках-реципиентах или нацеливаться на определенные типы клеток. Химиотерапевтические агенты также могут быть загружены в экзосомы для лечения рака6. Кроме того, экзосомы обладают способностью пересекать гематоэнцефалический барьер для доставки терапевтического груза, что делает их весьма перспективными для лечения заболеваний головногомозга. По сравнению с липосомами, экзосомы демонстрируют повышенное поглощение клетками и улучшенную биосовместимость. Они способны эффективно проникать в другие клетки, демонстрируя при этом лучшую переносимость и меньшую токсичность9. Тем не менее, традиционная болюсная инъекция экзосом подвержена секвестрации и быстрому выведению печенью, почками и селезенкой вкровоток. Кроме того, экзосомы обладают плохой стабильностью in vitro и чувствительны к условиям хранения, которые ограничивают ихклиническое применение.

Микроиглы, представляющие собой массив наконечников игл микрометрического размера, обладают способностью проникать через физиологические барьеры для доставки низкомолекулярных лекарств12, белков13, нуклеиновых кислот14 и нанолекарств15. Микроиглы точно спроектированы для нацеливания на поражения на поверхности кожи, а их дисперсные кончики обеспечивают равномерное распределение лекарств в целевом участке, тем самым усиливая их терапевтическое воздействие16. Конструкция и состав материала микроигл облегчают сухое хранение биологически активных веществ, таких как белки и нуклеиновые кислоты, повышая их стабильность17. Традиционные инъекционные методы имеют относительно короткую продолжительность действия и могут вызывать боль, вызывая страх у пациентов18. Микрометровая длина микроиглы сводит к минимуму травмирование тканей и предотвращает стимуляцию нервов, тем самым устраняя боль и улучшая комплаентность пациента19. Кроме того, удобный в использовании характер микроигл позволяет пациентам самостоятельно проводить лечение без необходимости использования специализированного персонала16. Помимо кожи, микроиглы также могут быть использованы в таких тканях, как глаза20, слизистая оболочка полости рта21, сердце22 и кровеносные сосуды23. Применение микроигл для клинической доставки экзосом обеспечивает многообещающую и перспективную стратегию.

В связи с этим мы представляем пластырь с микроиглами (exo@MN), нагруженный экзосомами, и раскрываем метод его изготовления. Пластыри с микроиглами были изготовлены с использованием двухэтапного метода литья, наряду с центрифугированием и вакуумной сушкой, что способствует агрегации экзосом на кончиках микроигл, тем самым повышая эффективность доставки. Как кончики игл, так и подложка были изготовлены с использованием материалов, которые демонстрируют превосходную биосовместимость и растворимость в воде. Трегалоза и гиалуроновая кислота (ГК) были включены в качестве материалов наконечника для обеспечения защиты экзосом, а поливинилпирролидон (ПВП), растворенный в абсолютном этаноле, был выбран в качестве основного материала. Морфологию микроигольчатого пластыря охарактеризовали с помощью микроскопии и сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). Механические испытания микроигл оценивались с помощью растяжителя, чтобы подтвердить их способность проникать в кожу, а скорость высвобождения из кожи свиньи была исследована как 60 с. Кроме того, морфология, размер и содержание белка как в свежих экзосомах, так и в экзосомах в exo@MN были охарактеризованы с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM), анализа отслеживания наночастиц (NTA) и вестерн-блоттинга (WB). Интернализацию экзосом дендритными клетками (ДК) охарактеризовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ), а созревание ДК оценивали с помощью проточной цитометрии. Морфологическая характеристика и биологические функции двух типов экзосом в основном согласуются.

протокол

Данное исследование не требует этического разрешения, поскольку свиная кожа, использованная для экспериментов, описанных в разделе 3, была приобретена в качестве съедобных свиных ушей на рынке, а не получена от экспериментальных животных.

1. Выделение экзосом

  1. Культура клеток
    1. Культивировать эпителиальные клетки рака яичников мышей ID8 в культуральной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% раствор пенициллин-стрептомицина (100×) (см. Таблицу материалов) в чашках Петри диаметром 15 см.
    2. Инкубируйте клетки ID8 в инкубаторе сCO2 (см. Таблицу материалов) при 37 °C и 5% CO2 до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 90%.
  2. Выделение экзосом
    1. Удалите питательную среду из чашек Петри и дважды промойте фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS). Добавьте 20 мл DMEM без фетальной бычьей сыворотки (см. Таблицу материалов) и раствор пенициллин-стрептомицина (см. Таблицу материалов). Продолжайте инкубацию при 37 °C и 5%CO2 в течение 48 часов.
    2. Соберите надосадочную жидкость клеточной культуры из 20 чашек Петри диаметром 15 см. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C и соберите надосадочную жидкость для удаления свободных клеток.
    3. Центрифугируйте при 2000 x g в течение 10 мин 4 °C и соберите надосадочную жидкость для удаления клеточного мусора.
    4. Подключите одноразовую систему вакуумной фильтрации 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) к вакуумному насосу циркуляционной воды (см. Таблицу материалов). Создание вакуума, позволяющего надосадочной жидкости проходить через мембрану из полиэфирсульфонового слоя толщиной 0,22 мкм и попадать в нижнюю камеру системы фильтрации, эффективно удаляя из надосадочной жидкости везикулы или примеси размером более 0,22 мкм.
      1. Чтобы подключить вакуумный насос, включите переключатель насоса, а затем подключите его к воздухозаборнику системы вакуумной фильтрации. При закрытии сначала отсоедините соединение с насосом, а затем выключите вакуумный насос. Эта процедура помогает предотвратить обратный поток вакуумного насоса и загрязнение питательной жидкости.
    5. Добавьте 15 мл надосадочной жидкости во внутреннюю трубку ультрафильтрационной трубки с давлением 100 кДа (см. Таблицу материалов). Центрифугируйте при 3500 x g в течение 10 минут при 4 °C и удалите жидкость из внешней пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживайте частицы с массой более 100 кДа на внутренней мембране трубки, в то время как белки с массой менее 100 кДа будут центрифугироваться во внешнюю пробирку вместе с раствором. Экзосомы имели размер более 100 кДа и агрегировались на мембране внутренней трубки.
    6. Повторяйте вышеуказанные действия до тех пор, пока общий объем жидкости не окажется в пределах 5 мл. Соберите жидкость из внутренней трубки и добавьте 1 мл DPBS. С помощью пипетки многократно проводите пипетку во внутреннюю трубку, обеспечивая ресуспендирование прикрепленных экзосом в DPBS, а затем соберите их.
    7. Центрифугируйте при давлении 10000 x g в течение 60 мин при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в быстросъемную центрифужную пробирку объемом 6 мл (см. Таблицу материалов). Запечатайте трубку термосварщиком.
    8. Центрифугируйте при давлении 100 000 x g в течение 2 ч 4 °C с использованием ультрацентрифуги (см. Таблицу материалов). Разрежьте быстрозащелкивающуюся пробирку центрифуги, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу в 100 μл DPBS. Это экзосомное решение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе повторного взвешивания гранулы необходимо пипетировать и перемешивать стенку трубки не менее 200 раз с помощью пипетки.

2. Изготовление exo@MN

  1. Подготовка мастер-формы
    1. Постройте модель микроигл с матрицей 10 x 10 с помощью программного обеспечения CAD, с наконечниками конической формы со следующими параметрами: высота 1200 мкм, диаметр основания 400 мкм и шаг (расстояние между соседними микроиглами) 900 мкм.
    2. Используйте смолу HTL в качестве материала и напечатайте мастер-форму микроиглы с помощью 3D-принтера (см. Таблицу материалов).
    3. Погрузите мастер-форму в абсолютный этанол на 1 час, чтобы удалить смолу, прилипшую к поверхности.
    4. Подвергните форму воздействию ультрафиолета на 5 минут, чтобы она затвердела.
    5. Еще раз погрузите форму в абсолютный этанол на 1 ч, после чего высушите при 60 °C в сушильном шкафу в течение 1 ч. Мастер-форма готова.
  2. Подготовка производственной формы
    1. Смешайте компоненты А и В полидиметилсилоксана (ПДМС, см. Таблицу материалов) в соотношении 10:1. Хорошо перемешайте и вылейте смесь в мастер-форму.
    2. Поместите форму PDMS под давление 1 фунт на квадратный дюйм на 15 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из смеси PDMS.
    3. Отверждите пресс-форму PDMS при 60 °C в течение 2 часов, а затем очистите до получения производственной формы микроиглы.
    4. Перед использованием очистите производственную форму сверхчистой водой.
  3. Приготовление раствора
    1. Количественно оцените содержание белка в растворе экзосомы с помощью набора для анализа BCA (см. Таблицу материалов). Добавьте соответствующее количество DPBS для достижения концентрации 10 мкг/мкл для раствора экзосомы.
    2. Приготовьте раствор трегалозы 200 мг/мл (см. Таблицу материалов) с использованием DPBS в качестве растворителя. Помешивайте в течение 20 минут, чтобы обеспечить полное растворение.
    3. Приготовьте раствор гиалуроновой кислоты (ГК) в концентрации 200 мг/мл (ГК, см. Таблицу материалов) с использованием DPBS в качестве растворителя. Перемешайте в течение ночи, чтобы обеспечить полное растворение.
    4. Приготовьте раствор поливинилпирролидона 150 мг/мл (ПВП, см. Таблицу материалов) с использованием абсолютного этанола в качестве растворителя. Перемешайте в течение ночи, чтобы обеспечить полное растворение.
    5. Смешайте раствор экзосомы (10 мкг/мкл) и раствор трегалозы (200 мг/мл) в соотношении 1:1 по объему. Затем добавьте равный объем раствора гиалуроновой кислоты (200 мг/мл). Тщательно перемешайте до получения кончика раствора.
  4. Изготовление exo@MN
    1. Обрабатывайте поверхность пресс-формы PDMS с помощью плазменного очистителя (см. Таблицу материалов) в течение 30 с при низком уклоне для повышения ее гидрофильности.
    2. Добавьте 40 μл раствора наконечника в форму PDMS. Центрифугируйте при комнатной температуре (RT) и 3000 x g в течение 3 минут, чтобы жидкость заполнила слой иглы формы.
    3. Удалите лишнюю жидкость из формы и высушите при температуре RT в вакуумной сушильной печи (см. Таблицу материалов) в течение 1 суток.
    4. Добавьте 200 μл раствора ПВП в форму PDMS. Центрифугируйте 3000 x g в течение 3 минут при RT, чтобы жидкость заполнила подкладочный слой формы.
    5. Высушите форму по RT в сушильном шкафу в течение 1 суток, затем демолд до получения exo@MN заплатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните пластырь exo@MN в сушильном шкафу до тех пор, пока он не будет готов к использованию.

figure-protocol-7684
Рисунок 1: Процесс изготовления exo@MN патчей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Характеристика exo@MN патчей

  1. Наблюдение за морфологией
    1. Наклейте подложку пластыря на наклонную под углом 45° поверхность и поместите ее под стереомикроскоп (см. Таблицу материалов).
    2. Включите осветитель и зафиксируйте морфологию пятна с помощью объектива с 4-кратным увеличением.
  2. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
    1. Прикрепите пластырь к предметному столику с помощью проводящего клея и обработайте его автоматическим тонким покрытием (см. Таблицу материалов) в течение 30 секунд.
    2. Получение изображений exo@MN патча с помощью СЭМ (см. Таблицу материалов) с ускоряющим напряжением 1 кВ.
  3. Механические испытания
    1. Вырежьте из заплатки массив 3 х 3 и поместите его кончиками вверх на жесткую платформу измерителя натяжения (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте высоту щупа так, чтобы он приблизился к кончикам игл, не касаясь их.
    2. Установите параметры на автоматическую остановку, когда давление достигнет 20 Н. Сожмите кончики игл вертикально со скоростью 0,5 мм/мин и запишите профиль зависимости нагрузки от смещения.
  4. Растворение
    1. Купите свежие свиные уши на рынке и нарежьте их на кусочки (5 см х 5 см х 0,3 см). Расстелите свиную шкуру на столе и с помощью бумаги высушите поверхностную влагу.
    2. Подготовьте четыре сухих пластыря с микроиглами кончиками игл вниз на коже свиньи, слегка раздвинув каждый пластырь. Большим и указательным пальцами вертикально надавите вниз на каждый пластырь с микроиглами. Снимайте по одному пластырю каждые 15 с.
    3. Немедленно поместите снятую заплатку в сушильную духовку и сушите в течение 5 минут. Отрежьте столбик наконечников микроигл, поместите их горизонтально под микроскоп (см. Таблицу материалов) и используйте объектив с 4-кратным увеличением, чтобы наблюдать за растворением наконечников.

4. Характеристика экзосом в exo@MN участке

ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики микроигл exo@MN растворяют в 100 мкл раствора DPBS для выполнения следующей характеристики высвобождающихся экзосом.

  1. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
    1. Обработайте медную сетку (см. Таблицу материалов) гидрофильной обработкой с использованием ионного очистителя (см. Таблицу материалов) в течение 5 минут.
    2. Вынесите 10 мкл образца на углеродную сторону медной сетки. Дайте постоять 1 минуту, затем удалите жидкость, промокнув ее фильтровальной бумагой с краев.
    3. Добавьте в образец 10 мкл 3% уранилацетата (см. Таблицу материалов). Дайте постоять 10 с, затем удалите жидкость, промокнув фильтровальной бумагой с краев.
    4. Добавьте в образец 10 мкл 3% уранилацетата. Дайте постоять 1 минуту, затем удалите жидкость, промокнув ее фильтровальной бумагой с краев, и высушите на воздухе при RT.
    5. Получение изображений экзосом с помощью ПЭМ (см. таблицу материалов) с ускоряющим напряжением 80 кВ.
  2. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    1. Разбавьте раствор экзосомы DPBS до достижения концентрации частиц 1 x 107 частиц/мл. Медленно введите 1 мл раствора экзосомы в камеру для образцов NTA с помощью шприца объемом 1 мл (см. Таблицу материалов).
    2. Установите тип стандартной операционной процедуры (СОП) прибора на EV-488, чтобы определить распределение экзосом по размерам.
  3. Вестерн-блоттинг (WB)
    1. Приготовьте буфер для лизиса, смешав буфер для лизиса методом радиоиммунопреципитации (RIPA): фенилметансульфонилфторид (см. Таблицу материалов) в соотношении 100:1. Лизируйте экзосомы на льду в течение 20 минут, совершая вихревые операции каждые 10 минут.
    2. Центрифугируйте раствор при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость, чтобы измерить концентрацию белка.
    3. Добавьте 5x буфер загрузки SDS-PAGE (см. Таблицу материалов) к надосадочной жидкости в объемном соотношении 1 : 4 и хорошо перемешайте. Нагрейте до 100 °C в течение 10 минут, чтобы денатурировать белки.
    4. Добавьте 5 мкл предварительно окрашенного белкового маркера с массой 180 кДа (см. Таблицу материалов) и 10 г денатурированного образца в 4%-20% сборный гель (см. Таблицу материалов). Запустите систему электрофореза (см. Таблицу материалов) при напряжении 60 В в течение 10 минут, а затем при напряжении 140 В в течение 50 минут.
    5. Перенесите белки из геля на мембрану из ПВДФ (см. Таблицу материалов), предварительно активированную метанолом. Выполните систему электрофореза при давлении 290 мА в течение 90 мин на льду.
    6. Мембрану PVDF инкубировать в 5% растворе обезжиренного молока в течение 1 ч. Трижды промыть трис буферным солевым раствором с подростком (TBST, см. Таблицу материалов) в течение 5 минут каждый.
    7. Вырежьте целевые полосы в зависимости от положения белка. Инкубируйте полосы с антителом против мыши CD63 и антителом против мыши Alix (см. Таблицу материалов), разведенными до соответствующей концентрации в соответствии с инструкциями производителя, и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
    8. Промойте ленты три раза с TBST. Инкубировать с HRP-конъюгированным антикроличьим IgG (см. Таблицу материалов) при РТ в течение 1 ч. Затем снова трижды постирайте TBST.
    9. Нанесите реагент для обнаружения супер ECL (см. Таблицу материалов), чтобы покрыть поверхность полос, и немедленно экспонируйте и захватывайте полосы с помощью гелевого имиджера (см. Таблицу материалов).
  4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM)
    1. Обработайте 5 x 105 DC в конфокальной чашке, используя 2 мл среды Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (см. Таблицу материалов). Добавьте экзосомы или exo@MN и инкубируйте при 37 °C в течение 24 часов.
    2. Добавьте каплю Hoechst 33342 в каждую конфокальную чашку и выдерживайте в темноте при температуре 37 °C в течение 20 минут.
    3. Выполняйте визуализацию с помощью CLSM (см. Таблицу материалов) с использованием объектива с 60-кратным увеличением. Нанесите каплю иммерсионного масла (см. Таблицу материалов) на линзу и поставьте конфокальную тарелку на сцену. Отрегулируйте оси x/y/z, чтобы найти соответствующую фокальную плоскость ячеек.
    4. Запустите изображение с помощью каналов DAPI/TRITC/TD, выберите разрешение 1024 пикселя и установите быстрый режим на 1/8 с.
  5. Проточная цитометрия
    1. Культивируйте ДК в 6-луночном планшете, каждая лунка содержит 5 x 105 клеток и 2 мл среды 1640. Добавьте равные объемы раствора DPBS, экзосом, микроигл без экзосом и exo@MN соответственно и инкубируйте при 37 °C в течение 24 ч.
    2. Переложите среду из каждой лунки в центробежные трубки. Центрифугируйте при 300 x g в течение 3 минут при 4 °C и удалите надосадочную жидкость.
    3. Добавьте 0,5 мкл антитела FITC-CD11c, 2,5 мкл антитела APC-CD80 и 0,5 мкл антитела Pacific Blue I-A/I-E (см. Таблицу материалов) в 100 мкл 5% раствора БСА (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешайте, ресуспензируйте ячейки и выдержите на шейкере во льду и в темноте в течение 20 минут.
    4. Добавьте 1 мл DPBS и центрифугируйте при 300 x g в течение 3 минут при 4 °C, затем удалите надосадочную жидкость. Повторите промывку дважды, чтобы удалить несвязанные антитела, а затем перейдите к анализу соответствующих флуоресцентных каналов с помощью проточной цитометрии (см. Таблицу материалов).
      1. Во-первых, на диаграмме рассеяния FSC-A/SSC-A зарегистрируйте основную популяцию клеток как P1. На диаграмме рассеяния SSC-A/SSC-H популяции клеток P1 затворите квадратную область P2 вдоль диагонали, чтобы удалить агрегированные ячейки.
      2. Выполнение флуоресцентного анализа популяции P2-клеток с использованием каналов FITC, APC и Pacific Blue. Установите условие стопа, чтобы собрать 10 000 ячеек в вентили P2.

5. Статистический анализ

  1. Выражайте количественные данные в виде средств ± стандартных отклонений (SD). Оценивайте статистическую значимость с помощью анализа t-критерия с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных. Рассматривайте p-значения меньше 0,05 для указания статистической значимости. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Результаты

Здесь мы представляем протокол выделения экзосом, изготовления и характеризации exo@MN патча. На рисунке 1 показана технологическая схема изготовления exo@MN патча. Экзосомы смешивали с трегалозой и ГК, а затем смесь добавляли в форму для микроигл и центрифугировали. Этот пр?...

Обсуждение

В настоящее время основными методами выделения экзосом являются ультрацентрифугирование, центрифугирование с градиентом плотности, ультрафильтрация, преципитация, иммуноаффинные магнитные шарики и микрофлюидика24. Из-за ограниченной нагрузочной способности микроигл, в...

Раскрытие информации

H.C., F.L.Q. и S.J.M являются изобретателями в патентной заявке, которая была подана на основе данных в этой рукописи. Х.К. является научным основателем компании Medcraft Biotech. Инк.

Благодарности

F.L.Q. благодарит за поддержку, оказанную Новаторской программой исследований и разработок провинции Чжэцзян (2022C03031), Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA0910103), Национальным фондом естественных наук Китая (22274141, 22074080), Фондом естественных наук провинции Шаньдун (ZR2022ZD28) и Программой ученых Тайшань провинции Шаньдун (tsqn201909106). Х.К. выражает признательность за финансовую поддержку от Национального фонда естественных наук Китая (82202329). Авторы признают использование инструментов в Центре общего использования измерительных приборов в Институте медицины Ханчжоу (HIM) Китайской академии наук.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100x penicillin-streptomycin solutionsJrunbio ScientificMA0110Cell culture
180 kDa pre-stained protein markerThermo26616Western blotting
3% Uranyl acetateHenan Ruixin Experimental SuppliesGZ02625Morphological characterization of exosomes
3D printerBMF technologynanoArch S130Mold preparation
4%–20% precast gelGenscriptExpressPlus PAGE GELWestern blotting
5× SDS-PAGE loading bufferTitan04048254Western blotting
Anti-mouse Alix antibodyBiolegend12422-1-APWestern blotting
Anti-mouse CD63 antibodyBiolegendab217345Western blotting
APC anti-mouse CD80 antibodyBiolegend104713Antibody
Auto fine coaterZIZHUJBA5-100Morphological characterization of microneedle
BCA assay kitBeyotimeP0012Protein concentration assay
CentrifugeThermo FisherMuitifuge X1R proCell centrifuge
Circulating water vacuum pumpYuhua InstrumentSHZ-D(III)Filtration
CO2 incubatorEppendorfCellXpert C170Cell culture
Confocal laser scanning microscopeNikonA1HD25Fluorescence imaging
Copper meshBeijing Zhongjingkeyi Technology JF-ZJKY/300Morphological characterization of exosomes
D- (+) -Trehalose dihydrateAladdin5138-23-4Fabrication of microneedle 
Dulbecco’s modified Eagle’s mediumMeilunbioMA0212Cell culture
Dulbecco’s phosphate-buffered salineMeilunbioMA0010Cell culture
Electrophoresis systemBio-radPowerPac-basicWestern blotting
Fetal bovine serumJrunbio ScientificJR100Cell culture
FITC anti-mouse CD11c antibodyBiolegend117305Antibody
Flow cytometryBDLSR FortessaFluorescence detection
Gel imagerCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
HRP-conjugated anti-rabbit IgGCST7074SWestern blotting
HTL resinBMF technologyMold preparation
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)Bloomage Biotechnology9004-61-9Fabrication of microneedle 
Immersion oilNikonMXA22168Fluorescence imaging
Ion cleanerJEOLEC-52000ICMorphological characterization of exosomes
MicroscopeOlympusCKX53Observe the microneedle tip dissolving process
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8MeisenCTCC CC90105Cell culture
Nanoparticle tracking analysisParticle MetrixZetaViewSize analysis of exosomes
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibodyBiolegend107619Antibody
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotimeST507Protease inhibitors
Plasma cleanerHefei Kejing Material TechnologyPDC-36GFabrication of microneedle 
PolydimethylsiloxaneDow Corning9016-00-6Mold preparation
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)Aladdin9003-39-8Fabrication of microneedle 
Prism GraphPadVersion 9Statistical analysis
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western blotting
Quick-snap centrifugeBeckman344619Exosomes extraction
RIPA lysis bufferApplygenC1053Lysis membrane
Roswell park memorial institute 1640MeilunbioMA0548Cell culture
Scanning electron microscopeJEOLJSM-IT800Morphological characterization of microneedle
Stereo microscopeOlympusSZX16Characterization of morphology
Super ECL detection reagentApplygenP1030Western blotting
Tensile meterInstron68SC-05Mechanical testing
Transmission electron microscopeJEOLJEM-2100plusMorphological characterization of exosomes
Tris buffered salineSangon BiotechJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosomes extraction
Ultrafiltration tubeMilliporeUFC910096Exosomes concentration
Vacuum drying ovenShanghai Yiheng TechnologyDZF-6024Fabrication of microneedle
Vacuum filtration systemBiosharpBS-500-XTFiltration

Ссылки

  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (640), 6977 (2020).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Nair, A., et al. Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform. Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).
  5. Lu, Z., et al. Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models. J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).
  6. Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes. J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).
  7. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  8. Liao, W., et al. Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy. Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).
  9. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
  10. Wen, S., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model. Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).
  11. Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes. Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).
  12. Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment. Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).
  13. Zheng, Y., et al. A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination. Macromol Biosci. 23 (12), e2300253 (2023).
  14. Huang, D., et al. Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array. Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).
  15. Zhou, Z., et al. Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle. Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).
  16. Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. Microneedles for drug and vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).
  17. Bui, V. D., et al. Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles. Biomaterials. 287, 121644 (2022).
  18. Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. Fear of injections in young adults: Prevalence and associations. Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).
  19. Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).
  20. Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye. Int J Pharm. 612, 121305 (2022).
  21. Creighton, R. L., Woodrow, K. A. Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa. Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180 (2019).
  22. Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair. ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).
  23. Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).
  24. Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2 (9), 1800021 (2018).
  25. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
  26. Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer. Carbohydr Polym. 317, 121081 (2023).
  27. Chang, H., et al. Cryomicroneedles for transdermal cell delivery. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены