Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Экзосомы обладают значительным клиническим потенциалом, но их практическое применение ограничено из-за легкого клиренса in vivo и плохой стабильности. Микроиглы представляют собой решение, обеспечивающее локализованную доставку путем прокола физиологических барьеров и сохранения в сухом состоянии, тем самым устраняя ограничения введения экзосом и расширяя их клиническую полезность.

Аннотация

Экзосомы, как новые биотерапевтические средства «следующего поколения» и векторы доставки лекарств, обладают огромным потенциалом в различных областях биомедицины, начиная от доставки лекарств и регенеративной медицины и заканчивая диагностикой заболеваний и иммунотерапией опухолей. Однако быстрый клиренс при традиционной болюсной инъекции и плохая стабильность экзосом ограничивают их клиническое применение. Микроиглы служат раствором, который продлевает время пребывания экзосом в месте введения, тем самым поддерживая концентрацию препарата и способствуя длительному терапевтическому эффекту. Кроме того, микроиглы также обладают способностью поддерживать стабильность биоактивных веществ. Поэтому мы представляем пластырь с микроиглами для загрузки и доставки экзосом и делимся методами, включая выделение экзосом, изготовление и характеристику нагруженных экзосомами микроигольчатых пластырей. Пластыри с микроиглами были изготовлены с использованием трегалозы и гиалуроновой кислоты в качестве материалов наконечника и поливинилпирролидона в качестве основного материала с помощью двухэтапного метода литья. Микроиглы продемонстрировали высокую механическую прочность, а наконечники были способны выдержать 2 Н. Для имитации человеческой кожи использовалась свиная кожа, и кончики микроигл полностью расплавились в течение 60 с после прокола кожи. Экзосомы, высвобождаемые из микроигл, демонстрировали морфологию, размер частиц, маркерные белки и биологические функции, сопоставимые с таковыми у свежих экзосом, что позволяло дендритным клеткам поглощать и способствовать их созреванию.

Введение

Экзосомы, которые представляют собой небольшие везикулы, высвобождаемые клетками во внеклеточный матрикс, были предложены в качестве потенциальных биотерапевтических средств и векторов доставки лекарств для лечения ряда заболеваний и видоврака. В процессе биогенеза экзосомы инкапсулируют различные биологически активные молекулы из клеток, включая функциональные белки и нуклеиновыекислоты. В результате, поглощаемые клетками-реципиентами в процессе транспортировки, экзосомы обладают способностью модулировать экспрессию генов и клеточные функциив клетках-мишенях. В качестве своего рода естественного ....

протокол

Данное исследование не требует этического разрешения, поскольку свиная кожа, использованная для экспериментов, описанных в разделе 3, была приобретена в качестве съедобных свиных ушей на рынке, а не получена от экспериментальных животных.

1. Выделение экзосом

  1. Культура клеток
    1. Культивировать эпителиальные клетки рака яичников мышей ID8 в культуральной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% раствор пенициллин-стрептомицина (100×) (см. Таблицу материалов) в чашках Петри диаметром 15 см.
    2. Инкубируйте клетки ID8 в инкубаторе сCO2....

Результаты

Здесь мы представляем протокол выделения экзосом, изготовления и характеризации exo@MN патча. На рисунке 1 показана технологическая схема изготовления exo@MN патча. Экзосомы смешивали с трегалозой и ГК, а затем смесь добавляли в форму для микроигл и центрифугировали. Этот пр?.......

Обсуждение

В настоящее время основными методами выделения экзосом являются ультрацентрифугирование, центрифугирование с градиентом плотности, ультрафильтрация, преципитация, иммуноаффинные магнитные шарики и микрофлюидика24. Из-за ограниченной нагрузочной способности микроигл, в.......

Раскрытие информации

H.C., F.L.Q. и S.J.M являются изобретателями в патентной заявке, которая была подана на основе данных в этой рукописи. Х.К. является научным основателем компании Medcraft Biotech. Инк.

Благодарности

F.L.Q. благодарит за поддержку, оказанную Новаторской программой исследований и разработок провинции Чжэцзян (2022C03031), Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA0910103), Национальным фондом естественных наук Китая (22274141, 22074080), Фондом естественных наук провинции Шаньдун (ZR2022ZD28) и Программой ученых Тайшань провинции Шаньдун (tsqn201909106). Х.К. выражает признательность за финансовую поддержку от Национального фонда естественных наук Китая (82202329). Авторы признают использование инструментов в Центре общего использования измерительных приборов в Институте медицины Ханчжоу (HIM) Китайской академии наук.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100x penicillin-streptomycin solutionsJrunbio ScientificMA0110Cell culture
180 kDa pre-stained protein markerThermo26616Western blotting
3% Uranyl acetateHenan Ruixin Experimental SuppliesGZ02625Morphological characterization of exosomes
3D printerBMF technologynanoArch S130Mold preparation
4%–20% precast gelGenscriptExpressPlus PAGE GELWestern blotting
5× SDS-PAGE loading bufferTitan04048254Western blotting
Anti-mouse Alix antibodyBiolegend12422-1-APWestern blotting
Anti-mouse CD63 antibodyBiolegendab217345Western blotting
APC anti-mouse CD80 antibodyBiolegend104713Antibody
Auto fine coaterZIZHUJBA5-100Morphological characterization of microneedle
BCA assay kitBeyotimeP0012Protein concentration assay
CentrifugeThermo FisherMuitifuge X1R proCell centrifuge
Circulating water vacuum pumpYuhua InstrumentSHZ-D(III)Filtration
CO2 incubatorEppendorfCellXpert C170Cell culture
Confocal laser scanning microscopeNikonA1HD25Fluorescence imaging
Copper meshBeijing Zhongjingkeyi Technology JF-ZJKY/300Morphological characterization of exosomes
D- (+) -Trehalose dihydrateAladdin5138-23-4Fabrication of microneedle 
Dulbecco’s modified Eagle’s mediumMeilunbioMA0212Cell culture
Dulbecco’s phosphate-buffered salineMeilunbioMA0010Cell culture
Electrophoresis systemBio-radPowerPac-basicWestern blotting
Fetal bovine serumJrunbio ScientificJR100Cell culture
FITC anti-mouse CD11c antibodyBiolegend117305Antibody
Flow cytometryBDLSR FortessaFluorescence detection
Gel imagerCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
HRP-conjugated anti-rabbit IgGCST7074SWestern blotting
HTL resinBMF technologyMold preparation
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)Bloomage Biotechnology9004-61-9Fabrication of microneedle 
Immersion oilNikonMXA22168Fluorescence imaging
Ion cleanerJEOLEC-52000ICMorphological characterization of exosomes
MicroscopeOlympusCKX53Observe the microneedle tip dissolving process
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8MeisenCTCC CC90105Cell culture
Nanoparticle tracking analysisParticle MetrixZetaViewSize analysis of exosomes
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibodyBiolegend107619Antibody
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotimeST507Protease inhibitors
Plasma cleanerHefei Kejing Material TechnologyPDC-36GFabrication of microneedle 
PolydimethylsiloxaneDow Corning9016-00-6Mold preparation
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)Aladdin9003-39-8Fabrication of microneedle 
Prism GraphPadVersion 9Statistical analysis
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western blotting
Quick-snap centrifugeBeckman344619Exosomes extraction
RIPA lysis bufferApplygenC1053Lysis membrane
Roswell park memorial institute 1640MeilunbioMA0548Cell culture
Scanning electron microscopeJEOLJSM-IT800Morphological characterization of microneedle
Stereo microscopeOlympusSZX16Characterization of morphology
Super ECL detection reagentApplygenP1030Western blotting
Tensile meterInstron68SC-05Mechanical testing
Transmission electron microscopeJEOLJEM-2100plusMorphological characterization of exosomes
Tris buffered salineSangon BiotechJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN-100Exosomes extraction
Ultrafiltration tubeMilliporeUFC910096Exosomes concentration
Vacuum drying ovenShanghai Yiheng TechnologyDZF-6024Fabrication of microneedle
Vacuum filtration systemBiosharpBS-500-XTFiltration

Ссылки

  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены