Eksozomların yüklenmesi ve teslimi için mikroiğne yamalarının üretimi ve karakterizasyonu

Özet

Eksozomlar önemli klinik potansiyele sahiptir, ancak kolay in vivo klerens ve zayıf stabilite nedeniyle pratik uygulamaları sınırlıdır. Mikroiğneler, fizyolojik engelleri delerek ve kuru halde koruma sağlayarak lokalize uygulamayı mümkün kılarak, böylece eksozom uygulamasının sınırlamalarını ele alarak ve klinik faydalarını genişleterek bir çözüm sunar.

Özet

Ortaya çıkan "yeni nesil" biyoterapötikler ve ilaç dağıtım vektörleri olarak eksozomlar, ilaç dağıtımı ve rejeneratif tıptan hastalık teşhisi ve tümör immünoterapisine kadar çeşitli biyomedikal alanlarda muazzam bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, geleneksel bolus enjeksiyonu ile hızlı klerens ve eksozomların zayıf stabilitesi, klinik uygulamalarını kısıtlamaktadır. Mikroiğneler, eksozomların uygulama bölgesinde kalma süresini uzatan, böylece ilaç konsantrasyonunu koruyan ve sürekli terapötik etkileri kolaylaştıran bir çözelti görevi görür. Ek olarak, mikroiğneler ayrıca biyoaktif maddelerin stabilitesini koruma yeteneğine de sahiptir. Bu nedenle, eksozomların yüklenmesi ve iletilmesi için bir mikroiğne yaması sunuyoruz ve eksozomların izolasyonu, eksozom yüklü mikroiğne yamalarının üretimi ve karakterizasyonu dahil olmak üzere yöntemleri paylaşıyoruz. Mikroiğne yamaları, uç malzemeleri olarak trehaloz ve hyaluronik asit ve destek malzemesi olarak polivinilpirolidon kullanılarak iki aşamalı bir döküm yöntemi ile üretildi. Mikroiğneler, insan derisini simüle etmek için 2 N. Domuz derisine dayanabilen uçlarla sağlam mekanik mukavemet gösterdi ve mikroiğnelerin uçları cilt delinmesinden sonra 60 saniye içinde tamamen eridi. Mikroiğnelerden salınan eksozomlar, morfoloji, partikül boyutu, işaretleyici proteinler ve taze eksozomlarınkiyle karşılaştırılabilir biyolojik işlevler sergiledi, bu da dendritik hücrelerin alımını sağladı ve olgunlaşmalarını teşvik etti.

Giriş

Hücreler tarafından hücre dışı matrise salınan küçük veziküller olan eksozomlar, çeşitli hastalıkların ve kanserlerin tedavisi için potansiyel biyoterapötikler ve ilaç dağıtım vektörleri olarak önerilmiştir¹. Biyogenez süreçleri sırasında eksozomlar, fonksiyonel proteinler ve nükleik asitler² dahil olmak üzere hücrelerin içinden çeşitli biyolojik olarak aktif molekülleri kapsüller. Sonuç olarak, taşıma işlemi sırasında alıcı hücreler tarafından alındığında, eksozomlar hedef hücrelerde gen ekspresyonunu ve hücresel fonksiyonları modüle etme yeteneğine sahiptir³. Bir tür doğal bilgi habercisi olarak, eksozomlar doku yenilenmesinde, bağışıklık regülasyonunda ve bir dağıtım taşıyıcısı olarak tam olarak kullanılmıştır⁴. Mühendislik teknikleri sayesinde, eksozomların yüzeyinde spesifik ligandlar zenginleştirilebilir, bu da alıcı hücrelerde sinyal olaylarının indüksiyonunu veya inhibisyonunu mümkün kılar^veya belirli hücre tiplerini hedefler5. Kemoterapötik ajanlar ayrıca kanser tedavisi için eksozomlara da yüklenebilir⁶. Ayrıca, eksozomlar, terapötik kargo teslimatı için kan-beyin bariyerini geçme yeteneğine sahiptir ve bu da onları beyin bozukluklarının tedavisi için oldukça umut verici hale getirir⁷. Lipozomlarla karşılaştırıldığında, eksozomlar gelişmiş hücresel alım ve gelişmiş biyouyumluluk sergiler⁸. Daha iyi tolerans ve daha düşük toksisite gösterirken diğer hücrelere verimli bir şekilde girebilirler⁹. Bununla birlikte, eksozomların geleneksel bolus enjeksiyonu, kan dolaşımındaki karaciğer, böbrekler ve dalak tarafından sekestrasyona ve hızlı temizlemeye eğilimlidir¹⁰. Ayrıca, eksozomlar in vitro olarak zayıf stabiliteye sahiptir ve klinik uygulamalarını kısıtlayan depolama koşullarına karşı hassastır¹¹.

Bir dizi mikrometrik boyutlu iğne ucu olan mikroiğneler, küçük moleküllü ilaçların¹², proteinlerin¹³, nükleik asitlerin¹⁴ ve nanoilaçların¹⁵ verilmesi için fizyolojik engellere nüfuz etme yeteneğine sahiptir. Mikroiğneler, cilt yüzeyindeki lezyonları hedeflemek için hassas bir şekilde tasarlanmıştır ve dağınık uçları, hedeflenen bölgede homojen ilaç dağılımı sağlar, böylece terapötik etkilerini artırır¹⁶. Mikroiğnelerin tasarımı ve malzeme bileşimi, proteinler ve nükleik asitler gibi biyoaktif maddelerin kuru depolanmasını kolaylaştırarak stabilitelerini arttırır¹⁷. Geleneksel enjeksiyon yöntemleri nispeten kısa bir etki süresine sahiptir ve ağrıya neden olarak hastalarda korkuya neden olabilir¹⁸. Mikrometre boyutundaki mikroiğne uzunluğu, doku travmasını en aza indirir ve sinir uyarımını önler, böylece ağrıyı ortadan kaldırır ve hasta uyumunu artırır¹⁹. Ek olarak, mikroiğnelerin kullanıcı dostu yapısı, hastaların uzman personele ihtiyaç duymadan tedaviyi kendi kendilerine uygulamalarına olanak tanır¹⁶. Mikroiğneler cildin yanı sıra gözler²⁰, ağız mukozası²¹, kalp²² ve kan damarları²³ gibi dokularda da kullanılabilir. Eksozomların klinik olarak verilmesi için mikroiğnelerin uygulanması umut verici ve ileriye dönük bir strateji sağlar.

Bu nedenle, eksozom yüklü bir mikroiğne (exo@MN) yaması tanıtıyoruz ve üretim yöntemini açıklıyoruz. Mikroiğne yamaları, mikroiğne uçlarında eksozomların toplanmasını teşvik eden ve böylece dağıtım verimliliğini artıran santrifüjleme ve vakumlu kurutma ile birlikte iki aşamalı bir döküm yöntemi kullanılarak üretildi. Hem iğne uçları hem de destek, mükemmel biyouyumluluk ve suda çözünürlük sergileyen malzemeler kullanılarak yapılmıştır. Eksozomlar için koruma sağlamak için trehaloz ve hyaluronik asit (HA) uç materyaller olarak dahil edildi ve destek materyali olarak mutlak etanol içinde çözünen polivinilpirolidon (PVP) seçildi. Mikroiğne yamasının morfolojisi, mikroskopi ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak karakterize edildi. Mikroiğnenin mekanik testi, cilde nüfuz etme yeteneklerini doğrulamak için bir gerilme ölçer kullanılarak değerlendirildi ve domuz derisi üzerindeki salım hızının 60 s olduğu araştırıldı. Ayrıca, exo@MN'daki hem taze eksozomların hem de eksozomların morfolojisi, boyutu ve protein içeriği, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), nanopartikül izleme analizi (NTA) ve western blotting (WB) kullanılarak karakterize edildi. Eksozomların dendritik hücreler (DC'ler) tarafından içselleştirilmesi, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak karakterize edildi ve DC'lerin olgunlaşması akış sitometrisi ile değerlendirildi. İki tür eksozomun morfolojik karakterizasyonu ve biyolojik işlevleri esasen tutarlıdır.

Protokol

Bölüm 3'te açıklanan deneyler için kullanılan domuz derisi, deney hayvanlarından elde edilmediği için piyasadan yenilebilir domuz kulakları olarak satın alındığından, bu çalışma etik izin gerektirmez.

1. Eksozomların izolasyonu

1. Hücre kültürü
   1. %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin solüsyonu (100×) içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) kültür ortamında fare yumurtalık epitel kanseri hücreleri ID8'i yetiştirin (bkz. Malzeme Tablosu) 15 cm çapında Petri kaplarında.
   2. ID8 hücrelerini bir CO₂ inkübatöründe ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de hücre yoğunluğu %90'a ulaşana kadar inkübe edin.
2. Eksozomların izolasyonu
   1. Kültür ortamını Petri kaplarından çıkarın ve Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile iki kez yıkayın. Fetal sığır serumu ( Materyal Tablosuna bakınız) ve penisilin-streptomisin çözeltisi ( Materyal Tablosuna bakınız) olmadan 20 mL DMEM ekleyin. İnkübasyona 37 °C ve %5 CO_2'de 48 saat devam edin.
   2. Hücre kültürü süpernatantını 15 cm çapında 20 Petri kabından toplayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve serbest hücreleri çıkarmak için süpernatanı toplayın.
   3. 10 dakika 4 °C boyunca 2000 x g'da santrifüjleyin ve hücresel kalıntıları gidermek için süpernatanı toplayın.
   4. 0.22 μm tek kullanımlık vakum filtreleme sistemini (Malzeme Tablosuna bakın) sirkülasyonlu su vakum pompasına bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Süpernatantın 0.22 μm polieter sülfon membranından geçmesine ve filtrasyon sisteminin alt odasına girmesine izin vermek için bir vakum oluşturun, süpernatanttan 0.22 μm'den daha büyük vezikülleri veya safsızlıkları etkili bir şekilde giderin.
      1. Vakum pompasını bağlamak için pompa anahtarını açın ve ardından vakum filtreleme sisteminin hava girişine bağlayın. Kapatırken, önce pompa ile olan bağlantıyı kesin ve ardından vakum pompasını kapatın. Bu prosedür, vakum pompasının geri akışını ve kültür sıvısının kirlenmesini önlemeye yardımcı olur.
   5. 100 kDa'lık ultrafiltrasyon tüpünün iç borusuna 15 mL süpernatan ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). 3500 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve sıvıyı dış tüpten çıkarın.
      NOT: 100 kDa'dan küçük proteinler çözelti ile birlikte dış tüpe santrifüjlenirken, iç tüp zarında 100 kDa'dan büyük partikülleri tutun. Eksozomlar 100 kDa'dan daha büyüktü ve iç tüp zarı üzerinde toplandı.
   6. Sıvının toplam hacmi 5 mL içinde olana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın. Sıvıyı iç tüpten toplayın ve 1 mL DPBS ekleyin. İç tüpe tekrar tekrar pipetlemek için bir pipet kullanın, DPBS'de bağlı eksozomların yeniden süspansiyonunu sağlayın ve ardından bunları toplayın.
   7. 4 ° C'de 60 dakika boyunca 10000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı 6 mL'lik hızlı yapışan bir santrifüj tüpüne aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Tüpü bir ısı mühürleyici ile kapatın.
   8. Bir ultrasantrifüj kullanarak 2 saat 4 ° C'de 100.000 x g'da santrifüjleyin (bkz. Hızlı çıtçıtlı santrifüj tüpünü kesin, süpernatanı çıkarın ve peleti 100 μL DPBS'de yeniden süspanse edin. Bu eksozom çözeltisidir.
      NOT: Peletin yeniden süspanse edilmesi işlemi sırasında, tüp duvarını bir pipet kullanarak en az 200 kez pipetlemek ve çalkalamak gerekir.

2. exo@MN imalatı

1. Ana kalıbın hazırlanması
   1. CAD yazılımını kullanarak 10 x 10 dizili, aşağıdaki parametrelere sahip konik şekilli uçlara sahip bir mikro iğne modeli oluşturun: 1200 μm yükseklik, 400 μm taban çapı ve 900 μm'lik bir aralık (bitişik mikro iğneler arasındaki mesafe).
   2. Malzeme olarak HTL reçinesini kullanın ve bir 3D yazıcı kullanarak mikroiğnenin ana kalıbını yazdırın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   3. Yüzeye yapışan reçineyi çıkarmak için ana kalıbı 1 saat boyunca mutlak etanole batırın.
   4. Kürlenmesi için kalıbı 5 dakika ultraviyole ışığa maruz bırakın.
   5. Kalıbı bir kez daha 1 saat mutlak etanole batırın, ardından 60 °C'de 1 saat kurutma fırınında kurutun. Ana kalıp hazır.
2. Üretim kalıbının hazırlanması
   1. Polidimetilsiloksanın A ve B bileşenlerini (PDMS, Malzeme Tablosuna bakınız) 10:1 oranında karıştırın. İyice karıştırın ve karışımı bir ana kalıba dökün.
   2. PDMS karışımından hava kabarcıklarını çıkarmak için PDMS kalıbını 15 dakika boyunca 1 psi basınç altına yerleştirin.
   3. PDMS kalıbını 60 °C'de 2 saat sertleştirin ve ardından mikroiğnenin üretim kalıbını elde etmek için kalıptan çıkarın.
   4. Kullanmadan önce üretim kalıbını ultra saf su ile temizleyin.
3. Çözeltinin hazırlanması
   1. Bir BCA test kiti kullanarak eksozom çözeltisinin protein içeriğini ölçün (bkz . Malzeme Tablosu). Eksozom çözeltisi için 10 μg/μL'lik bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda DPBS ekleyin.
   2. Çözücü olarak DPBS kullanarak 200 mg / mL trehalozlu bir çözelti hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Tam çözünmeyi sağlamak için 20 dakika karıştırın.
   3. Çözücü olarak DPBS kullanarak 200 mg / mL hyaluronik asit (HA, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi hazırlayın. Tam çözünmeyi sağlamak için gece boyunca karıştırın.
   4. Çözücü olarak mutlak etanol kullanarak 150 mg / mL polivinilpirolidon (PVP, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi hazırlayın. Tam çözünmeyi sağlamak için gece boyunca karıştırın.
   5. Eksozom çözeltisini (10 μg / μL) ve trehaloz çözeltisini (200 mg / mL) 1: 1 hacim oranında karıştırın. Ardından, eşit miktarda HA çözeltisi (200 mg / mL) ekleyin. Uç çözeltisini elde etmek için iyice karıştırın.
4. exo@MN imalatı
   1. PDMS kalıbının yüzeyini, hidrofilikliğini arttırmak için bir plazma temizleyici (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak 30 saniye boyunca düşük bir kalitede işleyin.
   2. PDMS kalıbına 40 μL uç çözeltisi ekleyin. Sıvının kalıbın iğne tabakasını doldurduğundan emin olmak için oda sıcaklığında (RT) ve 3000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
   3. Kalıptaki fazla sıvıyı çıkarın ve RT'de vakumlu kurutma fırınında ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 gün kurutun.
   4. PDMS kalıbına 200 μL PVP çözeltisi ekleyin. Sıvının kalıbın destek tabakasını doldurduğundan emin olmak için RT'de 3 dakika boyunca 3000 x g santrifüjleyin.
   5. Kalıbı RT'de 1 gün boyunca bir kurutma fırınında kurutun, ardından exo@MN yamayı elde etmek için kalıptan çıkarın.
      NOT: exo@MN yamasını kullanıma hazır olana kadar kurutma fırınında saklayın.

Şekil 1: exo@MN yamalarının üretim süreci. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. exo@MN yamalarının karakterizasyonu

1. Morfolojinin gözlemlenmesi
   1. Yamanın arkasını 45° eğimli bir yüzeye yapıştırın ve stereo mikroskop altına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Aydınlatıcıyı açın ve 4x objektif kullanarak yamanın morfolojisini yakalayın.
2. Taramalı elektron mikroskobu (SEM)
   1. Yamayı iletken yapıştırıcı kullanarak numune aşamasına yapıştırın ve 30 saniye boyunca otomatik ince kaplayıcı ( Malzeme Tablosuna bakın) ile işlemden geçirin.
   2. 1 kV'luk bir hızlanma gerilimi ile SEM ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak exo@MN yamanın görüntülerini yakalayın.
3. Mekanik test
   1. Yamadan 3 x 3'lük bir dizi kesin ve uçları yukarı bakacak şekilde bir çekme ölçerin rijit platformuna yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Probun yüksekliğini, iğne uçlarına dokunmadan yaklaştırmak için ayarlayın.
   2. Parametreleri, basınç otomatik olarak 20 N'ye ulaştığında duracak şekilde ayarlayın. İğne uçlarını 0,5 mm/dak hızında dikey olarak sıkıştırın ve yüke karşı yer değiştirme profilini kaydedin.
4. Dağılma
   1. Piyasadan taze domuz kulakları satın alın ve parçalara ayırın (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Domuz derisini bir masanın üzerine yayın ve yüzey nemini kurutmak için kağıt kullanın.
   2. İğne uçları domuz derisine bakacak şekilde dört kuru mikro iğne yaması hazırlayın ve her bir yamayı hafifçe aralıklı hale getirin. Başparmak ve işaret parmaklarını kullanarak, her bir mikroiğne yamasına dikey olarak bastırın. Her 15 saniyede bir yama çıkarın.
   3. Çıkarılan yamayı hemen bir kurutma fırınına koyun ve 5 dakika kurutun. Mikroiğne uçlarından oluşan bir sütunu kesin, bunları bir mikroskop altında yatay olarak yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve uçların çözünmesini gözlemlemek için 4x objektif lens kullanın.

4. exo@MN yamadaki eksozomların karakterizasyonu

NOT: exo@MN'nin mikroiğne uçları, salınan eksozomlar üzerinde aşağıdaki karakterizasyonu gerçekleştirmek için 100 μL DPBS çözeltisi içinde çözülür.

1. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
   1. Bakır ağa (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 dakika boyunca bir iyon temizleyici (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hidrofilik bir işlemle muamele edin.
   2. Numunenin 10 μL'sini bakır ağın karbon tarafına dağıtın. 1 dakika bekletin, ardından sıvıyı kenarlarından filtre kağıdı ile kurulayarak çıkarın.
   3. Numuneye 10 μL %3 uranil asetat ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 10 saniye bekletin, ardından sıvıyı kenarlarından filtre kağıdı ile kurulayarak çıkarın.
   4. Numuneye 10 μL %3 uranil asetat ekleyin. 1 dakika bekletin, ardından sıvıyı kenarlarından filtre kağıdı ile kurutarak çıkarın ve RT'de havayla kurutun.
   5. 80 kV'luk bir hızlanma gerilimi ile TEM ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak eksozomların görüntülerini yakalayın.
2. Nanopartikül izleme analizi (NTA)
   1. 1 x 10⁷ partikül / mL'lik bir partikül konsantrasyonu elde etmek için eksozom çözeltisini DPBS ile seyreltin. 1 mL şırınga kullanarak NTA'nın numune odasına 1 mL eksozom solüsyonunu yavaşça enjekte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Eksozomların boyut dağılımını tespit etmek için cihazın standart çalıştırma prosedürü (SOP) tipini EV-488 olarak ayarlayın.
3. Batı lekeleme (WB)
   1. Radyoimmünopresipitasyon tahlili (RIPA) lizis tamponu: fenilmetansülfonil florür (Malzeme Tablosuna bakınız) 100:1 oranında karıştırarak lizis tamponunu hazırlayın. Eksozomları 20 dakika boyunca buz üzerinde parçalayın, her 10 dakikada bir girdap yapın.
   2. Çözeltiyi 12.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Protein konsantrasyonunu ölçmek için süpernatanı toplayın.
   3. Süpernajanta 1: 4 hacim oranında 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve iyice karıştırın. Proteinleri denatüre etmek için 100 °C'de 10 dakika ısıtın.
   4. %4-20'lik bir prekast jele 5 μL 180 μL önceden boyanmış protein markörü (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 10 μg denatüre numune ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Elektroforez sistemini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 60 V'ta 10 dakika ve ardından 140 V'ta 50 dakika çalıştırın.
   5. Proteinleri jelden metanol ile önceden aktive edilmiş bir PVDF membranına ( Malzeme Tablosuna bakınız) aktarın. Elektroforez sistemini buz üzerinde 90 dakika boyunca 290 mA'da gerçekleştirin.
   6. PVDF membranını %5 yağsız süt çözeltisinde 1 saat inkübe edin. Her biri 5 dakika boyunca ara (TBST, Malzeme Tablosuna bakınız) tris tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın.
   7. Proteinin konumuna göre hedef bantları kesin. Bantları, üreticinin talimatlarına göre uygun konsantrasyona seyreltilmiş anti-fare CD63 antikoru ve anti-fare Alix antikoru ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   8. Bantları TBST ile üç kez yıkayın. HRP ile konjuge anti-tavşan IgG (Malzeme Tablosuna bakınız) ile RT'de 1 saat inkübe edin. Daha sonra tekrar TBST ile üç kez yıkayın.
   9. Bantların yüzeyini kaplamak için bir süper ECL algılama reaktifi uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve bir jel görüntüleyici kullanarak bantları hemen açığa çıkarın ve yakalayın (Malzeme Tablosuna bakın).
4. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM)
   1. 2 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) ortamı kullanarak konfokal bir tabakta 5 x^{10 5} DC yetiştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Eksozom veya exo@MN ekleyin ve 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
   2. Her bir konfokal kaba bir damla Hoechst 33342 ekleyin ve karanlıkta 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
   3. 60x objektif lens kullanarak bir CLSM ( Malzeme Tablosuna bakın) ile görüntüleme gerçekleştirin. Lensin üzerine bir damla daldırma yağı uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve konfokal çanağı sahneye yerleştirin. Hücrelerin uygun odak düzlemini bulmak için x/y/z eksenlerini ayarlayın.
   4. DAPI/TRITC/TD kanallarıyla görüntülemeyi başlatın, 1024 piksellik bir çözünürlük seçin ve hızlı modu 1/8 s'ye ayarlayın.
5. Akış sitometrisi
   1. DC'leri, her biri 5 x 10⁵ hücre ve 2 mL 1640 ortam içeren 6 oyuklu bir plakada yetiştirin. Sırasıyla eşit hacimlerde DPBS, eksozomlar, eksozomsuz mikroiğneler ve exo@MN çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
   2. Ortamı her kuyudan santrifüj tüplere aktarın. 300 ° C'de 3 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   3. 100 μL %5 BSA çözeltisine 0.5 μL FITC-CD11c antikoru, 2.5 μL APC-CD80 antikoru ve 0.5 μL Pasifik Mavisi I-A/I-E antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). İyice karıştırın, hücreleri yeniden süspanse edin ve buzda ve karanlıkta 20 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
   4. 1 mL DPBS ekleyin ve 300 °C'de 3 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkamayı iki kez tekrarlayın ve ardından akış sitometrisi yoluyla karşılık gelen floresan kanallarını analiz etmeye devam edin (bkz. Malzeme Tablosu).
      1. İlk olarak, FSC-A/SSC-A saçılma grafiğinde, ana hücre popülasyonunu P1 olarak geçitleyin. P1 hücre popülasyonunun SSC-A/SSC-H dağılım grafiğinde, toplanmış hücreleri çıkarmak için köşegen boyunca kare bir P2 bölgesi geçirin.
      2. FITC, APC ve Pacific Blue kanallarını kullanarak P2 hücre popülasyonu üzerinde floresan analizi yapın. P2 kapısında 10.000 hücre toplamak için durdurma koşulunu ayarlayın.

5. İstatistiksel analiz

1. Nicel verileri standart sapmalar (SD) ± ortalamalar olarak ifade edin. Uygun bir veri analizi yazılımı uygulaması kullanarak t-testi analizini kullanarak istatistiksel anlamlılığı değerlendirin. İstatistiksel anlamlılığı belirtmek için 0,05'ten küçük p değerlerini göz önünde bulundurun. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

Sonuçlar

Burada, eksozomların izolasyonu, exo@MN yamanın üretimi ve karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz. Şekil 1 , exo@MN yamanın üretimi için süreç akış şemasını göstermektedir. Eksozomlar trehaloz ve HA ile karıştırıldı ve karışım daha sonra mikroiğne kalıbına eklendi ve santrifüjlendi. Bu işlem, eksozomların iğne uçlarında toplanmasını kolaylaştırarak hızlı salınımı teşvik etti. Kuruduktan sonra, PVP çözeltisi ilave edildi ve kalıbı tamamen d...

Tartışmalar

Şu anda, eksozomları izole etmek için ana yöntemler arasında ultrasantrifüjleme, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, ultrafiltrasyon, çökeltme, immünoaffinite manyetik boncuklar ve mikroakışkanlar²⁴ bulunmaktadır. Küçük iğne ucu boşluklarının neden olduğu mikro iğnelerin sınırlı yükleme kapasitesi nedeniyle, daha fazla yükleme yapmak için eksozom konsantrasyonunu artırmak gerekir. Bu nedenle, hücre kültürü süpernatantını konsantre etmek için ultrafiltrasyonu se...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x penicillin-streptomycin solutions	Jrunbio Scientific	MA0110	Cell culture
180 kDa pre-stained protein marker	Thermo	26616	Western blotting
3% Uranyl acetate	Henan Ruixin Experimental Supplies	GZ02625	Morphological characterization of exosomes
3D printer	BMF technology	nanoArch S130	Mold preparation
4%–20% precast gel	Genscript	ExpressPlus PAGE GEL	Western blotting
5× SDS-PAGE loading buffer	Titan	04048254	Western blotting
Anti-mouse Alix antibody	Biolegend	12422-1-AP	Western blotting
Anti-mouse CD63 antibody	Biolegend	ab217345	Western blotting
APC anti-mouse CD80 antibody	Biolegend	104713	Antibody
Auto fine coater	ZIZHU	JBA5-100	Morphological characterization of microneedle
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Protein concentration assay
Centrifuge	Thermo Fisher	Muitifuge X1R pro	Cell centrifuge
Circulating water vacuum pump	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	Filtration
CO2 incubator	Eppendorf	CellXpert C170	Cell culture
Confocal laser scanning microscope	Nikon	A1HD25	Fluorescence imaging
Copper mesh	Beijing Zhongjingkeyi Technology	JF-ZJKY/300	Morphological characterization of exosomes
D- (+) -Trehalose dihydrate	Aladdin	5138-23-4	Fabrication of microneedle
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Meilunbio	MA0212	Cell culture
Dulbecco’s phosphate-buffered saline	Meilunbio	MA0010	Cell culture
Electrophoresis system	Bio-rad	PowerPac-basic	Western blotting
Fetal bovine serum	Jrunbio Scientific	JR100	Cell culture
FITC anti-mouse CD11c antibody	Biolegend	117305	Antibody
Flow cytometry	BD	LSR Fortessa	Fluorescence detection
Gel imager	Cytiva	Amersham ImageQuant 800	Western blotting
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	CST	7074S	Western blotting
HTL resin	BMF technology		Mold preparation
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	Fabrication of microneedle
Immersion oil	Nikon	MXA22168	Fluorescence imaging
Ion cleaner	JEOL	EC-52000IC	Morphological characterization of exosomes
Microscope	Olympus	CKX53	Observe the microneedle tip dissolving process
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8	MeisenCTCC	CC90105	Cell culture
Nanoparticle tracking analysis	Particle Metrix	ZetaView	Size analysis of exosomes
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend	107619	Antibody
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime	ST507	Protease inhibitors
Plasma cleaner	Hefei Kejing Material Technology	PDC-36G	Fabrication of microneedle
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	9016-00-6	Mold preparation
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)	Aladdin	9003-39-8	Fabrication of microneedle
Prism	GraphPad	Version 9	Statistical analysis
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Western blotting
Quick-snap centrifuge	Beckman	344619	Exosomes extraction
RIPA lysis buffer	Applygen	C1053	Lysis membrane
Roswell park memorial institute 1640	Meilunbio	MA0548	Cell culture
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-IT800	Morphological characterization of microneedle
Stereo microscope	Olympus	SZX16	Characterization of morphology
Super ECL detection reagent	Applygen	P1030	Western blotting
Tensile meter	Instron	68SC-05	Mechanical testing
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-2100plus	Morphological characterization of exosomes
Tris buffered saline	Sangon Biotech	JF-A500027-0004	Western blotting
Tween-20	Beyotime	ST825	Western blotting
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosomes extraction
Ultrafiltration tube	Millipore	UFC910096	Exosomes concentration
Vacuum drying oven	Shanghai Yiheng Technology	DZF-6024	Fabrication of microneedle
Vacuum filtration system	Biosharp	BS-500-XT	Filtration