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Les exosomes possèdent un potentiel clinique important, mais leur application pratique est limitée en raison de la facilité d’élimination in vivo et de la faible stabilité. Les micro-aiguilles présentent une solution en permettant une administration localisée en perforant les barrières physiologiques et la conservation à l’état sec, remédiant ainsi aux limites de l’administration d’exosomes et élargissant leur utilité clinique.
Les exosomes, en tant que biothérapies émergentes de « nouvelle génération » et vecteurs d’administration de médicaments, recèlent un immense potentiel dans divers domaines biomédicaux, allant de l’administration de médicaments et de la médecine régénérative au diagnostic des maladies et à l’immunothérapie tumorale. Cependant, la clairance rapide par injection traditionnelle en bolus et la faible stabilité des exosomes limitent leur application clinique. Les micro-aiguilles servent de solution qui prolonge le temps de séjour des exosomes sur le site d’administration, maintenant ainsi la concentration du médicament et facilitant les effets thérapeutiques durables. De plus, les micro-aiguilles possèdent également la capacité de maintenir la stabilité des substances bioactives. Par conséquent, nous introduisons un patch de micro-aiguilles pour le chargement et l’administration d’exosomes et partageons les méthodes, y compris l’isolement des exosomes, la fabrication et la caractérisation des patchs de micro-aiguilles chargés d’exosomes. Les patchs à micro-aiguilles ont été fabriqués en utilisant du tréhalose et de l’acide hyaluronique comme matériaux de pointe et de la polyvinylpyrrolidone comme matériau de support par une méthode de moulage en deux étapes. Les micro-aiguilles ont démontré une résistance mécanique robuste, avec des pointes capables de résister à 2 N. La peau de porc a été utilisée pour simuler la peau humaine, et les pointes des micro-aiguilles ont complètement fondu dans les 60 secondes suivant la perforation de la peau. Les exosomes libérés par les micro-aiguilles présentaient une morphologie, une taille de particules, des protéines marqueurs et des fonctions biologiques comparables à celles des exosomes frais, permettant l’absorption des cellules dendritiques et favorisant leur maturation.
Les exosomes, qui sont de petites vésicules libérées par les cellules dans la matrice extracellulaire, ont été proposés comme biothérapies potentielles et vecteurs d’administration de médicaments pour le traitement de plusieurs maladies et cancers1. Au cours de leur processus de biogenèse, les exosomes encapsulent diverses molécules biologiquement actives à l’intérieur des cellules, y compris des protéines fonctionnelles et des acides nucléiques2. Par conséquent, lorsqu’ils sont absorbés par les cellules réceptrices pendant le processus de transport, les exosomes ont la capacité de moduler l’expression des gènes et les fonctions cellulaires dans les cellules cibles3. En tant que sorte de messager d’information naturel, les exosomes ont été pleinement exploités dans la régénération des tissus, la régulation immunitaire et en tant que vecteur de livraison4. Grâce à des techniques d’ingénierie, des ligands spécifiques peuvent être enrichis à la surface des exosomes, ce qui permet d’induction ou d’inhibition d’événements de signalisation dans les cellules réceptrices ou de cibler des types cellulaires spécifiques5. Les agents chimiothérapeutiques peuvent également être chargés dans les exosomes pour le traitement du cancer6. De plus, les exosomes ont la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique pour l’administration de cargaisons thérapeutiques, ce qui les rend très prometteurs pour le traitement des troubles cérébraux7. Par rapport aux liposomes, les exosomes présentent une absorption cellulaire accrue et une biocompatibilité améliorée8. Ils sont capables de pénétrer efficacement dans d’autres cellules tout en faisant preuve d’une meilleure tolérance et d’une toxicité plus faible9. Cependant, l’injection traditionnelle d’exosomes en bolus est sujette à la séquestration et à l’élimination rapide par le foie, les reins et la rate dans la circulation sanguine10. De plus, les exosomes ont une faible stabilité in vitro et sont sensibles aux conditions de stockage, ce qui limite leurs applications cliniques11.
Les micro-aiguilles, un ensemble de pointes d’aiguilles de taille micrométrique, ont la capacité de pénétrer les barrières physiologiques pour l’administration de petites molécules de médicaments12, de protéines13, d’acides nucléiques14 et de nanomédicaments15. Les micro-aiguilles sont conçues avec précision pour cibler les lésions à la surface de la peau, et leurs pointes dispersées assurent une distribution uniforme du médicament sur le site ciblé, amplifiant ainsi leur impact thérapeutique16. La conception et la composition des matériaux des micro-aiguilles facilitent le stockage à sec de substances bioactives telles que les protéines et les acides nucléiques, améliorant ainsi leur stabilité17. Les méthodes d’injection traditionnelles ont une durée d’action relativement courte et peuvent provoquer des douleurs, induisant la peur chez les patients18. La longueur de la micro-aiguille, de taille micrométrique, minimise les traumatismes tissulaires et empêche la stimulation nerveuse, éliminant ainsi la douleur et améliorant l’observance du patient19. De plus, la nature conviviale des micro-aiguilles permet aux patients de s’auto-administrer le traitement sans avoir besoin de personnel spécialisé16. En plus de la peau, les micro-aiguilles peuvent également être utilisées dans des tissus tels que les yeux20, la muqueuse buccale21, le cœur22 et les vaisseaux sanguins23. L’application de micro-aiguilles pour l’administration clinique d’exosomes fournit une stratégie prometteuse et prospective.
Par conséquent, nous introduisons un patch de micro-aiguille (exo@MN) chargé d’exosomes et divulguons sa méthode de fabrication. Les patchs à micro-aiguilles ont été fabriqués à l’aide d’une méthode de coulée en deux étapes, ainsi que d’une centrifugation et d’un séchage sous vide, ce qui favorise l’agrégation des exosomes à l’extrémité des micro-aiguilles, améliorant ainsi l’efficacité de l’administration. Les pointes des aiguilles et le support ont été fabriqués à l’aide de matériaux qui présentent une excellente biocompatibilité et une excellente solubilité dans l’eau. Le tréhalose et l’acide hyaluronique (HA) ont été incorporés comme matériaux de pointe pour protéger les exosomes, et la polyvinylpyrrolidone (PVP) dissoute dans de l’éthanol absolu a été choisie comme matériau de support. La morphologie du patch de micro-aiguilles a été caractérisée à l’aide de la microscopie et du microscope électronique à balayage (MEB). Les essais mécaniques des micro-aiguilles ont été évalués à l’aide d’un tensimètre pour confirmer leur capacité à pénétrer la peau, et le taux de libération sur la peau de porc a été évalué à 60 s. De plus, la morphologie, la taille et la teneur en protéines des exosomes frais et des exosomes en exo@MN ont été caractérisées à l’aide d’un microscope électronique à transmission (MET), d’une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et d’un western blot (WB). L’internalisation des exosomes par les cellules dendritiques (DC) a été caractérisée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (CLSM), et la maturation des DC a été évaluée par cytométrie en flux. La caractérisation morphologique et les fonctions biologiques des deux types d’exosomes sont essentiellement cohérentes.
Cette étude n’a pas besoin d’une autorisation éthique, car la peau de porc utilisée pour les expériences décrites à la section 3 a été achetée sur le marché sous forme d’oreilles de porc comestibles et ne provient pas d’animaux de laboratoire.
1. Isolement des exosomes
2. Fabrication de exo@MN
Figure 1 : Processus de fabrication de exo@MN patchs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Caractérisation des patchs exo@MN
4. Caractérisation des exosomes dans exo@MN patch
REMARQUE : Les pointes des micro-aiguilles de exo@MN sont dissoutes dans 100 μL de solution de DPBS pour effectuer la caractérisation suivante sur les exosomes libérés.
5. Analyse statistique
Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement des exosomes, la fabrication et la caractérisation de exo@MN patch. La figure 1 illustre l’organigramme du processus de fabrication de exo@MN patch. Les exosomes ont été mélangés avec du tréhalose et de l’HA, puis le mélange a été ajouté au moule à micro-aiguilles et centrifugé. Ce processus a facilité l’agrégation des exosomes à l’extrémité des aiguilles, favorisant une libération rapide. Après séchage, une so...
Actuellement, les principales méthodes d’isolement des exosomes comprennent l’ultracentrifugation, la centrifugation à gradient de densité, l’ultrafiltration, la précipitation, les billes magnétiques d’immunoaffinité et la microfluidique24. En raison de la capacité de charge limitée des micro-aiguilles causée par leur petit espace de pointe d’aiguille, il est nécessaire d’augmenter la concentration d’exosomes pour charger davantage. Par conséquent, nous avons choisi l’ul...
H. C., F.L.Q et S.J.M sont les inventeurs d’une demande de brevet qui a été déposée sur la base des données de ce manuscrit. H.C. est le fondateur scientifique de Medcraft Biotech. Inc.
F.L.Q. apprécie le soutien du Programme de R&D pionnier du Zhejiang (2022C03031), du Programme national de recherche et développement clés de la Chine (2021YFA0910103), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (22274141, 22074080), de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2022ZD28) et du Taishan Scholar Program de la province du Shandong (tsqn201909106). H.C. tient à souligner le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82202329). Les auteurs reconnaissent l’utilisation d’instruments à la plateforme d’instrumentation partagée de l’Institut de médecine de Hangzhou (HIM) de l’Académie chinoise des sciences.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100x penicillin-streptomycin solutions | Jrunbio Scientific | MA0110 | Cell culture |
180 kDa pre-stained protein marker | Thermo | 26616 | Western blotting |
3% Uranyl acetate | Henan Ruixin Experimental Supplies | GZ02625 | Morphological characterization of exosomes |
3D printer | BMF technology | nanoArch S130 | Mold preparation |
4%–20% precast gel | Genscript | ExpressPlus PAGE GEL | Western blotting |
5× SDS-PAGE loading buffer | Titan | 04048254 | Western blotting |
Anti-mouse Alix antibody | Biolegend | 12422-1-AP | Western blotting |
Anti-mouse CD63 antibody | Biolegend | ab217345 | Western blotting |
APC anti-mouse CD80 antibody | Biolegend | 104713 | Antibody |
Auto fine coater | ZIZHU | JBA5-100 | Morphological characterization of microneedle |
BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
Centrifuge | Thermo Fisher | Muitifuge X1R pro | Cell centrifuge |
Circulating water vacuum pump | Yuhua Instrument | SHZ-D(III) | Filtration |
CO2 incubator | Eppendorf | CellXpert C170 | Cell culture |
Confocal laser scanning microscope | Nikon | A1HD25 | Fluorescence imaging |
Copper mesh | Beijing Zhongjingkeyi Technology | JF-ZJKY/300 | Morphological characterization of exosomes |
D- (+) -Trehalose dihydrate | Aladdin | 5138-23-4 | Fabrication of microneedle |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Meilunbio | MA0212 | Cell culture |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Meilunbio | MA0010 | Cell culture |
Electrophoresis system | Bio-rad | PowerPac-basic | Western blotting |
Fetal bovine serum | Jrunbio Scientific | JR100 | Cell culture |
FITC anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Antibody |
Flow cytometry | BD | LSR Fortessa | Fluorescence detection |
Gel imager | Cytiva | Amersham ImageQuant 800 | Western blotting |
HRP-conjugated anti-rabbit IgG | CST | 7074S | Western blotting |
HTL resin | BMF technology | Mold preparation | |
Hyaluronic acid (MW = 300 kDa) | Bloomage Biotechnology | 9004-61-9 | Fabrication of microneedle |
Immersion oil | Nikon | MXA22168 | Fluorescence imaging |
Ion cleaner | JEOL | EC-52000IC | Morphological characterization of exosomes |
Microscope | Olympus | CKX53 | Observe the microneedle tip dissolving process |
Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8 | MeisenCTCC | CC90105 | Cell culture |
Nanoparticle tracking analysis | Particle Metrix | ZetaView | Size analysis of exosomes |
Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend | 107619 | Antibody |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Beyotime | ST507 | Protease inhibitors |
Plasma cleaner | Hefei Kejing Material Technology | PDC-36G | Fabrication of microneedle |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | 9016-00-6 | Mold preparation |
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa) | Aladdin | 9003-39-8 | Fabrication of microneedle |
Prism | GraphPad | Version 9 | Statistical analysis |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Western blotting |
Quick-snap centrifuge | Beckman | 344619 | Exosomes extraction |
RIPA lysis buffer | Applygen | C1053 | Lysis membrane |
Roswell park memorial institute 1640 | Meilunbio | MA0548 | Cell culture |
Scanning electron microscope | JEOL | JSM-IT800 | Morphological characterization of microneedle |
Stereo microscope | Olympus | SZX16 | Characterization of morphology |
Super ECL detection reagent | Applygen | P1030 | Western blotting |
Tensile meter | Instron | 68SC-05 | Mechanical testing |
Transmission electron microscope | JEOL | JEM-2100plus | Morphological characterization of exosomes |
Tris buffered saline | Sangon Biotech | JF-A500027-0004 | Western blotting |
Tween-20 | Beyotime | ST825 | Western blotting |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosomes extraction |
Ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | Exosomes concentration |
Vacuum drying oven | Shanghai Yiheng Technology | DZF-6024 | Fabrication of microneedle |
Vacuum filtration system | Biosharp | BS-500-XT | Filtration |
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