JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تصميم هذا البروتوكول للتحقيق في مدى تلف الحمض النووي الذي يحدث أثناء تكرار الحمض النووي. في ظل ظروف محايدة ، يمكن تقييم تحريض فواصل الحمض النووي بسهولة في إطار زمني قصير. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتوكول قابل للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى وكواشف إجهاد النسخ المتماثل المختلفة.

Abstract

يواجه تكرار الحمض النووي باستمرار تحديا من خلال مجموعة واسعة من الضغوطات الداخلية والخارجية التي يمكن أن تلحق الضرر بالحمض النووي. يمكن لمثل هذه الآفات التي تصادف أثناء تكرار الجينوم أن توقف الردود وتحول شوكات النسخ المتماثل إلى فواصل مزدوجة الخيوط. إذا تركت دون إصلاح ، يمكن أن تؤدي فواصل الحمض النووي السامة هذه إلى إعادة ترتيب الكروموسومات ، مما يؤدي إلى زيادة عدم استقرار الجينوم وزيادة احتمال التحول الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الخلايا السرطانية إجهادا مستمرا للتكرار ، مما يجعل استهداف نقاط ضعف شوكة النسخ المتماثل في الخلايا السرطانية استراتيجية جذابة للعلاج الكيميائي. تقنية متعددة الاستخدامات وقوية للغاية لدراسة فواصل الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل هي مقايسة المذنب. تكتشف تقنية الرحلان الكهربائي الهلامي هذه بشكل موثوق تحريض وإصلاح فواصل الحمض النووي على مستوى الخلية الواحدة. هنا ، تم تحديد بروتوكول يسمح للمحققين بقياس مدى تلف الحمض النووي في تقسيم الخلايا البشرية انقساميا باستخدام عوامل توقف الشوكة عبر أنواع متعددة من الخلايا. إن اقتران ذلك بتسجيل المذنبات الآلي يسهل التحليل السريع ويعزز الموثوقية في دراسة تحريض فواصل الحمض النووي.

Introduction

مقايسة المذنب هي طريقة رحلان كهربائي هلامي تستخدم للكشف عن فواصل الحمض النووي على مستوى الخلية الواحدة. يعتمد على مبدأ أن فواصل الحمض النووي المفتوحة تهاجر في ظل ظروف الرحلان الكهربائي ، بينما يظل الحمض النووي السليم ثابتا إلى حد كبير. يهاجر الحمض النووي المكسور لأن الفواصل تؤدي إلى استرخاء الحمض النووي الفائق ، مما يتسبب في انتقاله المكاني التدريجي نحو الأنود في غرفة الرحلان الكهربائي ، مما يؤدي إلى ظهور يشبه المذنب لوحظ بواسطة التألق المناعي 1,2. ثم يتم قياس مدى تلف الحمض النووي عن طريق تحديد كمية الحمض النووي المكسور التي هاجرت بالنسبة إلى الحمض النووي المضغوط.

طريقتا فحص المذنبات الأكثر استخداما هما مقايسة المذنب القلوي (AC) ومقايسة المذنب المحايد (NC). يتم إجراء فحص التيار المتردد تحت ظروف تغيير طبيعة باستخدام محلول درجة حموضة قلوية عالية ، بينما يتم إجراء فحص NC في محلول بدرجة حموضة محايدة. يمكن لكل من فحوصات NC و AC اكتشاف فواصل الحمض النووي التي تحدث في النواة بشكل موثوق. ومع ذلك ، فإن النسخة القلوية مفيدة أيضا للكشف عن المواقع القلوية3. يتطلب كلا الشكلين من الفحص استخدام ظروف التحلل للتأكد من خلو الحمض النووي من البروتينات قبل الرحلان الكهربائي.

هذا الفحص هو طريقة بسيطة للكشف عن فواصل الحمض النووي ويوفر العديد من المزايا الفريدة لتحديد تلف الحمض النووي الخلوي. هذه الطريقة سهلة الإعداد نسبيا وتتطلب كواشف يمكن تحضيرها في المختبر أو شراؤها من البائعين التجاريين. كتقنية دقة أحادية الخلية ، يتطلب الفحص القليل جدا من المواد الأولية. والجدير بالذكر أن مقايسة NC يمكنها قياس الفواصل ذات الحساسية العالية ، والتي تم الإبلاغ عنها للكشف عن ما بين 50 و 10000 كسر لكل خلية4. يتضح تنوع هذه التقنية من خلال مجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك علم السموم البيئية5 ، والرصد البيولوجي البشري6 ، ودراسات السمية الجينية7. يمكن أيضا استخدام الفحص بشكل موثوق عبر أنواع مختلفة من الخلايا وتكييفه للمقايسات عالية الإنتاجية8 ولتقييم الفواصل في مناطق جينومية محددة9. وبالتالي ، فإن هذا الفحص بمثابة تقنية سريعة وموثوقة للتحقيق في تكوين الكسر على مستوى الخلية الواحدة.

يتم تحدي عملية تكرار الحمض النووي باستمرار من خلال العديد من الضغوطات الداخلية والخارجية10,11. يمكن أن يؤدي توقف الردود بسبب هذه الآفات إلى حدوث فواصل في الحمض النووي ويؤدي إلى زيادة عدم استقرار الجينوم. غالبا ما تنشأ فواصل الحمض النووي أيضا كمواد وسيطة للتكرار لتسهيل إصلاح الحمض النووي12. بالإضافة إلى ذلك ، تحفز العديد من عوامل العلاج الكيميائي فواصل مزدوجة الخيوط تعتمد على النسخ المتماثل (DSBs) ، مثل كامبتوثيسين (CPT) 13،14،15ومثبطات PARP16،17. وبالتالي ، فإن هذا الفحص بمثابة منهجية قوية لدراسة طبيعة آفات الحمض النووي ، وتقييم معالجة شوكات النسخ المتماثل ، والتحقيق في الإمكانات العلاجية للعوامل الضارة بالحمض النووي. كانت تعديلات الفحص التي تتضمن تسمية الحمض النووي المركب حديثا باستخدام BrdU مفيدة لدراسة الأنماط الظاهرية للإجهاد المرتبط بالتكرار18،19،20،21. والجدير بالذكر أن مقايسة NC هي طريقة موثوقة لدراسة تحريض كسر الحمض النووي في سياق النسخ المتماثل ، كما هو موضح في الدراسات التي تتضمن توصيف بروتينات الشوكة22,23 ، وتحليل وسيطات النسخالمتماثل 24,25 ، والتحقيق في تعارضات النسخ والتكرار في صيانة الجينوم26,27. هنا ، نحدد بروتوكول فحص NC بهدف تحديد فواصل الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل في الخلايا البشرية. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول بسهولة من قبل الباحثين المهتمين بتقييم الضرر المرتبط بالإجهاد المتماثل في مجموعة واسعة من الخلايا البشرية المنقسمة.

Protocol

يستخدم هذا البروتوكول (الشكل 1) بشكل أساسي خطوط الخلايا السرطانية U2OS الملتصقة ولكنه قابل للتكيف مع مجموعة متنوعة من الخلايا الملتصقة والمعلقة المزروعة في زراعة الأنسجة. وترد في الجدول 1 تفاصيل الحلول والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تحضير المواد

  1. قبل يوم التجربة ، ضع الزجاجة المرفقة مع أغاروز منخفض الذوبان (1٪ أغاروز منخفض الذوبان في PBS) في حمام ماء ساخن لمدة 5-10 دقائق للتأكد من ذوبان الأغاروز تماما.
    ملاحظة: لا تسخن الزجاجة في الميكروويف.
  2. بمجرد ذوبانها ، قم بسرعة بتقسام 100 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي من الأغاروز إلى 1.5 مل حسب الحاجة وتخزين الأنابيب عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين الأغاروز المتصلب عند 4 °C لمدة تصل إلى 1 سنة.
  3. في يوم التجربة ، قم بإزالة العدد المطلوب من أنابيب الطرد المركزي من التخزين 4 درجات مئوية. تذوب الأغاروز عن طريق وضع الأنابيب في كتلة حرارية أو حمام مائي عند 42 درجة مئوية.
    ملاحظة: ضع الأنابيب على درجة حرارة 42 درجة مئوية قبل حصاد الخلايا لضمان ذوبان الأغاروز تماما لإعادة التعليق (الخطوة 3.7).
  4. قم بإعداد محلول تحلل طازج ومخزن TAE مؤقت في يوم التجربة وقم بتخزينهما في درجة حرارة الغرفة و 4 درجات مئوية ، على التوالي ، حتى تصبح جاهزة للاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، قسمة 1x PBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ووضعها في الثلاجة لاستخدامها في خطوة إعادة التعليق (الخطوة 3.5).
  5. ضع علامة على تعريفات العينة على الطرف المتجمد لشرائح المذنب 2-well وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

2. إعداد العينات

  1. قبل يوم التجربة ، قم بزرع الخلايا في طبق مكون من 6 آبار واستزراع طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. بالنسبة لخلايا U2OS ، تم زرع ما يقرب من 2-3 × 105 خلايا لكل عينة.
    ملاحظة: قد تحتاج أرقام الخلايا إلى التعديل اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة في التحليلات.
  2. في يوم التجربة ، عالج الخلايا التي تعاني من الظروف وفقا للتصميم التجريبي. كعنصر تحكم إيجابي لإثبات تحريض الكسر المعتمد على النسخ المتماثل ، عالج الخلايا باستخدام 1 ميكرومتر CPT لمدة 1 ساعة. CPT هو مثبط توبوإيزوميراز -1 الذي يحفز فواصل حبلا مزدوجة بطريقة تعتمد على النسخالمتماثل 14.

3. إعادة تعليق الخلية والتحلل

  1. نضح وسائط زراعة الخلايا واشطفها مرتين باستخدام 1x PBS.
  2. أضف 300 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر. احتضان الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 2-3 دقائق.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي الحضانة المطولة في التربسين إلى نتائج زائفة أثناء تحليل المذنبات.
  3. أضف 700 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى كل بئر. أعد التعليق برفق وانقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: يوصى بحساب عدد الخلايا في هذه الخطوة للحصول على كثافة الخلايا المناسبة في الخطوة 3.6 لتقليل تكرار الذيول المتداخلة أثناء التحليل.
  4. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 2400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. نضح الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من البرد 1x PBS.
  6. كرر الخطوتين 3.4 و 3.5 مرتين وأعد تعليق الخلايا في 1x PBS البارد بكثافة خلية 2 × 105 خلايا لكل مل.
    ملاحظة: يوصى بتقييم صلاحية الخلية في هذه الخطوة لضمان وجود عدد كاف من الخلايا القابلة للحياة. يوصى بصلاحية 90٪ على الأقل.
  7. أعد تعليق 10 ميكرولتر من معلق الخلية في 100 ميكرولتر من الأغاروز المذاب ، وباستخدام نفس طرف الماصة ، امزج بلطف وانشر الخليط بالتساوي في بئر واحد من الشريحة. كرر هذه الخطوة لجميع العينات حسب الحاجة.
    ملاحظة: تجنب إزالة جميع القسامات من حمام مائي 42 درجة مئوية مرة واحدة لمنع الأغاروز من التصلب. يفضل أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بواسطة حمام مائي ، ويتم إعادة تعليق كل عينة ونشرها بطريقة متداخلة. تجنب إدخال الفقاعات أثناء نشر الأغاروز على الشريحة لأن الجيوب الهوائية ستؤثر على هجرة ذيول المذنب أثناء الرحلان الكهربائي (الخطوة 4.5) وإدخال تشققات في خطوة التجفيف (الخطوة 5.3)
  8. قم بتخزين الشرائح على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 15-20 دقيقة للتأكد من أن الأغاروز قد تجمد تماما (الشكل 2 أ).
  9. ضع الشرائح في برطمانات كوبلين واغمر الشرائح في محلول التحلل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. اشطف الشرائح مرة واحدة باستخدام المخزن المؤقت TAE البارد واغمر الشرائح في محلول TAE البارد لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

4. الكهربائي

  1. قم بإعداد غرفة الرحلان الكهربائي على سطح مستو وقم بتسوية النظام باستخدام مقابض التسوية الأربعة على حواف الجهاز. أدخل كمادات باردة في الحجرة السفلية للحفاظ على المحلول باردا أثناء الرحلان الكهربائي.
  2. صب ما يقرب من ~ 850 مل من المخزن المؤقت البارد 1x TAE في الجهاز.
  3. قم بإزالة الشرائح من 4 درجات مئوية وضعها على صينية الرحلان الكهربائي في الاتجاه الصحيح للسماح بترحيل الحمض النووي المكسور.
    ملاحظة: الدرج يحمل عشر شرائح 2 بئر. ضع الشرائح في وسط الدرج إذا كنت تعمل بعدد أقل من العينات. إذا كنت تعمل مع عدد فردي من الشرائح ، فقم بتضمين شريحة فارغة بحيث يستوعب كل بئر شرائح 2.
  4. ضع تراكب درج الشرائح المرفق برفق أعلى الدرج لتغطية الشرائح.
    ملاحظة: للتشغيل السليم للجهاز ، يجب ألا يكون حجم المخزن المؤقت TAE أقل من السطح السفلي للتراكب ولا يتجاوز السطح العلوي للتراكب.
  5. بعد توصيل الكابلات ، اضبط الطاقة على 21 فولت وقم بإجراء الرحلان الكهربائي (1 فولت / سم) لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: قد يلزم تعديل وقت الرحلان الكهربائي اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة في التحليلات. تشير ذيول طويلة في العينات غير المعالجة إلى وقت تشغيل مفرط. على العكس من ذلك ، قد تعكس الذيول القصيرة في عينات التحكم الإيجابية وقت تشغيل غير كاف.

5. تلطيخ

  1. بعد الانتهاء من الكهربائي ، قم بإزالة الشرائح من الجهاز واغمرها في محلول ترسيب الحمض النووي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تخلص من محلول ترسيب الحمض النووي واغمر الشرائح في محلول إيثانول بنسبة 70٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تخلص من محلول الإيثانول بنسبة 70٪. قم بإزالة الشرائح وجففها في فرن تهجين على حرارة 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام (الشكل 2 ب).
    ملاحظة: يمكن ترك الشرائح في مكان مظلم وجاف طوال الليل لخطوة التجفيف.
  4. احتضان الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول 1x SYBR Green لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  5. صب محلول SYBR Green عن طريق إمالة الشرائح وإزالة الفائض عن طريق غمس حافة البئر برفق بمنديل خال من النسالة.
  6. ضع الشرائح في درج واتركها تجف لمدة 30 دقيقة.
  7. المضي قدما في تصوير الشرائح.

6. التصوير والتحاليل

  1. قم بإعداد المجهر لأغراض التصوير.
    ملاحظة: تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر التألق. تم استخدام تكبير 10x مع فتحة عدسة رقمية 0.45 مع وقت تعريض 1/40 ثانية وكسب + 6 ديسيبل. تم استخدام وضع الالتقاط أحادي اللون 8 بت مع 2 × 2 binning وتصحيح توازن اللون الأسود.
  2. ضع الشرائح على مرحلة المجهر وابدأ التصوير باستخدام مرشح FITC.
    ملاحظة: استخدم العينة غير المعالجة أولا لاختبار وقت التعرض. لا تظهر معظم الخلايا ذيول المذنبات لأن الحمض النووي أكثر إحكاما. قم بالتبديل إلى البئر باستخدام الخلايا المعالجة ب CPT والصورة باستخدام نفس وقت التعرض. ستلاحظ ذيول المذنبات ذات الأطوال المتزايدة في هذه العينة بسبب هجرة نهايات الحمض النووي المكسورة.
  3. احصل على صور لما لا يقل عن 100 مذنب لكل عينة باستخدام نفس وقت التعرض عبر ثلاث نسخ مكررة تقنية.
    ملاحظة: تميل ذيول المذنب في نهاية أغطية الغطاء إلى الهجرة بشكل غير متساو وتعمل كقيم متطرفة في توزيع العينة. توجد معظم المذنبات التي تم التقاطها للتحليل بالقرب من مركز الغطاء (الشكل 3).
  4. تصدير الصور وتسجيل المذنبات إما يدويا (باستخدام الصورة J) أو باستخدام برنامج تسجيل المذنبات المتاح مجانا. يتم اختيار المذنبات التي يمكن تمييزها بشكل فردي والواردة بالكامل في مجال الرؤية للتسجيل. لا يتم النظر في المذنبات المتداخلة أو المرئية جزئيا لمزيد من التحليلات (الشكل 4).
    ملاحظة: يمكن للمستخدمين تسجيل المذنبات على الصورة J باستخدام المكون الإضافي التالي: https://cometbio.org/index.html. يتم تضمين تفاصيل تسجيل المذنبات باستخدام برنامج CometScore في الشكل 5.
  5. لحظات ذيل المؤامرة المكتسبة من التحليلات كمخططات صندوقية وشارب تصور 10-90 قيما مئوية. إجراء اختبارات الحالة الطبيعية لتحديد ما إذا كان ينبغي استخدام الاختبارات البارامترية أو غير البارامترية للتحليلات الإحصائية.
    ملاحظة: في معظم الحالات ، يتم تطبيق الاختبارات غير البارامترية باستخدام اختبار Mann-Whitney في حالة مقارنة عينتين فقط أو اختبار Kruskal-Wallis مع مقارنات Dunn المتعددة في حالة مقارنة ثلاث عينات أو أكثر.

النتائج

تحليل تحريض الكسر بواسطة كواشف الإجهاد المتماثلة
تمت معالجة خلايا U2OS باستخدام DMSO ، 4 من mM hydroxyurea (HU) ، أو 100 نانومتر من CPT لمدة 4 ساعات وتم تحليلها لتراكم الكسر بواسطة مقايسة NC (الشكل 6A). بينما يحفز CPT فواصل خلال المرحلة S عن طريق منع topoisomerase-113 ، فإن استنفا?...

Discussion

يحدد هذا البروتوكول مقايسة NC لتقييم فواصل الحمض النووي في الخلايا البشرية التي تخضع للتكرار النشط. البروتوكول سهل التنفيذ نسبيا ، ويمكن للباحثين تكييفه بسهولة مع ظروف الأس الهيدروجيني العالية للتحليلات القلوية8. ويتضمن خطوتين حاسمتين، كما هو موضح في الخطوتين 3-7 و4-5. في الخطو?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر Dungrawala على مدخلاتهم وتعليقاتهم. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM137800 إلى HD.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSGibco14190144
CamptothecinSelleckchemS1288
Comet LMAgarose (LMA)R&D systems4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System IIR&D systems4250-050-ESIncludes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore softwareTriTekopen-sourced
CometSlideR&D systems4250-050-03
DMEM, high glucoseGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO FisherSciD128-4
Epifluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Fetal Bovine Serum - PremiumBio-TechneS11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T cellsATCCCRL-11268
hTERT-RPE-1 cellsATCCCRL-4000
HydroxyureaMillipore SigmaH8627
PARP inhibitor OlaparibSelleckchemS8096
PowerPac FisherSciFB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture PlateFisherSciFB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)FisherSciS7567
U2OS cellsATCCHTB-96
UVP HB-1000 Hybridization IncubatorFisherSciUVP95003001

References

  1. Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  4. Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  5. De Lapuente, J., et al. The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives. Front Genet. 6, 180 (2015).
  6. Azqueta, A., et al. Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288 (2020).
  7. Speit, G., Hartmann, A. The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage. Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).
  8. Collins, A., et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols. Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).
  9. Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair. Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).
  10. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).
  11. Cimprich, K. A., Cortez, D. Atr: An essential regulator of genome integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
  12. Cortez, D. Replication-coupled DNA repair. Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).
  13. Strumberg, D., et al. Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).
  14. Pommier, Y. Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond. Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).
  15. Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i. J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).
  16. Bryant, H. E., et al. Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  17. Helleday, T. The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings. Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).
  18. Mcglynn, A. P., et al. The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells. Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).
  19. Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay. PLoS One. 8 (8), e70391 (2013).
  20. Thakar, T., et al. Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling. Nat Commun. 13 (1), 5323 (2022).
  21. Vaitsiankova, A., et al. Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).
  22. Dungrawala, H., et al. Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks. Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).
  23. Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity. Cell Rep. 34 (4), 108669 (2021).
  24. Lemacon, D., et al. Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells. Nat Commun. 8 (1), 860 (2017).
  25. Leung, W., et al. Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms. Cell Rep. 42 (7), 112792 (2023).
  26. Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability. Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).
  27. Mosler, T., et al. R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability. Nat Commun. 12 (1), 7314 (2021).
  28. Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair. Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).
  29. Sestili, P., Cantoni, O. Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission. Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).
  30. Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level. Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).
  31. Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).
  32. Hanada, K., et al. The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks. Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved