АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол предназначен для исследования степени повреждения ДНК, происходящего во время репликации ДНК. В нейтральных условиях индукция разрывов ДНК может быть легко оценена в течение короткого промежутка времени. Кроме того, протокол может быть адаптирован к другим типам клеток и различным реагентам для репликации стресса.

Аннотация

Репликация ДНК постоянно подвергается сомнению из-за широкого спектра эндогенных и экзогенных стрессоров, которые могут повредить ДНК. Такие повреждения, возникающие во время дупликации генома, могут привести к остановке репликосом и превращению репликационных вилок в двухцепочечные разрывы. Если их не восстановить, эти токсичные разрывы ДНК могут вызвать хромосомные перестройки, что приведет к повышенной нестабильности генома и увеличению вероятности клеточной трансформации. Кроме того, раковые клетки проявляют стойкий репликационный стресс, что делает нацеливание на уязвимости репликационной вилки в опухолевых клетках привлекательной стратегией для химиотерапии. Очень универсальным и мощным методом изучения разрывов ДНК во время репликации является анализ комет. Этот метод гель-электрофореза надежно обнаруживает индукцию и репарацию разрывов ДНК на уровне отдельных клеток. В настоящем документе изложен протокол, который позволяет исследователям измерять степень повреждения ДНК в митотически делящихся клетках человека с использованием агентов, замедляющих вилку, в нескольких типах клеток. Сочетание этого с автоматической оценкой комет способствует быстрому анализу и повышает надежность в изучении индукции разрывов ДНК.

Введение

Кометный анализ представляет собой метод гель-электрофореза, используемый для обнаружения разрывов ДНК на уровне отдельных клеток. Он основан на принципе, согласно которому открытые разрывы ДНК мигрируют в электрофоретических условиях, в то время как неповрежденная ДНК остается в основном статичной. Разорванная ДНК мигрирует, потому что разрывы приводят к расслаблению суперспиральной ДНК, вызывая ее постепенное пространственное перемещение к аноду в электрофоретической камере, что приводит к появлению кометного вида, наблюдаемого по иммунофлуоресценции 1,2. Степень повреждения ДНК затем измеряется путем количественной оценки количества поврежденной ДНК, которая мигрировала относительно компактной ДНК.

Двумя наиболее часто используемыми методами анализа комет являются анализ щелочной кометы (AC) и анализ нейтральной кометы (NC). Анализ АС проводится в условиях денатурации с использованием раствора с высоким щелочным рН, в то время как анализ НС проводится в растворе с нейтральным рН. Как NC, так и AC анализы могут надежно обнаруживать разрывы ДНК, которые происходят в ядре. Тем не менее, щелочной вариант также полезен для обнаружения щелочно-лабильных участков3. Оба формата анализа требуют использования условий лизиса, чтобы гарантировать, что ДНК свободна от белков до электрофореза.

Этот анализ является простым методом обнаружения разрывов ДНК и предлагает несколько уникальных преимуществ для определения повреждения клеточной ДНК. Метод относительно прост в настройке и требует реагентов, которые могут быть либо приготовлены в лаборатории, либо приобретены у коммерческих поставщиков. Поскольку анализ используется с разрешением одиночных клеток, для анализа требуется очень мало исходного материала. Примечательно, что анализ NC может измерять разрывы с высокой чувствительностью, которая, как сообщается, обнаруживает от 50 до 10 000 разрывов наклетку4. Универсальность этого метода демонстрируется широким спектром его применения, включая экотоксикологию5, биомониторинг человека6 и исследования генотоксичности7. Анализ также может быть надежно использован для различных типов клеток и адаптирован для высокопроизводительных анализов8 и для оценки разрывов в конкретных областях генома9. Таким образом, данный анализ служит быстрым и надежным методом исследования образования разрывов на уровне отдельных клеток.

Процесс репликации ДНК постоянно осложняется несколькими эндогенными и экзогенными стрессорами10,11. Остановка репликосом из-за таких повреждений может вызвать разрывы ДНК и привести к повышенной нестабильности генома. Разрывы ДНК также часто возникают в качестве промежуточных продуктов репликации, облегчающих репарацию ДНК12. Кроме того, некоторые химиотерапевтические агенты индуцируют репликационно-зависимые двухцепочечные разрывы (DSB), такие как камптотекин (CPT)13,14,15 и ингибиторы PARP 16,17. Таким образом, этот анализ служит мощной методологией для изучения природы повреждений ДНК, оценки процессинга репликационных вилок и исследования терапевтического потенциала агентов, повреждающих ДНК. Адаптации анализа, которые включают мечение вновь синтезированной ДНК с помощью BrdU, были полезны для изучения фенотипов стресса, связанного с репликацией, 18,19,20,21. В частности, NC-анализ является надежным методом для изучения индукции разрыва ДНК в контексте репликации, как было продемонстрировано в исследованиях, включающих характеристику белков вилки22,23, анализ промежуточных продуктов репликации24,25 и исследование конфликтов транскрипции-репликации при поддержании генома26,27. В данной работе мы описываем протокол NC-анализа с целью количественной оценки разрывов ДНК во время репликации в клетках человека. Этот протокол может быть легко реализован исследователями, заинтересованными в оценке повреждений, связанных со стрессом репликации, в широком спектре делящихся клеток человека.

протокол

Этот протокол (рис. 1) в основном использует адгезивные линии раковых клеток U2OS, но может быть адаптирован к широкому спектру адгезивных и суспензионных клеток, выращенных в культуре тканей. Растворы и буферы, использованные в данном исследовании, подробно описаны в таблице 1. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов

  1. До дня эксперимента поместите прилагаемую бутылку с агарозой с низким содержанием таяния (1% агарозы с низким содержанием таяния в PBS) на водяную баню на 5-10 минут, чтобы убедиться, что агароза полностью растаяла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не нагревайте бутылку в микроволновой печи.
  2. После расплавления быстро добавьте 100 мкл агарозы в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл по мере необходимости и храните пробирки при температуре 4 °C. Застывшая агароза может храниться при температуре 4 °C до 1 года.
  3. В день проведения эксперимента извлеките необходимое количество пробирок центрифуги из хранилища при температуре 4 °C. Растопите агарозу, поместив трубки в термоблок или водяную баню при температуре 42 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите пробирки при температуре 42 °C перед забором клеток, чтобы убедиться, что агароза полностью расплавилась для повторного взвешивания (шаг 3.7).
  4. Приготовьте свежий буфер для лизиса и буфер TAE в день эксперимента и храните их при комнатной температуре и 4 °C соответственно до готовности к использованию. Кроме того, поместите 1x PBS в коническую пробирку объемом 15 мл и поместите ее в холодильник для использования на этапе ресуспензии (шаг 3.5).
  5. Отметьте идентификационные образцы на матовом конце 2-луночных предметных стекол и храните их при комнатной температуре до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

2. Подготовка образцов

  1. До дня эксперимента засейте клетки в 6-луночную чашку и культивируйте в течение ночи при 37 °C с 5%CO2. Для клеток U2OS для каждого образца засевали примерно 2-3 x 105 клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек может потребоваться скорректировать в зависимости от типа клеток, используемых для анализов.
  2. В день эксперимента обработайте клетки в условиях, соответствующих плану эксперимента. В качестве положительного контроля для демонстрации репликационно-зависимой индукции разрыва обрабатывайте клетки 1 мкМ CPT в течение 1 ч. CPT является ингибитором топоизомеразы-1, который индуцирует двухцепочечные разрывы репликационно-зависимым образом14.

3. Ресуспендия и лизис клеток

  1. Аспирируйте питательную среду для клеточных культур и дважды промойте 1x PBS.
  2. Добавьте по 300 мкл трипсина в каждую лунку. Инкубируйте чашку в инкубаторе для тканевых культур в течение 2-3 минут.
    Примечание: Длительная инкубация в трипсине может привести к ложным результатам во время анализа комет.
  3. Добавьте в каждую лунку по 700 мкл среды для клеточных культур. Аккуратно восстановите суспендию и переложите образцы в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет ячеек на этом этапе рекомендуется проводить для получения соответствующей плотности ячеек на шаге 3.6, чтобы уменьшить частоту перекрывающихся хвостов во время анализа.
  4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 2400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Аспирируйте среду и ресуспендируйте клетки в 1 мл холода 1x PBS.
  6. Повторите шаги 3.4 и 3.5 дважды и повторно суспендируйте клетки в холодном 1x PBS при плотности клеток 2 x 105 клеток на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка жизнеспособности клеток на этом этапе рекомендуется для обеспечения наличия достаточного количества жизнеспособных клеток. Рекомендуется жизнеспособность не менее 90%.
  7. Ресуспендируйте 10 мкл клеточной суспензии в 100 мкл аликвоты расплавленной агарозы и, используя тот же наконечник для пипетки, аккуратно перемешайте и равномерно распределите смесь по одной лунке предметного стекла. При необходимости повторите этот шаг для всех образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не удаляйте все аликвоты с водяной бани 42 °C за один раз, чтобы предотвратить затвердевание агарозы. Этот шаг желательно выполнять на водяной бане, а каждый образец подвешивать и распределять в шахматном порядке. Избегайте попадания пузырьков при размазывании агарозы на предметном стекле, так как воздушные карманы повлияют на миграцию хвостов кометы во время электрофореза (шаг 4.5) и приведут трещины на этапе сушки (шаг 5.3)
  8. Храните предметные стекла при температуре 4 °C в темноте в течение 15-20 минут, чтобы убедиться, что агароза полностью застыла (Рисунок 2A).
  9. Поместите предметные стекла в банки Coplin и погрузите их в буфер для лизиса на 1 час при комнатной температуре.
  10. Промойте предметные стекла один раз холодным буфером TAE и погрузите предметные стекла в холодный буфер TAE на 30 минут при температуре 4 °C.

4. Электрофорез

  1. Установите электрофоретическую камеру на плоскую поверхность и выровняйте систему с помощью четырех ручек выравнивания по краям аппарата. Вставьте холодные пакеты в нижнюю камеру, чтобы раствор оставался холодным во время электрофореза.
  2. Налейте в аппарат примерно ~850 мл холодного 1x TAE буфера.
  3. Снимите предметные стекла с температуры 4 °C и поместите их на лоток для электрофореза в правильной ориентации, чтобы обеспечить миграцию разрушенной ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лоток вмещает десять 2-луночных стекол. Поместите слайды в центр лотка, если вы работаете с меньшим количеством образцов. Если вы работаете с нечетным количеством слайдов, включите в него пустой слайд так, чтобы в каждой лунке помещалось по 2 слайда.
  4. Аккуратно положите прилагаемую накладку на лоток сверху лотка, чтобы закрыть слайды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильной работы аппарата объем буфера TAE не должен быть ниже нижней поверхности накладки и не превышать верхнюю поверхность накладки.
  5. После подключения кабелей установите мощность на 21 В и проведите электрофорез (1 В/см) в течение 40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время электрофореза может потребоваться скорректировать в зависимости от типа клетки, используемой для анализов. Длинные хвосты в необработанных образцах указывают на чрезмерное время работы. И наоборот, короткие хвосты в положительных контрольных образцах могут отражать недостаточное время выполнения.

5. Окрашивание

  1. После завершения электрофореза снять предметные стекла с аппарата и погрузить их в раствор осаждения ДНК на 30 мин при комнатной температуре.
  2. Выбросьте раствор для осаждения ДНК и погрузите предметные стекла в 70% раствор этанола на 30 минут при комнатной температуре.
  3. Выбросьте 70% раствор этанола. Снимите предметные стекла и высушите их в гибридизационной печи при температуре 45 °C в течение 30 минут в темноте (Рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла можно оставить в темном сухом месте на ночь для этапа сушки.
  4. Инкубируйте лунки со 100 мкл 1x раствора SYBR Green в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
  5. Сцедите раствор SYBR Green, наклонив предметные стекла и удалив излишки, аккуратно промокнув край лунки безворсовой салфеткой.
  6. Поместите слайды в ящик и дайте высохнуть в течение 30 минут.
  7. Приступайте к визуализации слайдов.

6. Визуализация и анализы

  1. Настройте микроскоп для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Использовалось 10-кратное увеличение с числовой апертурой 0,45 с временем экспозиции 1/40 с и усилением +6 дБ. Режим захвата монохромного 8-битного изображения был использован с биннингом 2 x 2 и коррекцией черного баланса.
  2. Поместите предметные стекла на предметный столик микроскопа и начните визуализацию с помощью фильтра FITC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала используйте необработанный образец для проверки времени воздействия. Большинство клеток не имеют кометных хвостов, так как ДНК более компактна. Переключитесь на лунку с клетками, обработанными CPT, и получите изображение с тем же временем экспозиции. Хвосты комет с увеличенной длиной будут наблюдаться в этом образце из-за миграции сломанных концов ДНК.
  3. Получение изображений не менее 100 комет на образец, используя одинаковое время экспозиции для трех технических повторений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хвосты комет в конце покровных сдвигов имеют тенденцию мигрировать неравномерно и действовать как выбросы в распределении образца. Большинство комет, захваченных для анализа, присутствуют близко к центру покровного стекла (Рисунок 3).
  4. Экспортируйте изображения и оценивайте кометы вручную (с помощью Image J) или с помощью бесплатного программного обеспечения для оценки комет. Для подсчета очков выбираются кометы, которые индивидуально различимы и полностью содержатся в поле зрения. Перекрывающиеся или частично видимые кометы не рассматриваются для дальнейшего анализа (Рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут оценивать кометы на изображении J с помощью следующего плагина: https://cometbio.org/index.html. Подробная информация о подсчете комет с помощью программного обеспечения CometScore приведена на рисунке 5.
  5. Моменты хвоста графика, полученные в результате анализа, представляют собой графики в виде прямоугольников и графиков с изображением значений 10-90 процентилей. Выполните тесты на нормальность, чтобы определить, следует ли использовать параметрические или непараметрические тесты для статистического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев непараметрические тесты применяются с использованием теста Манна-Уитни при сравнении только двух образцов или теста Краскала-Уоллиса с множественным сравнением Данна при сравнении трех или более образцов.

Результаты

Анализ индукции разрушения реагентами репликационного напряжения
Клетки U2OS обрабатывали ДМСО, 4 мМ гидроксимочевины (HU) или 100 нМ CPT в течение 4 ч и анализировали накопление разрыва с помощью анализа NC (рис. 6A). В то время как CPT индуцирует разрывы во время S-фазы, ?...

Обсуждение

В этом протоколе описывается анализ NC для оценки разрывов ДНК в клетках человека, подвергающихся активной репликации. Протокол относительно прост в исполнении, и исследователи могут легко адаптировать его к условиям высокого pH для щелочных анализов8. Он включает в себя дв?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Dungrawala за их вклад и отзывы. Эта работа финансировалась за счет гранта NIH R35GM137800 по БГ.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSGibco14190144
CamptothecinSelleckchemS1288
Comet LMAgarose (LMA)R&D systems4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System IIR&D systems4250-050-ESIncludes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore softwareTriTekopen-sourced
CometSlideR&D systems4250-050-03
DMEM, high glucoseGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO FisherSciD128-4
Epifluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Fetal Bovine Serum - PremiumBio-TechneS11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T cellsATCCCRL-11268
hTERT-RPE-1 cellsATCCCRL-4000
HydroxyureaMillipore SigmaH8627
PARP inhibitor OlaparibSelleckchemS8096
PowerPac FisherSciFB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture PlateFisherSciFB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)FisherSciS7567
U2OS cellsATCCHTB-96
UVP HB-1000 Hybridization IncubatorFisherSciUVP95003001

Ссылки

  1. Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  4. Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  5. De Lapuente, J., et al. The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives. Front Genet. 6, 180 (2015).
  6. Azqueta, A., et al. Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288 (2020).
  7. Speit, G., Hartmann, A. The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage. Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).
  8. Collins, A., et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols. Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).
  9. Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair. Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).
  10. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).
  11. Cimprich, K. A., Cortez, D. Atr: An essential regulator of genome integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
  12. Cortez, D. Replication-coupled DNA repair. Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).
  13. Strumberg, D., et al. Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).
  14. Pommier, Y. Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond. Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).
  15. Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i. J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).
  16. Bryant, H. E., et al. Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  17. Helleday, T. The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings. Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).
  18. Mcglynn, A. P., et al. The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells. Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).
  19. Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay. PLoS One. 8 (8), e70391 (2013).
  20. Thakar, T., et al. Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling. Nat Commun. 13 (1), 5323 (2022).
  21. Vaitsiankova, A., et al. Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).
  22. Dungrawala, H., et al. Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks. Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).
  23. Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity. Cell Rep. 34 (4), 108669 (2021).
  24. Lemacon, D., et al. Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells. Nat Commun. 8 (1), 860 (2017).
  25. Leung, W., et al. Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms. Cell Rep. 42 (7), 112792 (2023).
  26. Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability. Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).
  27. Mosler, T., et al. R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability. Nat Commun. 12 (1), 7314 (2021).
  28. Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair. Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).
  29. Sestili, P., Cantoni, O. Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission. Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).
  30. Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level. Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).
  31. Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).
  32. Hanada, K., et al. The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks. Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены