中性コメットアッセイによる分裂中のヒト細胞におけるDNA切断の検出

要約

このプロトコルは、DNA複製中に発生するDNA損傷の程度を調査するように設計されています。中立条件下では、DNA切断の誘導を短時間で容易に評価できます。さらに、このプロトコルは、他の細胞タイプやさまざまな複製ストレス試薬にも適応可能です。

要約

DNA複製は、DNAを損傷する可能性のあるさまざまな内因性および外因性のストレッサーによって常に挑戦されています。ゲノム重複中に遭遇するこのような病変は、レプリソームを失速させ、複製フォークを二本鎖切断に変換する可能性があります。修復せずに放置すると、これらの有毒なDNA切断が染色体再配列を引き起こし、ゲノムの不安定性を高め、細胞形質転換の可能性を高める可能性があります。さらに、がん細胞は持続的な複製ストレスを示すため、腫瘍細胞の複製フォークの脆弱性を標的とすることは、化学療法の魅力的な戦略となっています。複製中のDNA切断を研究するための非常に汎用性が高く強力な手法は、コメットアッセイです。このゲル電気泳動技術は、シングルセルレベルでのDNA切断の誘導と修復を確実に検出します。ここでは、研究者が複数の細胞タイプにわたるフォークストール剤を使用してヒト細胞を有糸分裂する際のDNA損傷の程度を測定できるようにするプロトコルが概説されています。これを自動コメットスコアリングと組み合わせることで、迅速な分析が容易になり、DNA切断の誘導研究の信頼性が向上します。

概要

コメットアッセイは、シングルセルレベルでDNA切断を検出するために使用されるゲル電気泳動法です。これは、オープンエンドのDNA切断が電気泳動条件下で移動する一方で、無傷のDNAはほとんど静止したままであるという原理に依存しています。壊れたDNAが移動するのは、切断がスーパーコイル状のDNAの弛緩をもたらし、電気泳動チャンバー内のアノードに向かって徐々に空間的に再配置するためであり、その結果、免疫蛍光法によって観察される彗星のような外観になります^1,2。次に、DNA損傷の程度は、コンパクトなDNAに対して移動した壊れたDNAの量を定量化することによって測定されます。

最も一般的に使用される2つのコメットアッセイ法は、アルカリコメット(AC)アッセイとニュートラルコメット(NC)アッセイです。ACアッセイは高アルカリ性pH溶液を使用して変性条件下で実施され、NCアッセイは中性pHの溶液で実施されます。NCアッセイとACアッセイはどちらも、核内で発生するDNA切断を確実に検出できます。しかし、アルカリ性バージョンは、アルカリに不安定なサイト³の検出にも有利である。どちらのアッセイ形式でも、電気泳動の前にDNAにタンパク質が含まれていないことを確認するために溶解条件を使用する必要があります。

このアッセイは、DNA切断を検出するための簡単な方法であり、細胞DNA損傷を決定するためのいくつかのユニークな利点を提供します。この分析法は比較的セットアップが簡単で、試薬はラボで調製するか、市販のベンダーから購入する必要があります。シングルセル分解能技術として、アッセイに必要な出発物質はほとんど必要ありません。特に、NCアッセイは高感度でブレークを測定でき、細胞あたり50〜10,000個のブレークを検出すると報告されています⁴。この手法の汎用性は、生態毒性学⁵、ヒトバイオモニタリング⁶、遺伝毒性試験⁷など、その幅広いアプリケーションによって実証されています。また、このアッセイは、さまざまな細胞タイプで信頼性を確保し、ハイスループットアッセイ⁸ や特定の^{ゲノム領域での}切断の評価9にも適合させることができます。したがって、このアッセイは、シングルセルレベルでのブレーク形成を調査するための迅速で信頼性の高い手法として機能します。

DNA複製のプロセスは、いくつかの内因性および外因性のストレッ^サー10,11によって絶えず挑戦されている。このような病変によるレプリソームの失速は、DNAの切断を引き起こし、ゲノムの不安定性を高める可能性があります。DNA切断は、DNA修復を容易にするための複製中間体としてもしばしば生じる¹²。さらに、いくつかの化学療法剤は、カンプトテシン(CPT)^13,14,15やPARP阻害剤^16,17など、複製依存性二本鎖切断(DSB)を誘導します。したがって、このアッセイは、DNA損傷の性質を研究し、複製フォークの処理を評価し、DNA損傷剤の治療可能性を調査するための強力な方法論として機能します。新たに合成されたDNAをBrdUで標識するアッセイの適応は、複製関連ストレス表現型18,19,20,21の研究に役立っています。特に、NCアッセイは、フォークタンパク質^{の特性評価22,23}、複製中間体の分析^24,25、およびゲノム維持における転写-複製競合の調査^26,27を含む研究で実証されているように、複製の文脈でDNA切断誘導を研究するための信頼性の高い方法である.ここでは、ヒト細胞での複製中のDNA切断を定量化することを目的としたNCアッセイプロトコルの概要を説明します。このプロトコルは、分裂しているヒト細胞の多種多様な複製ストレス関連損傷の評価に関心のある研究者によって容易に実施できます。

プロトコル

このプロトコル(図1)は、主に接着性U2OSがん細胞株を利用しますが、組織培養で増殖したさまざまな接着細胞および浮遊細胞に適応できます。この試験で使用した溶液とバッファーを 表1に示します。使用した試薬や機器は 、材料表に記載されています。

1. 資料の準備

1. 実験の日の前に、付属のボトルに低融点アガロース(PBS中の1%低融点アガロース)を入れたボトルを温水浴に5〜10分間入れて、アガロースが完全に溶けたことを確認します。
   注意: 電子レンジでボトルを加熱しないでください。
2. 溶かしたら、必要に応じて100 μLのアガロースを1.5 mLの遠心チューブにすばやく分注し、チューブを4°Cで保存します。 固化したアガロースは、4°Cで最大1年間保存できます。
3. 実験当日は、必要な数の遠心分離チューブを4°Cの貯蔵庫から取り出します。チューブを42°Cのヒートブロックまたはウォーターバスに入れて、アガロースを溶かします。
   注:細胞を回収する前にチューブを42°Cに置き、アガロースが完全に溶けて再懸濁することを確認します(ステップ3.7)。
4. 実験当日に新鮮な溶解バッファーとTAEバッファーを調製し、使用する準備ができるまでそれぞれ室温と4°Cで保存してください。さらに、15 mLのコニカルチューブに1x PBSを分注し、冷蔵庫に置いて再懸濁ステップ(ステップ3.5)で使用します。
5. 2ウェル彗星スライドのつや消し端にサンプル識別をマークし、使用する準備ができるまで室温で保管します。

2. サンプルの調製

1. 実験の日の前に、細胞を6ウェル皿に播種し、5%_CO2を含む37°Cで一晩培養します。U2OS細胞については、各サンプルに対して約2〜3 x 10⁵ 個の細胞を播種しました。
   注:セル番号は、分析に使用するセルタイプによっては調整が必要な場合があります。
2. 実験当日は、実験デザインに従った条件で細胞を治療してください。複製依存性切断誘導を実証するためのポジティブコントロールとして、細胞を1μM CPTで1時間処理する。CPTは、複製依存的に二本鎖切断を誘導するトポイソメラーゼ-1阻害剤である¹⁴。

3. 細胞の再懸濁と溶解

1. 細胞培養培地を吸引し、1x PBSで2回すすぎます。
2. 各ウェルに300 μLのトリプシンを加えます。皿を組織培養インキュベーターで2〜3分間インキュベートします。
   注:トリプシンでの長時間のインキュベーションは、コメット分析中に偽の結果を生成する可能性があります。
3. 各ウェルに700 μLの細胞培養培地を加えます。穏やかに再懸濁し、サンプルを1.5 mLの遠心分離チューブに移します。
   注:このステップで細胞をカウントすることは、ステップ3.6で適切な細胞密度を得るために推奨され、分析中に尾部が重なる頻度を減らします。
4. 細胞懸濁液を2400 x gで室温で5分間遠心分離します。
5. 培地を吸引し、細胞を1 mLの冷冷1x PBSに再懸濁します。
6. ステップ3.4とステップ3.5を2回繰り返し、細胞密度2×10⁵ 細胞/mLで冷温1x PBSに細胞を再懸濁します。
   注:このステップで細胞生存率を評価することは、十分な数の生存細胞が存在することを確認するために推奨されます。少なくとも90%の生存率が推奨されます。
7. 10 μLの細胞懸濁液を溶融アガロースの100 μLアリコートに再懸濁し、同じピペットチップを使用して穏やかに混合し、混合物をスライドの1ウェルに均等に広げます。必要に応じて、すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返します。
   注:アガロースが固まるのを防ぐために、42°Cのウォーターバスからすべてのアリコートを一度に取り除かないでください。このステップは、好ましくはウォーターバスによって実行されるべきであり、各サンプルは再懸濁され、ずらして広げられます。エアポケットは電気泳動中の彗星尾部の移動に影響を与え(ステップ4.5)、乾燥ステップ(ステップ5.3)で亀裂が発生するため、スライド上にアガロースを広げるときに気泡を導入しないでください
8. スライドを4°Cの暗所で15〜20分間保存し、アガロースが完全に固まったことを確認します(図2A)。
9. スライドをCoplinジャーに入れ、スライドを溶解バッファーに室温で1時間浸します。
10. スライドを冷たいTAEバッファーで一度すすぎ、スライドを冷たいTAEバッファーに4°Cで30分間浸します。

4. 電気泳動

1. 電気泳動チャンバーを平らな面に設置し、装置の端にある4つのレベリングノブを使用してシステムを水平にします。電気泳動中に溶液を冷たく保つために、下部チャンバーにコールドパックを挿入します。
2. 約 ~850 mL の冷たい 1x TAE バッファーを装置に注ぎます。
3. スライドを4°Cから取り出し、電気泳動トレイに適切な向きで置き、壊れたDNAの移行を可能にします。
   注意: トレイには 2 ウェルスライドが 10 枚収納できます。サンプル数が少ない場合は、スライドをトレイの中央に置きます。奇数のスライドで作業する場合は、各ウェルが2枚のスライドを収容できるように空白のスライドを含めます。
4. 付属のスライドトレイオーバーレイをトレイの上にそっと置き、スライドを覆います。
   注意: 装置を適切に動作させるには、TAEバッファーの体積をオーバーレイの底面より低くしてはならず、オーバーレイの上面を超えないようにする必要があります。
5. ケーブルを接続した後、電源を21Vに設定し、電気泳動(1V / cm)を40分間行います。
   注:電気泳動時間は、分析に使用する細胞の種類によっては調整が必要な場合があります。未処理のサンプルのロングテールは、実行時間が長すぎることを示しています。逆に、ポジティブコントロールサンプルの短いテールは、不十分なランタイムを反映している可能性があります。

5. 染色

1. 電気泳動終了後、スライドを装置から取り出し、DNA沈殿液に室温で30分間浸漬します。
2. DNA沈殿溶液を廃棄し、スライドを70%エタノール溶液に室温で30分間浸します。
3. 70%エタノール溶液を廃棄します。スライドを取り出し、ハイブリダイゼーションオーブン(45°C)で暗所で30分間乾燥させます(図2B)。
   注:スライドは、乾燥ステップのために暗く乾燥した場所に一晩置いておくことができます。
4. ウェルを100 μLの1x SYBR Green溶液と室温の暗所で30分間インキュベートします。
5. スライドを傾けてSYBR Green溶液をデカントし、糸くずの出ないワイプでウェルの端を軽くたたいて余分なものを取り除きます。
6. スライドを引き出しに入れ、30分間乾燥させます。
7. スライドのイメージングを進めます。

6. イメージングと解析

1. イメージングのために顕微鏡をセットアップします。
   注:すべての画像は落射蛍光顕微鏡を使用して取得されました。10倍の倍率と0.45の開口数を使用し、露光時間は1/40秒、ゲインは+6dBでした。モノクロ8bitのキャプチャモードは、2×2ビニングとブラックバランス補正で活用しました。
2. スライドを顕微鏡ステージに置き、FITCフィルターを使用してイメージングを開始します。
   注:未処理のファイルを使用して、最初に曝露時間をテストします。ほとんどの細胞は、DNAがよりコンパクトであるため、彗星の尾を示さない。CPT処理した細胞をウェルに切り替え、同じ露光時間で画像化します。このサンプルでは、壊れたDNA末端の移動により、長さが長くなった彗星の尾が観察されます。
3. サンプルごとに少なくとも 100 個の彗星の画像を取得し、3 回のテクニカルレプリケートで同じ露光時間を使用します。
   注:カバースリップの端にある彗星の尾部は、不均一に移動し、サンプル分布の外れ値として機能する傾向があります。解析のために捕獲された彗星のほとんどは、カバーガラスの中心近くに存在します(図3)。
4. 画像をエクスポートし、彗星を手動で(Image Jを使用)または無料で入手できる彗星スコアリングソフトウェアを使用して、彗星をスコアリングします。個々に区別可能で、視野に完全に含まれている彗星がスコアリングのために選択されます。重なり合っている彗星や部分的に見える彗星は、さらなる分析では考慮されません(図4)。
   注:ユーザーは、次のプラグインを使用して画像Jに彗星をスコアリングできます:https://cometbio.org/index.html。CometScoreソフトウェアを使用して彗星をスコアリングするための詳細は、図5に含まれています。
5. 解析から取得したテールモーメントを、10-90パーセンタイル値を示す箱ひげプロットとしてプロットします。正規性検定を実行して、パラメトリック検定とノンパラメトリック検定のどちらを統計分析に使用すべきかを判断します。
   注:ほとんどの場合、ノンパラメトリック検定は、2つのサンプルのみを比較する場合はMann-Whitney検定を使用して、3つ以上のサンプルを比較する場合はDunnの多重比較を使用したKruskal-Wallis検定を使用して適用されます。

結果

レプリケーションストレス試薬によるブレークインダクションの解析
U2OS細胞をDMSO、4のmMヒドロキシ尿素(HU)、または100nMのCPTで4時間処理し、NCアッセイによりブレーク蓄積について分析しました(図6A)。CPTはトポイソメラーゼ-1を阻害することによりS期に切断を誘導するが¹³、HUによって誘発されるヌクレオチドプールの枯渇は、徐々にDSB...

ディスカッション

このプロトコルは、活発な複製を受けているヒト細胞のDNA切断を評価するためのNCアッセイの概要を示しています。このプロトコールは比較的簡単に実施でき、研究者は^{アルカリ性分析}のための高pH条件に容易に適応させることができます8。これには、ステップ 3.7 と 4.5 で説明されている 2 つの重要なステップが含まれています。ステップ3.7では、分析中に彗星が重ならな?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Gibco	14190144
Camptothecin	Selleckchem	S1288
Comet LMAgarose (LMA)	R&D systems	4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System II	R&D systems	4250-050-ES	Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore software	TriTek		open-sourced
CometSlide	R&D systems	4250-050-03
DMEM, high glucose	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	FisherSci	D128-4
Epifluorescence microscope	Keyence	BZ-X810
Fetal Bovine Serum - Premium	Bio-Techne	S11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
GraphPad Prism 10.0	GraphPad
HEK293T cells	ATCC	CRL-11268
hTERT-RPE-1 cells	ATCC	CRL-4000
Hydroxyurea	Millipore Sigma	H8627
PARP inhibitor Olaparib	Selleckchem	S8096
PowerPac	FisherSci	FB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate	FisherSci	FB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)	FisherSci	S7567
U2OS cells	ATCC	HTB-96
UVP HB-1000 Hybridization Incubator	FisherSci	UVP95003001