זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

Summary

פרוטוקול זה נועד לחקור את מידת הנזק לדנ"א המתרחש במהלך שכפול DNA. בתנאים ניטרליים, ניתן להעריך בקלות את השראת הפסקות הדנ"א תוך פרק זמן קצר. בנוסף, הפרוטוקול ניתן להתאמה לסוגי תאים אחרים ולריאגנטים שונים של עקת שכפול.

Abstract

שכפול דנ"א מאותגר כל הזמן על ידי מגוון רחב של גורמי עקה אנדוגניים ואקסוגניים שיכולים לפגוע בדנ"א. נגעים כאלה שנתקלים בהם במהלך שכפול הגנום יכולים לעכב את הרפליזומים ולהמיר מזלגות שכפול לשברים דו-גדיליים. אם לא יתוקנו, שברי דנ"א רעילים אלה עלולים לגרום לסידור מחדש של הכרומוזומליים, מה שמוביל לחוסר יציבות גנומי מוגבר ולסבירות מוגברת לשינוי תאי. בנוסף, תאים סרטניים מפגינים עקה מתמשכת של שכפול, מה שהופך את מיקוד נקודות התורפה של מזלג השכפול בתאי הגידול לאסטרטגיה אטרקטיבית לכימותרפיה. טכניקה רב-תכליתית ורבת עוצמה לחקר הפסקות דנ"א במהלך שכפול היא בדיקת השביט. טכניקת אלקטרופורזה ג'ל זו מזהה באופן אמין את ההשראה והתיקון של שברי DNA ברמת התא הבודד. כאן, מתואר פרוטוקול המאפשר לחוקרים למדוד את מידת הנזק לדנ"א בחלוקה מיטוטית של תאים אנושיים באמצעות חומרים מעכבי מזלג על פני סוגי תאים מרובים. צימוד זה עם ניקוד שביטים אוטומטי מאפשר ניתוח מהיר ומשפר את האמינות בחקר אינדוקציה של הפסקות DNA.

Introduction

בדיקת השביט היא שיטת אלקטרופורזה בג'ל המשמשת לזיהוי שברי DNA ברמת התא הבודד. הוא מסתמך על העיקרון שהפסקות דנ"א פתוחות נודדות בתנאים אלקטרופורטיים, בעוד שדנ"א שלם נשאר סטטי במידה רבה. דנ"א שבור נודד מכיוון שהפסקות גורמות להרפיה של דנ"א מפותל-על, מה שגורם למיקום המרחבי ההדרגתי שלו לכיוון האנודה בתא האלקטרופורטי, מה שגורם למראה דמוי שביט שנצפה על ידי אימונופלואורסנציה ^1,2. מידת הנזק לדנ"א נמדדת לאחר מכן על ידי כימות כמות הדנ"א השבור שנדד ביחס לדנ"א הקומפקטי.

שתי שיטות בדיקת השביט הנפוצות ביותר הן בדיקת השביט הבסיסי (AC) ובדיקת השביט הנייטרלי (NC). בדיקת AC מבוצעת בתנאי דנטורינג באמצעות תמיסת pH אלקליין גבוהה, ואילו בדיקת NC מתבצעת בתמיסה עם pH ניטרלי. בדיקות NC ו- AC יכולות לזהות באופן אמין הפסקות DNA המתרחשות בגרעין. עם זאת, הגרסה אלקליין הוא גם יתרון לאיתור אתרים אלקליים^{labile 3}. שני הפורמטים של הבדיקה דורשים שימוש בתנאי ליזה כדי להבטיח שהדנ"א נקי מחלבונים לפני אלקטרופורזה.

בדיקה זו היא שיטה פשוטה לאיתור שברי דנ"א ומציעה מספר יתרונות ייחודיים לקביעת נזק לדנ"א תאי. השיטה קלה יחסית להתקנה ודורשת ריאגנטים שניתן להכין במעבדה או לרכוש מספקים מסחריים. כטכניקת רזולוציה של תא יחיד, הבדיקה דורשת מעט מאוד חומר התחלתי. יש לציין כי בדיקת NC יכולה למדוד הפסקות ברגישות גבוהה, המדווחת כמזהה בין 50 ל -10,000 הפסקות לכל תא⁴. הרבגוניות של טכניקה זו מודגמת על ידי מגוון רחב של יישומים, כולל אקוטוקסיקולוגיה⁵, ניטור ביולוגי אנושי⁶, ומחקרי גנוטוקסיות⁷. ניתן גם להשתמש בבדיקה באופן אמין בין סוגי תאים שונים ולהתאים אותה למבחני תפוקה גבוהה⁸ ולהערכת הפסקות באזורים גנומיים ספציפיים⁹. לפיכך, בדיקה זו משמשת כטכניקה מהירה ואמינה לחקר היווצרות הפסקה ברמת התא הבודד.

תהליך שכפול הדנ"א מאותגר כל הזמן על ידי מספר גורמי עקה אנדוגניים ואקסוגניים^10,11. עיכוב של replisomes עקב נגעים כאלה יכול לגרום לשברים DNA ולגרום חוסר יציבות גנום מוגברת. הפסקות דנ"א מתעוררות לעתים קרובות גם כמתווכי שכפול כדי להקל על תיקון דנ"א¹². בנוסף, מספר תרופות כימותרפיות גורמות לשברים דו-גדיליים תלויי שכפול (DSBs), כגון קמפטוטצין (CPT) 13,14,15 ומעכבי PARP ^16,17. לפיכך, בדיקה זו משמשת מתודולוגיה רבת עוצמה לחקר טבעם של נגעי DNA, הערכת העיבוד של מזלגות שכפול, ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של סוכנים מזיקים ל- DNA. התאמות של הבדיקה הכוללות תיוג DNA מסונתז חדש עם BrdU היו שימושיות לחקר פנוטיפים מתח הקשורים לשכפול 18,19,20,21. יש לציין כי בדיקת NC היא שיטה אמינה לחקר השראת שבירת DNA בהקשר של שכפול, כפי שהודגם במחקרים הכוללים אפיון חלבוני מזלג ^22,23, ניתוח מתווכי שכפול^24,25, וחקירת קונפליקטים של שעתוק ושכפול בתחזוקת גנום^26,27. כאן, אנו מתארים פרוטוקול בדיקת NC במטרה לכמת הפסקות DNA במהלך שכפול בתאים אנושיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות על ידי חוקרים המעוניינים להעריך נזק הקשור לשכפול מתח במגוון רחב של תאים אנושיים מתחלקים.

Protocol

פרוטוקול זה (איור 1) משתמש בעיקר בקווי תאים סרטניים נצמדים של U2OS, אולם הוא ניתן להתאמה למגוון רחב של תאים נצמדים ותרחיפים הגדלים בתרבית רקמות. הפתרונות והמאגרים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1. הריאגנטים והציוד בהם נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים

1. לפני יום הניסוי, הניחו את הבקבוק המסופק עם אגרוז נמס נמוך (1% אגרוז נמס נמוך ב- PBS) באמבט מים חמים למשך 5-10 דקות כדי להבטיח שהאגרוז נמס לחלוטין.
   הערה: אין לחמם את הבקבוק במיקרוגל.
2. לאחר המסה, במהירות aliquot 100 μL של agarose כדי 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה לפי הצורך ולאחסן את הצינורות ב 4 ° C. האגרוז המוצק ניתן לאחסן ב 4 °C (75 °F) למשך עד שנה.
3. ביום הניסוי, הסר את המספר הנדרש של צינורות צנטריפוגות מהאחסון של 4 מעלות צלזיוס. להמיס את agarose על ידי הצבת צינורות בלוק חום או אמבט מים ב 42 °C (75 °F).
   הערה: הניחו את הצינורות בטמפרטורה של 42°C לפני קצירת התאים כדי להבטיח שהאגרוז נמס לחלוטין לצורך השעיה (שלב 3.7).
4. הכינו חיץ ליזיס טרי וחיץ TAE ביום הניסוי ואחסנו אותם בטמפרטורת החדר וב-4°C, בהתאמה, עד שיהיו מוכנים לשימוש. בנוסף, aliquot 1x PBS ב 15 מ"ל צינור חרוטי ומניחים אותו במקרר לשימוש בשלב ההשעיה (שלב 3.5).
5. סמנו את זיהויי הדגימות בקצה החלבי של מגלשות השביט הדו-באריות ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר עד שיהיו מוכנות לשימוש.

2. הכנת דגימות

1. לפני יום הניסוי, זרעו את התאים בצלוחית של 6 בארות ותרבו לילה בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂. עבור תאי U2OS, כ 2-3 x 10^{5 תאים} נזרעו עבור כל דגימה.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את מספרי התאים בהתאם לסוג התא המשמש לניתוחים.
2. ביום הניסוי, יש לטפל בתאים בתנאים בהתאם לתכנון הניסוי. כבקרה חיובית להדגמת השראת שבירה תלוית שכפול, יש לטפל בתאים עם CPT של 1 מיקרומטר למשך שעה אחת. CPT הוא מעכב טופואיזומראז-1 הגורם לשברים דו-גדיליים באופן תלוי שכפול¹⁴.

3. השעיית תאים וליזיס

1. יש לשאוף לתרבית תאים ולשטוף פעמיים עם PBS אחד.
2. הוסף 300 μL של טריפסין לכל באר. דוגרים על המנה באינקובטור תרביות רקמה למשך 2-3 דקות.
   הערה: דגירה ממושכת בטריפסין יכולה לייצר תוצאות מזויפות במהלך ניתוחי שביטים.
3. הוסף 700 μL של מדיה תרבית תאים לכל באר. השהה בעדינות והעבר את הדגימות לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
   הערה: ספירת תאים בשלב זה מומלצת כדי להשיג את צפיפות התאים המתאימה בשלב 3.6 כדי להפחית את התדירות של זנבות חופפים במהלך הניתוח.
4. צנטריפוגה את מתלה התא ב 2400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשאוף את התקשורת להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של קר 1x PBS.
6. חזור על שלב 3.4 ושלב 3.5 פעמיים והשהה מחדש את התאים ב- PBS 1x קר בצפיפות תאים של 2 x 10⁵ תאים למ"ל.
   הערה: הערכת כדאיות התא בשלב זה מומלצת כדי להבטיח נוכחות מספקת של תאים בני קיימא. מומלץ לפחות 90% כדאיות.
7. משעים מחדש 10 μL של תרחיף התא ב 100 μL aliquot של אגרוז מומס, ובאמצעות אותו קצה פיפטה, מערבבים בעדינות ומפזרים את התערובת באופן שווה לתוך באר אחת של המגלשה. חזור על שלב זה עבור כל הדגימות לפי הצורך.
   הערה: הימנע מהסרת כל aliquots מ 42 מעלות צלזיוס אמבט מים בבת אחת כדי למנוע agarose מלהתמצק. שלב זה צריך להתבצע על ידי אמבט המים, וכל דגימה הוא resuspended ולהפיץ באופן מדורג. הימנעו מהחדרת בועות בעת פיזור האגרוז על המגלשה מכיוון שכיסי האוויר ישפיעו על נדידת זנבות השביט במהלך אלקטרופורזה (שלב 4.5) ויכניסו סדקים בשלב הייבוש (שלב 5.3)
8. אחסנו את המגלשות בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך 15-20 דקות כדי להבטיח שהאגרוז התמצק לחלוטין (איור 2A).
9. מניחים את המגלשות בצנצנות קופלין וטובלים את המגלשות בחיץ ליזיס למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
10. שטפו את המגלשות פעם אחת עם מאגר TAE קר וטבלו את המגלשות במאגר TAE קר למשך 30 דקות ב-4°C.

4. אלקטרופורזה

1. הגדר את התא האלקטרופורטי על משטח שטוח ויישר את המערכת באמצעות ארבע ידיות הפילוס בשולי המנגנון. הכנס חבילות קרות בתא התחתון כדי לשמור על התמיסה קרה במהלך אלקטרופורזה.
2. יוצקים כ~ 850 מ"ל של חיץ קר 1x TAE לתוך המנגנון.
3. הסר את השקופיות מ 4 ° C והנח אותם על מגש אלקטרופורזה בכיוון הנכון כדי לאפשר נדידה של DNA שבור.
   הערה: המגש מכיל עשר שקופיות של 2 בארות. מקם את השקופיות במרכז המגש אם הן עובדות עם מספר קטן יותר של דגימות. אם אתה עובד עם מספר אי-זוגי של שקופיות, כלול שקופית ריקה כך שכל באר מכילה 2 שקופיות.
4. הנח בעדינות את כיסוי מגש השקופיות שסופק על גבי המגש כדי לכסות את המגשיות.
   הערה: לצורך פעולה תקינה של המנגנון, נפח מאגר TAE לא צריך להיות נמוך מהמשטח התחתון של שכבת העל ולא יעלה על המשטח העליון של שכבת העל.
5. לאחר חיבור הכבלים, הגדר את המתח על 21 V ובצע אלקטרופורזה (1 V / cm) במשך 40 דקות.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמן האלקטרופורזה בהתאם לסוג התא המשמש לניתוחים. זנבות ארוכים בדגימות לא מטופלות מצביעים על זמן ריצה מוגזם. לעומת זאת, זנבות קצרים בדגימות בקרה חיוביות עשויים לשקף זמן ריצה לא מספיק.

5. צביעה

1. לאחר השלמת אלקטרופורזה, להסיר את שקופיות מן המכשיר לטבול אותם בתמיסת משקעים DNA במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. השליכו את תמיסת משקעי הדנ"א וטבלו את המגלשות בתמיסת אתנול 70% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. השליכו את תמיסת האתנול 70%. הסירו את המגלשות וייבשו אותן בתנור הכלאה בטמפרטורה של 45°C למשך 30 דקות בחושך (איור 2B).
   הערה: ניתן להשאיר את המגלשות במקום חשוך ויבש למשך הלילה לצורך שלב הייבוש.
4. לדגור על הבארות עם 100 μL של 1x SYBR Green פתרון במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
5. דקרו את תמיסת SYBR Green על ידי הטיית המגלשות והסרת העודפים על ידי טפטוף עדין של קצה הבאר עם מגבון ללא סיבים.
6. מניחים את המגלשות במגירה ומניחים להן להתייבש למשך 30 דקות.
7. המשך בהדמיה של השקפים.

6. הדמיה וניתוחים

1. הגדר את המיקרוסקופ למטרות הדמיה.
   הערה: כל התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. נעשה שימוש בהגדלה של פי 10 עם צמצם מספרי של 0.45 עם זמן חשיפה של 1/40 שניות ורווח של +6dB. מצב הלכידה של 8bit מונוכרום נוצל עם 2 x 2 binning ותיקון איזון שחור.
2. הניחו את השקופיות על במת המיקרוסקופ והתחילו בהדמיה באמצעות מסנן FITC.
   הערה: השתמש תחילה בדגימה שלא טופלה כדי לבדוק את זמן החשיפה. רוב התאים אינם מציגים זנבות שביט מכיוון שהדנ"א קומפקטי יותר. עברו לבאר עם תאים שטופלו ב-CPT ותמונה באותו זמן חשיפה. זנבות שביט בעלי אורך מוגבר ייצפו בדגימה זו עקב נדידת קצוות DNA שבורים.
3. קבל תמונות עבור לפחות 100 שביטים בכל דגימה באמצעות אותו זמן חשיפה על פני שלושה עותקים משוכפלים טכניים.
   הערה: זנבות שביט בקצה הכיסויים נוטים לנדוד באופן לא אחיד ולפעול כחריגים בהתפלגות הדגימה. רוב כוכבי השביט שנלכדו לצורך ניתוח נמצאים קרוב למרכז הכיסוי (איור 3).
4. ייצא תמונות וניקוד את כוכבי השביט באופן ידני (באמצעות תמונה J) או באמצעות תוכנת ניקוד שביטים הזמינה באופן חופשי. שביטים הניתנים להבחנה בנפרד ומוכלים במלואם בשדה הראייה נבחרים להבקעה. שביטים חופפים או נראים חלקית אינם נחשבים לניתוחים נוספים (איור 4).
   הערה: משתמשים יכולים להבקיע כוכבי שביט בתמונה J באמצעות התוסף הבא: https://cometbio.org/index.html. פרטים על ניקוד שביטים באמצעות תוכנת CometScore כלולים באיור 5.
5. רגעי זנב העלילה הנרכשים מהניתוחים כעלילות קופסה ושפם המתארות ערכי אחוזון 10-90. בצע בדיקות תקינות כדי לקבוע אם יש להשתמש בבדיקות פרמטריות או לא פרמטריות לניתוחים סטטיסטיים.
   הערה: ברוב המקרים, בדיקות לא פרמטריות מיושמות באמצעות מבחן מאן-ויטני אם משווים שתי דגימות בלבד או מבחן קרוסקל-וואליס עם השוואות מרובות של דאן אם משווים שלוש דגימות או יותר.

תוצאות

ניתוח של אינדוקציה הפסקה על ידי ריאגנטים מתח שכפול
תאי U2OS טופלו ב-DMSO, 4 של mM hydroxyurea (HU), או 100 ננומטר של CPT במשך 4 שעות, ונותחו להצטברות הפסקה על-ידי בדיקת NC (איור 6A). בעוד CPT גורם להפסקות במהלך שלב S על ידי חסימת טופואיזומראז-1¹³, דלדול המושרה על ידי HU של בריכו?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר בדיקת NC להערכת הפסקות DNA בתאים אנושיים שעברו שכפול פעיל. הפרוטוקול פשוט יחסית לביצוע, וחוקרים יכולים להתאים אותו בקלות לתנאי pH גבוהים עבור אנליזות אלקליין⁸. הוא כולל שני שלבים קריטיים, כמתואר בשלבים 3.7 ו-4.5. בשלב 3.7, חיוני להפיץ את האגרוז המומס עם תאים באופן אחיד ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Gibco	14190144
Camptothecin	Selleckchem	S1288
Comet LMAgarose (LMA)	R&D systems	4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System II	R&D systems	4250-050-ES	Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore software	TriTek		open-sourced
CometSlide	R&D systems	4250-050-03
DMEM, high glucose	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	FisherSci	D128-4
Epifluorescence microscope	Keyence	BZ-X810
Fetal Bovine Serum - Premium	Bio-Techne	S11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
GraphPad Prism 10.0	GraphPad
HEK293T cells	ATCC	CRL-11268
hTERT-RPE-1 cells	ATCC	CRL-4000
Hydroxyurea	Millipore Sigma	H8627
PARP inhibitor Olaparib	Selleckchem	S8096
PowerPac	FisherSci	FB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate	FisherSci	FB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)	FisherSci	S7567
U2OS cells	ATCC	HTB-96
UVP HB-1000 Hybridization Incubator	FisherSci	UVP95003001