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요약

이 프로토콜은 DNA 복제 중에 발생하는 DNA 손상 정도를 조사하도록 설계되었습니다. 중성 조건에서 DNA 절단의 유도는 짧은 시간 내에 쉽게 평가할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 다양한 복제 스트레스 시약에 적용할 수 있습니다.

초록

DNA 복제는 DNA를 손상시킬 수 있는 다양한 내인성 및 외인성 스트레스 요인에 의해 끊임없이 도전을 받고 있습니다. 게놈 복제 중에 발생하는 이러한 병변은 replisomes를 지연시키고 복제 포크를 이중 가닥 절단으로 변환할 수 있습니다. 이러한 독성 DNA 절단을 복구하지 않고 방치하면 염색체 재배열을 유발하여 게놈 불안정성을 높이고 세포 변형 가능성을 높일 수 있습니다. 또한 암세포는 지속적인 복제 스트레스를 나타내기 때문에 종양 세포의 복제 포크 취약성을 표적으로 삼는 것은 화학 요법을 위한 매력적인 전략이 됩니다. 복제 중 DNA 파괴를 연구하는 매우 다재다능하고 강력한 기술은 혜성 분석입니다. 이 겔 전기영동 기술은 단일 세포 수준에서 DNA 파괴의 유도 및 복구를 안정적으로 감지합니다. 여기에는 연구자가 여러 세포 유형에 걸쳐 fork-stalling agents를 사용하여 유사분열 인간 세포에서 DNA 손상 정도를 측정할 수 있도록 하는 프로토콜이 요약되어 있습니다. 이를 자동화된 혜성 채점화와 결합하면 신속한 분석이 용이해지고 DNA 절단 유도 연구의 신뢰성이 향상됩니다.

서문

혜성 분석은 단일 세포 수준에서 DNA 절단을 감지하는 데 사용되는 겔 전기 영동 방법입니다. 이는 개방형 DNA 절단이 전기영동 조건에서 이동하는 반면 온전한 DNA는 대체로 정적인 상태로 유지된다는 원리에 의존합니다. 파손된 DNA는 절단으로 인해 슈퍼코일 DNA가 이완되어 전기영동 챔버의 양극을 향해 점진적인 공간 재배치를 일으켜 면역형광 1,2에 의해 관찰된 혜성과 같은 모습을 나타내기 때문에 이동합니다. 그런 다음 컴팩트 DNA에 비해 이동한 부서진 DNA의 양을 정량화하여 DNA 손상 정도를 측정합니다.

가장 일반적으로 사용되는 두 가지 혜성 분석 방법은 알칼리 혜성(AC) 분석과 중성 혜성(NC) 분석입니다. AC 분석은 고알칼리성 pH 용액을 사용하여 변성 조건에서 수행되는 반면, NC 분석은 중성 pH의 용액에서 수행됩니다. NC 및 AC 어세이 모두 핵에서 발생하는 DNA 절단을 안정적으로 검출할 수 있습니다. 그러나, 알칼리 버전은 또한 알칼리-불안정한 부위를 검출하는 데 유리하다3. 두 가지 유형의 분석 모두 전기영동 전에 DNA에 단백질이 없는지 확인하기 위해 용해 조건을 사용해야 합니다.

이 분석은 DNA 절단을 검출하는 간단한 방법이며 세포 DNA 손상을 측정하기 위한 몇 가지 고유한 이점을 제공합니다. 이 방법은 설정이 비교적 쉬우며 실험실에서 준비하거나 상업 공급업체에서 구입할 수 있는 시약이 필요합니다. 단일 세포 분리능 기법인 이 분석에는 시작 물질이 거의 필요하지 않습니다. 특히, NC 분석은 높은 감도로 파손을 측정할 수 있으며, 세포당 50개에서 10,000개 사이의 파손을 감지하는 것으로 보고되었다4. 이 기법의 다양성은 생태독성학(ecotoxicology)5, 인간 생물모니터링(human biomonitoring)6 및 유전독성 연구(genotoxicity studies)7를 포함한 광범위한 응용 분야에 의해 입증되었다. 이 분석은 또한 다양한 세포 유형에 걸쳐 신뢰성 있게 사용될 수 있으며, 고처리량 분석8 및 특정 게놈 영역9에서의 절단 평가에 적합할 수 있습니다. 따라서 이 분석은 단일 세포 수준에서 파괴 형성을 조사하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 기법 역할을 합니다.

DNA 복제 과정은 여러 내인성 및 외인성 스트레스 요인에 의해 끊임없이 도전을 받는다10,11. 이러한 병변으로 인한 레플리솜의 지연은 DNA 파괴를 유발하고 게놈 불안정성을 증가시킬 수 있습니다. DNA 절단은 또한 DNA 복구를 용이하게 하기 위한 복제 중간체로서 종종 발생한다12. 또한, 여러 화학요법제는 캄프토테신(camptothecin, CPT)13,14,15 및 PARP 억제제(16,17)와 같은 복제 의존성 이중가닥 절단(double-strand break, DSB)을 유도한다. 따라서 이 분석은 DNA 병변의 특성을 연구하고, 복제 포크의 처리를 평가하고, DNA 손상 물질의 치료 가능성을 조사하는 강력한 방법론 역할을 합니다. 새로 합성된 DNA를 BrdU로 라벨링하는 것과 관련된 분석의 적응은 복제 관련 스트레스 표현형 18,19,20,21을 연구하는 데 유용했습니다. 특히, NC 분석은 포크 단백질22,23의 특성 분석, 복제 중간체 분석 24,25 및 게놈 유지26,27에서 전사-복제 충돌 조사와 관련된 연구에서 입증된 바와 같이 복제의 맥락에서 DNA 절단 유도를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다 . 여기에서는 인간 세포에서 복제 중 DNA 절단을 정량화하는 것을 목표로 하는 NC 분석 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 분열하는 인간 세포에서 복제 스트레스 관련 손상을 평가하는 데 관심이 있는 연구자가 쉽게 구현할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜(그림 1)은 주로 부착 U2OS 암 세포주를 활용하지만 조직 배양에서 성장한 다양한 부착 및 부유 세포에 적용할 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 용액과 완충액은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 재료 준비

  1. 실험일 전에 제공된 저용융 아가로스(PBS에서 1% 저용융 아가로스)가 담긴 병을 온수 욕조에 5-10분 동안 넣어 아가로스가 완전히 녹았는지 확인합니다.
    알림: 병을 전자레인지에 데우지 마십시오.
  2. 일단 녹으면 필요에 따라 100μL의 아가로스를 1.5mL 원심분리기 튜브로 빠르게 분주하고 튜브를 4°C에서 보관합니다. 응고된 아가로스는 4°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 실험 당일에는 4°C 보관에서 필요한 수의 원심분리기 튜브를 제거합니다. 튜브를 42°C의 열 블록 또는 수조에 넣어 아가로스를 녹입니다.
    참고: 세포를 수확하기 전에 튜브를 42°C에 두어 아가로스가 재부유를 위해 완전히 녹았는지 확인합니다(3.7단계).
  4. 실험 당일에 새로운 용해 완충액과 TAE 완충액을 준비하여 사용할 준비가 될 때까지 각각 실온과 4°C에서 보관합니다. 또한 15mL 코니컬 튜브에 1x PBS를 분취하고 냉장고에 넣어 재현탁 단계(단계 3.5)에 사용합니다.
  5. 2-well comet slides의 반투명 끝에 샘플 식별을 표시하고 사용할 준비가 될 때까지 실온에서 보관합니다.

2. 샘플 준비

  1. 실험일 전에 6웰 접시에 세포를 파종하고 5%CO2로 37°C에서 밤새 배양합니다. U2OS 세포의 경우, 각 샘플에 대해 약 2-3 x 105 세포를 파종했습니다.
    참고: 분석에 사용되는 셀 유형에 따라 셀 번호를 조정해야 할 수 있습니다.
  2. 실험 당일에는 실험 설계에 따른 조건으로 세포를 처리합니다. 복제 의존적 파괴 유도를 입증하기 위한 양성 대조군으로, 1시간 동안 1μM CPT로 세포를 처리합니다. CPT는 복제 의존적 방식으로 이중 가닥 절단을 유도하는 토포이소머라제-1 억제제입니다14.

3. 세포 재현탁 및 용해

  1. 세포 배양 배지를 흡입하고 1x PBS로 두 번 헹굽니다.
  2. 각 웰에 300μL의 트립신을 추가합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 2-3분 동안 접시를 배양합니다.
    참고: 트립신에서 장기간 배양하면 혜성 분석 중에 가짜 결과가 생성될 수 있습니다.
  3. 각 웰에 700μL의 세포 배양 배지를 추가합니다. 부드럽게 재현탁하여 시료를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    참고: 이 단계에서 셀 계수는 3.6단계에서 적절한 셀 밀도를 얻어 분석 중 꼬리가 겹치는 빈도를 줄이는 것이 좋습니다.
  4. 셀 현탁액을 실온에서 2400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  5. 배지를 흡인하고 세포를 1mL의 차가운 1x PBS에 재현탁시킵니다.
  6. 3.4 단계와 3.5 단계를 두 번 반복하고 ml당 2 x 105 세포의 세포 밀도에서 차가운 1x PBS에 세포를 재현탁시킵니다.
    참고: 이 단계에서 세포 생존율을 평가하는 것은 적절한 수의 생존 가능한 세포가 존재하는지 확인하기 위해 권장됩니다. 최소 90%의 생존율이 권장됩니다.
  7. 세포 현탁액 10μL를 용융된 아가로스 100μL 분취액에 재현탁시키고 동일한 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 혼합하고 혼합물을 슬라이드의 한 웰에 고르게 펴 바릅니다. 필요에 따라 모든 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다.
    알림: 아가로스가 응고되는 것을 방지하기 위해 42°C 수조에서 모든 부분 표본을 한 번에 제거하지 마십시오. 이 단계는 바람직하게는 수조에 의해 수행되어야 하며, 각 샘플은 재부유시키고 엇갈린 방식으로 확산시킨다. 공기 주머니는 전기영동(단계 4.5) 동안 혜성 꼬리의 이동에 영향을 미치고 건조 단계(단계 5.3)에서 균열을 도입하므로 슬라이드에 아가로스를 펴는 동안 기포를 도입하지 마십시오.
  8. 슬라이드를 4°C의 어두운 곳에서 15-20분 동안 보관하여 아가로스가 완전히 응고되었는지 확인합니다(그림 2A).
  9. 슬라이드를 Coplin 항아리에 넣고 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 용해 완충액에 담급니다.
  10. 차가운 TAE 버퍼로 슬라이드를 한 번 헹구고 슬라이드를 차가운 TAE 버퍼에 4°C에서 30분 동안 담급니다.

4. 전기영동

  1. 전기 영동 챔버를 평평한 표면에 설치하고 장치 가장자리에 있는 4개의 수평 조절 손잡이를 사용하여 시스템의 수평을 맞춥니다. 전기 영동 중에 용액을 차갑게 유지하기 위해 하단 챔버에 냉간 팩을 삽입합니다.
  2. 약 ~850mL의 차가운 1x TAE 완충액을 장치에 붓습니다.
  3. 4°C에서 슬라이드를 제거하고 손상된 DNA가 이동할 수 있도록 적절한 방향으로 전기영동 트레이에 놓습니다.
    알림: 트레이에는 10개의 2웰 슬라이드가 들어 있습니다. 더 적은 수의 샘플로 작업하는 경우 슬라이드를 트레이 중앙에 놓습니다. 홀수 개의 슬라이드로 작업하는 경우 각 웰이 2개의 슬라이드를 수용할 수 있도록 빈 슬라이드를 포함합니다.
  4. 제공된 슬라이드 트레이 오버레이를 트레이 위에 부드럽게 놓아 슬라이드를 덮습니다.
    알림: 장치의 올바른 작동을 위해 TAE 버퍼의 부피는 오버레이의 하단 표면보다 낮아서는 안 되며 오버레이의 상단 표면을 초과해서는 안 됩니다.
  5. 케이블을 연결한 후 전원을 21V로 설정하고 40분 동안 전기영동(1V/cm)을 수행합니다.
    참고: 전기영동 시간은 분석에 사용되는 셀 유형에 따라 조정해야 할 수 있습니다. 처리되지 않은 샘플의 긴 꼬리는 과도한 런타임을 나타냅니다. 반대로, positive control 샘플의 짧은 tails는 런타임이 충분하지 않다는 것을 반영할 수 있습니다.

5. 염색

  1. 전기영동 완료 후 장치에서 슬라이드를 제거하고 실온에서 30분 동안 DNA 침전 용액에 담그십시오.
  2. DNA 침전 용액을 버리고 슬라이드를 실온에서 30분 동안 70% 에탄올 용액에 담그십시오.
  3. 70% 에탄올 용액을 버리십시오. 슬라이드를 제거하고 어두운 곳에서 45°C의 혼성화 오븐에서 30분 동안 건조합니다(그림 2B).
    알림: 슬라이드는 건조 단계를 위해 밤새 어둡고 건조한 곳에 둘 수 있습니다.
  4. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 100μL의 1x SYBR Green 용액으로 웰을 배양합니다.
  5. 슬라이드를 기울여 SYBR Green 용액을 디캔팅하고 보푸라기가 없는 물티슈로 우물 가장자리를 부드럽게 두드려 초과분을 제거합니다.
  6. 슬라이드를 서랍에 넣고 30분 동안 건조시킵니다.
  7. 슬라이드의 이미징을 진행합니다.

6. 이미징 및 분석

  1. 이미징을 위해 현미경을 설정합니다.
    참고: 모든 이미지는 epifluorescence microscope를 사용하여 획득되었습니다. 0.45 개구수의 10x 배율은 1/40초의 노출 시간과 +6dB의 게인으로 사용되었습니다. 흑백 8비트의 캡처 모드는 2 x 2 비닝 및 블랙 밸런스 보정과 함께 활용되었습니다.
  2. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 FITC 필터를 사용하여 이미징을 시작합니다.
    알림: 처리되지 않은 샘플을 먼저 사용하여 노출 시간을 테스트합니다. 대부분의 세포는 DNA가 더 조밀하기 때문에 혜성의 꼬리를 나타내지 않습니다. 동일한 노출 시간을 사용하여 CPT 처리된 셀과 이미지가 있는 웰로 전환합니다. 길이가 늘어난 혜성 꼬리는 끊어진 DNA 말단의 이동으로 인해 이 샘플에서 관찰될 것입니다.
  3. 3개의 기술 복제에서 동일한 노출 시간을 사용하여 샘플당 최소 100개의 혜성에 대한 이미지를 획득합니다.
    참고: 커버슬립의 끝에 있는 혜성 꼬리는 고르지 않게 이동하는 경향이 있으며 표본 분포에서 이상치로 작용합니다. 분석을 위해 포착된 대부분의 혜성은 커버슬립의 중심 근처에 존재합니다(그림 3).
  4. 이미지를 내보내고 수동으로(이미지 J 사용) 또는 무료로 제공되는 혜성 점수 매기기 소프트웨어를 사용하여 혜성에 점수를 매깁니다. 개별적으로 구별할 수 있고 시야에 완전히 포함된 혜성은 점수를 매기기 위해 선택됩니다. 겹치거나 부분적으로 보이는 혜성은 추가 분석을 위해 고려되지 않습니다(그림 4).
    참고: 사용자는 다음 플러그인을 사용하여 이미지 J에서 혜성을 점수 매길 수 있습니다: https://cometbio.org/index.html. CometScore 소프트웨어를 사용하여 혜성의 점수를 매기는 방법에 대한 자세한 내용은 그림 5에 포함되어 있습니다.
  5. 해석에서 얻은 꼬리 모멘트를 10-90 백분위수 값을 나타내는 상자 및 수염 그림으로 플로팅합니다. 정규성 검정을 수행하여 통계 분석에 모수적 검정을 사용해야 하는지 또는 비모수적 검정을 사용해야 하는지 여부를 결정합니다.
    참고: 대부분의 경우, 두 개의 샘플만 비교하는 경우 Mann-Whitney 테스트를 사용하거나 세 개 이상의 샘플을 비교하는 경우 Dunn의 다중 비교를 사용하는 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비모수 테스트를 적용합니다.

결과

복제 스트레스 시약에 의한 파괴 유도 분석
U2OS 세포는 DMSO, 4mM 하이드록시우레아(HU) 또는 100nM의 CPT로 4시간 동안 처리하고 NC 분석으로 파괴 축적을 분석했습니다(그림 6A). CPT는 토포이소머라제-113을 차단하여 S상 동안 단절을 유도하는 반면, HU에 의한 뉴클레오티드 풀의 고갈은 점진적으로 DSB로 전환되는 복제 포크를 중단시킨다

토론

이 프로토콜은 활성 복제가 진행 중인 인간 세포의 DNA 절단을 평가하기 위한 NC 분석을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 비교적 간단하게 수행할 수 있으며, 연구자들은 알칼리성 분석을 위해 높은 pH 조건에 쉽게 적용할 수 있습니다8. 여기에는 3.7단계 및 4.5단계에 설명된 대로 두 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 3.7단계에서는 분석 중에 혜성이 겹치는 것을 방지하기 위해 ?...

공개

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

Dungrawala 연구소 구성원의 의견과 피드백에 감사드립니다. 이 연구는 NIH 보조금 R35GM137800 HD의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSGibco14190144
CamptothecinSelleckchemS1288
Comet LMAgarose (LMA)R&D systems4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System IIR&D systems4250-050-ESIncludes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore softwareTriTekopen-sourced
CometSlideR&D systems4250-050-03
DMEM, high glucoseGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO FisherSciD128-4
Epifluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Fetal Bovine Serum - PremiumBio-TechneS11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T cellsATCCCRL-11268
hTERT-RPE-1 cellsATCCCRL-4000
HydroxyureaMillipore SigmaH8627
PARP inhibitor OlaparibSelleckchemS8096
PowerPac FisherSciFB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture PlateFisherSciFB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)FisherSciS7567
U2OS cellsATCCHTB-96
UVP HB-1000 Hybridization IncubatorFisherSciUVP95003001

참고문헌

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