Detección de roturas de ADN en células humanas en división mediante el ensayo de cometa neutro

Resumen

Este protocolo está diseñado para investigar el alcance del daño en el ADN que se produce durante la replicación del ADN. En condiciones neutras, la inducción de roturas de ADN puede evaluarse fácilmente en un corto período de tiempo. Además, el protocolo es adaptable a otros tipos de células y a diversos reactivos de estrés de replicación.

Resumen

La replicación del ADN se ve constantemente desafiada por una amplia variedad de factores estresantes endógenos y exógenos que pueden dañar el ADN. Tales lesiones encontradas durante la duplicación del genoma pueden detener los replisomas y convertir las horquillas de replicación en roturas de doble cadena. Si no se reparan, estas roturas tóxicas del ADN pueden desencadenar reordenamientos cromosómicos, lo que conduce a una mayor inestabilidad del genoma y una mayor probabilidad de transformación celular. Además, las células cancerosas exhiben un estrés de replicación persistente, lo que hace que dirigirse a las vulnerabilidades de la horquilla de replicación en las células tumorales sea una estrategia atractiva para la quimioterapia. Una técnica muy versátil y potente para estudiar las roturas del ADN durante la replicación es el ensayo del cometa. Esta técnica de electroforesis en gel detecta de forma fiable la inducción y reparación de roturas de ADN a nivel de una sola célula. En este artículo, se describe un protocolo que permite a los investigadores medir el alcance del daño en el ADN en células humanas que se dividen mitóticamente utilizando agentes que detienen la horquilla en múltiples tipos de células. El acoplamiento de esto con la puntuación automatizada de cometas facilita un análisis rápido y mejora la fiabilidad en el estudio de la inducción de roturas de ADN.

Introducción

El ensayo del cometa es un método de electroforesis en gel que se utiliza para detectar roturas de ADN a nivel de una sola célula. Se basa en el principio de que las roturas abiertas del ADN migran en condiciones electroforéticas, mientras que el ADN intacto permanece en gran medida estático. El ADN roto migra porque las roturas dan lugar a la relajación del ADN superenrollado, lo que provoca su reubicación espacial gradual hacia el ánodo en la cámara electroforética, lo que da lugar a una apariencia similar a la de un cometa observada por inmunofluorescencia ^1,2. A continuación, se mide el grado de daño en el ADN cuantificando la cantidad de ADN roto que ha migrado en relación con el ADN compacto.

Los dos métodos de ensayo de cometas más utilizados son el ensayo de cometa alcalino (AC) y el ensayo de cometa neutro (NC). El ensayo AC se realiza en condiciones de desnaturalización utilizando una solución de pH alcalino alto, mientras que el ensayo NC se lleva a cabo en una solución con pH neutro. Tanto los ensayos NC como los AC pueden detectar de forma fiable las roturas de ADN que se producen en el núcleo. Sin embargo, la versión alcalina también es ventajosa para detectar sitios alcalino-lábiles³. Ambos formatos del ensayo requieren el uso de condiciones de lisis para garantizar que el ADN esté libre de proteínas antes de la electroforesis.

Este ensayo es un método simple para detectar roturas de ADN y ofrece varias ventajas únicas para determinar el daño celular en el ADN. El método es relativamente fácil de configurar y requiere reactivos que se pueden preparar en el laboratorio o comprar a proveedores comerciales. Al tratarse de una técnica de resolución de una sola célula, el ensayo requiere muy poco material de partida. En particular, el ensayo NC puede medir roturas con alta sensibilidad, y se ha informado que detecta entre 50 y 10.000 roturas por célula⁴. La versatilidad de esta técnica queda demostrada por su amplia gama de aplicaciones, incluyendo la ecotoxicología⁵, la biomonitorización humana⁶ y los estudios de genotoxicidad⁷. El ensayo también puede utilizarse de forma fiable en varios tipos de células y adaptarse para ensayos de alto rendimiento⁸ y para evaluar roturas en regiones genómicas específicas⁹. Por lo tanto, este ensayo sirve como una técnica rápida y confiable para investigar la formación de roturas a nivel de una sola célula.

El proceso de replicación del ADN es constantemente desafiado por varios estresores endógenos y exógenos^10,11. El estancamiento de los replisomas debido a tales lesiones puede causar roturas del ADN y dar lugar a una mayor inestabilidad del genoma. Las roturas del ADN también surgen a menudo como intermediarios de replicación para facilitar la reparación del ADN¹². Además, varios agentes quimioterapéuticos inducen roturas de doble cadena (DSB) dependientes de la replicación, como la camptotecina (CPT)^13,14,15 y los inhibidores de PARP ^16,17. Por lo tanto, este ensayo sirve como una metodología poderosa para estudiar la naturaleza de las lesiones de ADN, evaluar el procesamiento de las horquillas de replicación e investigar el potencial terapéutico de los agentes que dañan el ADN. Las adaptaciones del ensayo que implican el marcaje de ADN recién sintetizado con BrdU han sido útiles para estudiar los fenotipos de estrés asociados a la replicación 18,19,20,21. En particular, el ensayo NC es un método fiable para estudiar la inducción de la rotura del ADN en el contexto de la replicación, como se ha demostrado en estudios que implican la caracterización de proteínas de horquilla^22,23, el análisis de intermediarios de replicación^24,25 y la investigación de conflictos de transcripción-replicación en el mantenimiento del genoma^26,27. En este artículo, describimos un protocolo de ensayo NC con el objetivo de cuantificar las roturas de ADN durante la replicación en células humanas. Este protocolo puede ser implementado fácilmente por investigadores interesados en evaluar el daño asociado al estrés de replicación en una amplia variedad de células humanas en división.

Protocolo

Este protocolo (Figura 1) utiliza principalmente líneas celulares cancerosas U2OS adherentes, pero es adaptable a una amplia variedad de células adherentes y en suspensión cultivadas en cultivo de tejidos. Las soluciones y tampones utilizados en este estudio se detallan en la Tabla 1. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de los materiales

1. Antes del día del experimento, coloque la botella provista con agarosa de bajo punto de fusión (1% de agarosa de bajo punto de fusión en PBS) en un baño de agua caliente durante 5-10 minutos para asegurarse de que la agarosa se haya derretido por completo.
   NOTA: No caliente el biberón en el microondas.
2. Una vez fundida, alícuota rápidamente 100 μL de la agarosa en tubos de centrífuga de 1,5 mL según sea necesario y almacene los tubos a 4 °C. La agarosa solidificada puede almacenarse a 4 °C hasta 1 año.
3. El día del experimento, retire el número necesario de tubos de centrífuga del almacenamiento a 4 °C. Derrita la agarosa colocando los tubos en un bloque de calor o baño de agua a 42 °C.
   NOTA: Coloque los tubos a 42 °C antes de recolectar las células para asegurarse de que la agarosa esté completamente derretida para la resuspensión (paso 3.7).
4. Prepare el tampón de lisis y el tampón TAE el día del experimento y guárdelos a temperatura ambiente y 4 °C, respectivamente, hasta que estén listos para usar. Además, alícuota 1x PBS en tubo cónico de 15 mL y colóquelo en la nevera para utilizarlo en la etapa de resuspensión (paso 3.5).
5. Marque las identificaciones de las muestras en el extremo esmerilado de los portaobjetos de cometas de 2 pocillos y guárdelas a temperatura ambiente hasta que estén listas para usar.

2. Preparación de las muestras

1. Antes del día del experimento, siembre las células en una placa de 6 pocillos y cultive durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂. En el caso de las células U2OS, se sembraron aproximadamente 2-3 x 10⁵ células para cada muestra.
   NOTA: Es posible que sea necesario ajustar los números de celda en función del tipo de celda utilizado para los análisis.
2. El día del experimento, trate las células con las condiciones según el diseño experimental. Como control positivo para demostrar la inducción de roturas dependientes de la replicación, se deben tratar las células con 1 μM de CPT durante 1 h. CPT es un inhibidor de la topoisomerasa-1 que induce roturas de doble cadena de una manera dependiente de la replicación¹⁴.

3. Resuspensión y lisis celular

1. Aspire los medios de cultivo celular y enjuague dos veces con 1x PBS.
2. Añadir 300 μL de tripsina a cada pocillo. Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos durante 2-3 min.
   NOTA: La incubación prolongada en tripsina puede generar resultados falsos durante los análisis de cometas.
3. Añada 700 μL de medio de cultivo celular a cada pocillo. Vuelva a suspender suavemente y transfiera las muestras a tubos de centrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Se recomienda contar las células en este paso para obtener la densidad de células adecuada en el paso 3.6 para reducir la frecuencia de colas superpuestas durante el análisis.
4. Centrifugar la suspensión celular a 2400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Aspire el medio y vuelva a suspender las células en 1 mL de PBS frío 1x.
6. Repita los pasos 3.4 y 3.5 dos veces y vuelva a suspender las células en PBS frío 1x a una densidad celular de 2 x 10⁵ células por ml.
   NOTA: Se recomienda evaluar la viabilidad celular en este paso para garantizar la presencia de un número adecuado de células viables. Se recomienda al menos un 90% de viabilidad.
7. Vuelva a suspender 10 μL de la suspensión celular en 100 μL de agave derretida y, con la misma punta de pipeta, mezcle suavemente y extienda la mezcla uniformemente en un pocillo del portaobjetos. Repita este paso para todas las muestras según sea necesario.
   NOTA: Evite retirar todas las alícuotas del baño de agua a 42 °C de una vez para evitar que la agarosa se solidifique. Este paso debe realizarse preferiblemente por el baño de agua, y cada muestra se resuspende y se extiende de forma escalonada. Evite introducir burbujas mientras se extiende la agarosa en el portaobjetos, ya que las bolsas de aire afectarán a la migración de las colas del cometa durante la electroforesis (paso 4.5) e introducirán grietas en el paso de secado (paso 5.3)
8. Guarde los portaobjetos a 4 °C en la oscuridad durante 15-20 minutos para asegurarse de que la agarosa se haya solidificado completamente (Figura 2A).
9. Coloque los portaobjetos en frascos Coplin y sumérjalos en tampón de lisis durante 1 h a temperatura ambiente.
10. Enjuague los portaobjetos una vez con tampón TAE frío y sumerja los portaobjetos en tampón TAE frío durante 30 minutos a 4 °C.

4. Electroforesis

1. Coloque la cámara electroforética sobre una superficie plana y nivele el sistema usando las cuatro perillas de nivelación en los bordes del aparato. Inserte compresas frías en la cámara inferior para mantener la solución fría durante la electroforesis.
2. Vierta aproximadamente ~ 850 mL de tampón TAE frío 1x en el aparato.
3. Retire los portaobjetos a 4 °C y colóquelos en la bandeja de electroforesis en la orientación adecuada para permitir la migración del ADN roto.
   NOTA: La bandeja tiene capacidad para diez portaobjetos de 2 pocillos. Coloque los portaobjetos en el centro de la bandeja si trabaja con un número menor de muestras. Si trabaja con un número impar de portaobjetos, incluya un portaobjetos en blanco de modo que cada pozo tenga capacidad para 2 portaobjetos.
4. Coloque suavemente la capa de bandeja de portaobjetos provista encima de la bandeja para cubrir las diapositivas.
   NOTA: Para el correcto funcionamiento del aparato, el volumen del tampón TAE no debe ser inferior a la superficie inferior de la superposición ni exceder la superficie superior de la superposición.
5. Después de conectar los cables, ajuste la potencia a 21 V y realice la electroforesis (1 V/cm) durante 40 min.
   NOTA: Es posible que sea necesario ajustar el tiempo de electroforesis en función del tipo de célula utilizada para los análisis. Las colas largas en las muestras no tratadas indican un tiempo de ejecución excesivo. Por el contrario, las colas cortas en las muestras de control positivo pueden reflejar un tiempo de ejecución insuficiente.

5. Manchas

1. Una vez finalizada la electroforesis, retire los portaobjetos del aparato y sumérjalos en la solución de precipitación de ADN durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2. Deseche la solución de precipitación de ADN y sumerja los portaobjetos en una solución de etanol al 70% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Deseche la solución de etanol al 70%. Retire los portaobjetos y séquelos en un horno de hibridación a 45 °C durante 30 min en la oscuridad (Figura 2B).
   NOTA: Los portaobjetos se pueden dejar en un lugar oscuro y seco durante la noche para el paso de secado.
4. Incubar los pocillos con 100 μL de 1x solución verde SYBR durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
5. Decantar la solución SYBR Green inclinando los portaobjetos y eliminando el exceso frotando suavemente el borde del pocillo con una toallita sin pelusa.
6. Coloca los portaobjetos en un cajón y déjalos secar durante 30 min.
7. Proceda con la toma de imágenes de las diapositivas.

6. Imagenología y análisis

1. Configure el microscopio para fines de obtención de imágenes.
   NOTA: Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de epifluorescencia. Se utilizó un aumento de 10x con una apertura numérica de 0,45 con un tiempo de exposición de 1/40s y una ganancia de +6dB. Se utilizó el modo de captura monocromo de 8 bits con agrupación 2 x 2 y corrección del balance de negros.
2. Coloque los portaobjetos en la platina del microscopio y comience a tomar imágenes con el filtro FITC.
   NOTA: Utilice primero la muestra no tratada para probar el tiempo de exposición. La mayoría de las células no exhiben colas de cometa ya que el ADN es más compacto. Cambie al pocillo con células tratadas con CPT e imagen utilizando el mismo tiempo de exposición. En esta muestra se observarán colas de cometas con longitudes aumentadas debido a la migración de extremos de ADN rotos.
3. Adquiera imágenes de al menos 100 cometas por muestra utilizando el mismo tiempo de exposición en tres réplicas técnicas.
   NOTA: Las colas de los cometas al final de los cubreobjetos tienden a migrar de manera desigual y actúan como valores atípicos en la distribución de la muestra. La mayoría de los cometas capturados para los análisis están presentes cerca del centro del cubreobjetos (Figura 3).
4. Exporte imágenes y puntúe los cometas, ya sea manualmente (usando la Imagen J) o mediante el uso de software de puntuación de cometas disponible gratuitamente. Los cometas que se distinguen individualmente y que están completamente contenidos en el campo de visión se seleccionan para la puntuación. Los cometas superpuestos o parcialmente visibles no se consideran para análisis posteriores (Figura 4).
   NOTA: Los usuarios pueden puntuar cometas en la Imagen J utilizando el siguiente complemento: https://cometbio.org/index.html. En la Figura 5 se incluyen los detalles de la puntuación de los cometas utilizando el software CometScore.
5. Traza los momentos de cola adquiridos a partir de los análisis como diagramas de caja y bigotes que representan valores de percentil 10-90. Realizar pruebas de normalidad para determinar si se deben utilizar pruebas paramétricas o no paramétricas para los análisis estadísticos.
   NOTA: En la mayoría de los casos, las pruebas no paramétricas se aplican utilizando la prueba de Mann-Whitney si se comparan solo dos muestras o la prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn si se comparan tres o más muestras.

Resultados

Análisis de la inducción de rotura por reactivos de estrés de replicación
Las células U2OS se trataron con DMSO, 4 mM de hidroxiurea (HU) o 100 nM de CPT durante 4 h y se analizaron para determinar la acumulación de roturas mediante el ensayo NC (Figura 6A). Mientras que CPT induce rupturas durante la fase S al bloquear la topoisomerasa-1¹³, el agotamiento de los grupos de nucleótidos inducido por HU detiene las horquillas de replicación qu...

Discusión

Este protocolo describe un ensayo NC para evaluar las roturas de ADN en células humanas en proceso de replicación activa. El protocolo es relativamente sencillo de realizar, y los investigadores pueden adaptarlo fácilmente a condiciones de pH alto para análisis alcalinos⁸. Incluye dos pasos críticos, como se describe en los pasos 3.7 y 4.5. En el paso 3.7, es esencial esparcir la agarosa derretida con células de manera uniforme a través del pozo para evitar que los cometas se superpongan du...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Gibco	14190144
Camptothecin	Selleckchem	S1288
Comet LMAgarose (LMA)	R&D systems	4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System II	R&D systems	4250-050-ES	Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore software	TriTek		open-sourced
CometSlide	R&D systems	4250-050-03
DMEM, high glucose	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	FisherSci	D128-4
Epifluorescence microscope	Keyence	BZ-X810
Fetal Bovine Serum - Premium	Bio-Techne	S11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
GraphPad Prism 10.0	GraphPad
HEK293T cells	ATCC	CRL-11268
hTERT-RPE-1 cells	ATCC	CRL-4000
Hydroxyurea	Millipore Sigma	H8627
PARP inhibitor Olaparib	Selleckchem	S8096
PowerPac	FisherSci	FB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate	FisherSci	FB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)	FisherSci	S7567
U2OS cells	ATCC	HTB-96
UVP HB-1000 Hybridization Incubator	FisherSci	UVP95003001