通过中性彗星测定法检测分裂人类细胞中的 DNA 断裂

摘要

该实验步骤旨在研究 DNA 复制过程中发生的 DNA 损伤程度。在中性条件下，可以在短时间内轻松评估 DNA 断裂的诱导。此外，该方案适用于其他细胞类型和各种复制应激试剂。

摘要

DNA 复制不断受到各种内源性和外源性应激源的挑战，这些应激源会损害 DNA。在基因组复制过程中遇到的此类损伤会使复制体停滞并将复制叉转化为双链断裂。如果不修复，这些有毒的 DNA 断裂会触发染色体重排，导致基因组不稳定性增加和细胞转化的可能性增加。此外，癌细胞表现出持续的复制应激，这使得靶向肿瘤细胞中的复制叉脆弱性成为化疗的一种有吸引力的策略。彗星测定是研究复制过程中 DNA 断裂的一种高度通用且强大的技术。这种凝胶电泳技术能够可靠地检测单细胞水平 DNA 断裂的诱导和修复。本文概述了一个方案，允许研究人员使用叉式停滞剂在多种细胞类型中使用有丝分裂的人类细胞中 DNA 损伤的程度。将其与自动彗星评分相结合，有助于快速分析并提高研究 DNA 断裂诱导的可靠性。

引言

彗星检测是一种凝胶电泳方法，用于检测单细胞水平的 DNA 断裂。它依赖于开放端 DNA 断裂在电泳条件下迁移的原理，而完整的 DNA 在很大程度上保持静态。断裂的 DNA 迁移是因为断裂导致超螺旋 DNA 松弛，导致其在空间上逐渐向电泳室中的阳极重新定位，从而导致免疫荧光观察到彗星状外观 ^1,2。然后通过量化相对于紧凑 DNA 迁移的断裂 DNA 的数量来测量 DNA 损伤的程度。

两种最常用的彗星分析方法是碱性彗星 （AC） 测定和中性彗星 （NC） 测定。AC 测定是在变性条件下使用高碱性 pH 溶液进行的，而 NC 测定是在中性 pH 的溶液中进行的。NC 和 AC 检测都可以可靠地检测细胞核中发生的 DNA 断裂。然而，碱性版本也有利于检测碱不稳定位点³。两种形式的检测都需要使用裂解条件，以确保 DNA 在电泳前不含蛋白质。

该检测是一种检测 DNA 断裂的简单方法，为确定细胞 DNA 损伤提供了几个独特的优势。该方法相对容易设置，并且需要可以在实验室制备或从商业供应商处购买的试剂。作为一种单细胞分离技术，该检测需要很少的起始材料。值得注意的是，NC 测定可以高灵敏度测量断裂，据报道每个细胞可检测到 50 至 10,000 个断裂⁴。该技术的多功能性体现在其广泛的应用上，包括生态毒理学 5（ecotoxicology^）、人类生物监测 6 （human biomonitoring⁶） 和遗传毒性研究⁷（genotoxicity studies）。该检测试剂盒还可以可靠地用于各种细胞类型，并适用于高通量检测⁸ 和评估特定基因组区域的断裂⁹。因此，该测定法是一种快速可靠的技术，用于研究单细胞水平的断裂形成。

DNA 复制过程不断受到几种内源性和外源性压力源的挑战^10,11。由于此类损伤导致的复制体停滞会导致 DNA 断裂并导致基因组不稳定性增加。DNA 断裂也经常作为复制中间体出现，以促进 DNA 修复¹²。此外，几种化疗药物可诱导复制依赖性双链断裂 （DSB），例如喜树碱 （CPT） ^13,14,15 和 PARP 抑制剂 ^16,17。因此，该测定法是研究 DNA 损伤性质、评估复制叉加工以及研究 DNA 损伤剂治疗潜力的有力方法。涉及用 BrdU 标记新合成的 DNA 的测定的改编可用于研究复制相关的应激表型 18,19,20,21。值得注意的是，NC 测定是在复制背景下研究 DNA 断裂诱导的可靠方法，如涉及叉蛋白表征^22,23、复制中间体分析 ^24,25 和基因组维护中转录-复制冲突的研究^26,27 所证明的那样.在此，我们概述了一种 NC 检测方案，目的是量化人类细胞复制过程中的 DNA 断裂。有兴趣评估各种分裂人类细胞中复制应激相关损伤的研究人员可以很容易地实施该方案。

研究方案

该方案（图 1）主要利用贴壁 U2OS 癌细胞系，但适用于在组织培养中生长的多种贴壁和悬浮细胞。本研究中使用的溶液和缓冲液详见 表 1。使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 准备材料

1. 在实验前一天，将提供的装有低熔点琼脂糖（PBS 中 1% 低熔点琼脂糖）的瓶子放入热水浴中 5-10 分钟，以确保琼脂糖完全熔化。
   注意: 请勿在微波炉中加热瓶子。
2. 熔化后，根据需要将 100 μL 琼脂糖快速分装到 1.5 mL 离心管中，并将试管储存在 4 °C 下。 固化的琼脂糖可在 4 °C 下储存长达 1 年。
3. 在实验当天，从 4 °C 储存中取出所需数量的离心管。将试管置于 42 °C 的加热块或水浴中熔化琼脂糖。
   注意:在收获细胞之前，将试管置于 42 °C，以确保琼脂糖完全熔化以进行重悬（步骤 3.7）。
4. 在实验当天准备新鲜的裂解缓冲液和 TAE 缓冲液，并分别将它们储存在室温和 4 °C 下，直至准备使用。此外，在 15 mL 锥形管中分装 1x PBS，并将其放入冰箱中用于重悬步骤（步骤 3.5）。
5. 在 2 孔彗星载玻片的磨砂端标记样品标识，并将其储存在室温下直至准备使用。

2. 样品的制备

1. 在实验前一天，将细胞接种在 6 孔培养皿中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养过夜。对于 U2OS 细胞，每个样品接种大约 2-3 x 10⁵ 个细胞。
   注:可能需要根据用于分析的细胞类型调整细胞数量。
2. 在实验当天，按照实验设计的条件处理细胞。作为证明复制依赖性断裂诱导的阳性对照，用 1 μM CPT 处理细胞 1 小时。CPT 是一种拓扑异构酶-1 抑制剂，以复制依赖性方式诱导双链断裂¹⁴。

3. 细胞重悬和裂解

1. 吸出细胞培养基并用 1x PBS 冲洗两次。
2. 向每个孔中加入 300 μL 胰蛋白酶。将培养皿在组织培养箱中孵育 2-3 分钟。
   注:在胰蛋白酶中长时间孵育会在彗星分析过程中产生虚假结果。
3. 向每个孔中加入 700 μL 细胞培养基。轻轻重悬并将样品转移至 1.5 mL 离心管中。
   注:建议在此步骤中对细胞进行计数，以便在步骤 3.6 中获得适当的细胞密度，以减少分析过程中重叠尾部的频率。
4. 在室温下以 2400 x g 离心细胞悬液 5 分钟。
5. 吸出培养基并将细胞重悬于 1 mL 冷的 1x PBS 中。
6. 重复步骤 3.4 和步骤 3.5 两次，并以 2 x 10⁵ 个细胞/ml 的细胞密度将细胞重悬于冷的 1x PBS 中。
   注:建议在此步骤中评估细胞活力，以确保存在足够数量的活细胞。建议至少 90% 的活力。
7. 将 10 μL 细胞悬液重悬于 100 μL 等分试样的熔融琼脂糖中，并使用相同的移液器吸头，轻轻混合并将混合物均匀地涂在载玻片的一个孔中。根据需要对所有样品重复此步骤。
   注:避免一次从 42 °C 水浴中取出所有等分试样，以防止琼脂糖凝固。此步骤最好通过水浴进行，并且每个样品都以交错方式重悬和铺展。避免在载玻片上铺展琼脂糖时引入气泡，因为气穴会影响电泳过程中彗尾的迁移（步骤 4.5），并在干燥步骤（步骤 5.3）中引入裂纹
8. 将载玻片在 4 °C 下避光储存 15-20 分钟，以确保琼脂糖已完全凝固（图 2A）。
9. 将载玻片放入 Coplin 罐中，并在室温下将载玻片浸入裂解缓冲液中 1 小时。
10. 用冷的 TAE 缓冲液冲洗载玻片一次，然后将载玻片浸入 4 °C 的冷 TAE 缓冲液中 30 分钟。

4. 电泳

1. 将电泳室设置在平坦的表面上，并使用设备边缘的四个调平旋钮调平系统。将冷袋插入底部腔室，以在电泳过程中保持溶液低温。
2. 将大约 ~850 mL 的冷 1x TAE 缓冲液倒入设备中。
3. 从 4 °C 中取出载玻片，并将它们以正确的方向放在电泳托盘上，以允许断裂的 DNA 迁移。
   注意:托盘可容纳 10 个 2 孔玻片。如果处理的样品数量较少，请将玻片放在托盘的中央。如果使用奇数张玻片，请包括一个空白玻片，以便每个孔可容纳 2 张玻片。
4. 轻轻地将提供的玻片托盘覆盖物放在托盘顶部以覆盖玻片。
   注:为了设备的正确操作，TAE 缓冲液的体积不应低于覆盖层的底面，也不应超过覆盖层的顶面。
5. 连接电缆后，将电源设置为 21 V 并进行电泳 （1 V/cm） 40 分钟。
   注:电泳时间可能需要根据用于分析的细胞类型进行调整。未处理样品中的长尾表示运行时间过长。相反，阳性对照样品中的短尾可能反映运行时间不足。

5. 染色

1. 电泳完成后，从装置中取出载玻片，并在室温下将其浸入 DNA 沉淀溶液中 30 分钟。
2. 弃去 DNA 沉淀溶液，将载玻片在室温下浸入 70% 乙醇溶液中 30 分钟。
3. 丢弃 70% 乙醇溶液。取出载玻片，并在 45 °C 的杂交炉中黑暗中干燥 30 分钟（图 2B）。
   注:玻片可置于黑暗干燥处过夜进行干燥步骤。
4. 将孔与 100 μL 1x SYBR Green 溶液在室温下避光孵育 30 分钟。
5. 倾斜载玻片倒出 SYBR Green 溶液，然后用无绒湿巾轻轻擦拭孔边缘以去除多余的部分。
6. 将载玻片放入抽屉中，晾干 30 分钟。
7. 继续对载玻片进行成像。

6. 成像和分析

1. 设置显微镜以进行成像。
   注意:所有图像均使用落射荧光显微镜采集。使用具有 0.45 数值孔径的 10 倍放大倍率，曝光时间为 1/40 秒，增益为 +6dB。单色 8 位的拍摄模式采用 2 x 2 像素融合和黑平衡校正。
2. 将载玻片放在显微镜载物台上，并使用 FITC 过滤器开始成像。
   注意:首先使用未经处理的样品来测试曝光时间。大多数细胞不表现出彗尾，因为 DNA 更紧凑。切换到带有 CPT 处理的细胞的孔中，并使用相同的曝光时间成像。由于断裂的 DNA 末端的迁移，将在该样品中观察到长度增加的彗星尾巴。
3. 在三个技术重复中使用相同的曝光时间，每个样品至少采集 100 颗彗星的图像。
   注:盖玻片末端的彗尾往往迁移不均匀，并在样品分布中充当异常值。大多数捕获用于分析的彗星都存在于盖玻片中心附近（图 3）。
4. 手动（使用 Image J）或使用免费提供的彗星评分软件导出图像并对彗星进行评分。选择可单独区分并完全包含在视野中的彗星进行评分。重叠或部分可见的彗星不被考虑用于进一步分析（图 4）。
   注意:用户可以使用以下插件在 Image J 上对彗星进行评分:https://cometbio.org/index.html。图 5 中包含使用 CometScore 软件对彗星进行评分的详细信息。
5. 将从分析中获得的尾矩绘制为描述 10-90 个百分位值的箱形图和须线图。执行正态性检验以确定是否应使用参数检验或非参数检验进行统计分析。
   注意:在大多数情况下，如果仅比较两个样本，则使用 Mann-Whitney 检验应用非参数检验，如果比较三个或更多样本，则使用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 多重比较。

结果

通过复制应力试剂分析断裂诱导
U2OS 细胞用 DMSO、4 mM 羟基脲 （胡） 或 100 nM CPT 处理 4 小时，并通过 NC 测定分析断裂积累（图 6A）。虽然 CPT 通过阻断拓扑异构酶 1 在 S 期诱导断裂¹³，但 胡 诱导的核苷酸池耗竭会阻止逐渐转化为 DSB 的复制叉²⁸。数据表明，暴露于 胡 或 CPT 会触发 S 期的断裂诱导，这可以通过 NC 测定检测到?...

讨论

该方案概述了一种 NC 测定法，用于评估正在进行活性复制的人类细胞中的 DNA 断裂。该方案执行起来相对简单，研究人员可以很容易地使其适应高 pH 条件进行碱性分析⁸。它包括两个关键步骤，如步骤 3.7 和 4.5 中所述。在步骤 3.7 中，必须将熔化的琼脂糖与细胞均匀地分布在孔中，以防止彗星在分析过程中重叠。在将细胞重悬于琼脂糖中之前，确保细胞聚集体已溶解。在涂抹琼?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Gibco	14190144
Camptothecin	Selleckchem	S1288
Comet LMAgarose (LMA)	R&D systems	4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System II	R&D systems	4250-050-ES	Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore software	TriTek		open-sourced
CometSlide	R&D systems	4250-050-03
DMEM, high glucose	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	FisherSci	D128-4
Epifluorescence microscope	Keyence	BZ-X810
Fetal Bovine Serum - Premium	Bio-Techne	S11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
GraphPad Prism 10.0	GraphPad
HEK293T cells	ATCC	CRL-11268
hTERT-RPE-1 cells	ATCC	CRL-4000
Hydroxyurea	Millipore Sigma	H8627
PARP inhibitor Olaparib	Selleckchem	S8096
PowerPac	FisherSci	FB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate	FisherSci	FB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)	FisherSci	S7567
U2OS cells	ATCC	HTB-96
UVP HB-1000 Hybridization Incubator	FisherSci	UVP95003001