Detecção de quebras de DNA em células humanas em divisão por ensaio de cometa neutro

Resumo

Este protocolo é projetado para investigar a extensão dos danos ao DNA que ocorrem durante a replicação do DNA. Em condições neutras, a indução de quebras de DNA pode ser prontamente avaliada em um curto período de tempo. Além disso, o protocolo é adaptável a outros tipos de células e vários reagentes de estresse de replicação.

Resumo

A replicação do DNA é constantemente desafiada por uma ampla variedade de estressores endógenos e exógenos que podem danificar o DNA. Tais lesões encontradas durante a duplicação do genoma podem paralisar os replissomos e converter garfos de replicação em quebras de fita dupla. Se não forem reparadas, essas quebras tóxicas de DNA podem desencadear rearranjos cromossômicos, levando a uma maior instabilidade do genoma e a uma maior probabilidade de transformação celular. Além disso, as células cancerígenas exibem estresse de replicação persistente, tornando o direcionamento das vulnerabilidades do garfo de replicação em células tumorais uma estratégia atraente para a quimioterapia. Uma técnica altamente versátil e poderosa para estudar quebras de DNA durante a replicação é o ensaio do cometa. Esta técnica de eletroforese em gel detecta de forma confiável a indução e o reparo de quebras de DNA no nível de uma única célula. Aqui, é descrito um protocolo que permite aos investigadores medir a extensão do dano ao DNA em células humanas em divisão mitótica usando agentes de travamento de garfo em vários tipos de células. Acoplar isso com a pontuação automatizada do cometa facilita a análise rápida e aumenta a confiabilidade no estudo da indução de quebras de DNA.

Introdução

O ensaio cometa é um método de eletroforese em gel usado para detectar quebras de DNA no nível de uma única célula. Ele se baseia no princípio de que as quebras de DNA abertas migram sob condições eletroforéticas, enquanto o DNA intacto permanece em grande parte estático. O DNA quebrado migra porque as quebras resultam no relaxamento do DNA superenrolado, causando sua realocação espacial gradual em direção ao ânodo na câmara eletroforética, o que resulta em uma aparência semelhante a um cometa observada por imunofluorescência ^1,2. A extensão do dano ao DNA é então medida quantificando a quantidade de DNA quebrado que migrou em relação ao DNA compacto.

Os dois métodos de ensaio de cometa mais comumente usados são o ensaio de cometa alcalino (AC) e o ensaio de cometa neutro (NC). O ensaio AC é realizado em condições de desnaturação usando uma solução de pH alcalino alto, enquanto o ensaio NC é realizado em uma solução com pH neutro. Os ensaios NC e AC podem detectar com segurança quebras de DNA que ocorrem no núcleo. No entanto, a versão alcalina também é vantajosa para detectar sítios alcalino-lábeis³. Ambos os formatos do ensaio requerem o uso de condições de lise para garantir que o DNA esteja livre de proteínas antes da eletroforese.

Este ensaio é um método simples para detectar quebras de DNA e oferece várias vantagens exclusivas para determinar danos ao DNA celular. O método é relativamente fácil de configurar e requer reagentes que podem ser preparados em laboratório ou adquiridos de fornecedores comerciais. Como uma técnica de resolução de célula única, o ensaio requer muito pouco material inicial. Notavelmente, o ensaio NC pode medir quebras com alta sensibilidade, relatadas para detectar entre 50 e 10.000 quebras por célula⁴. A versatilidade dessa técnica é demonstrada por sua ampla gama de aplicações, incluindo ecotoxicologia⁵, biomonitoramento humano⁶ e estudos de genotoxicidade⁷. O ensaio também pode ser usado de forma confiável em vários tipos de células e adaptado para ensaios de alto rendimento⁸ e para avaliar quebras em regiões genômicas específicas⁹. Assim, este ensaio serve como uma técnica rápida e confiável para investigar a formação de quebras no nível de célula única.

O processo de replicação do DNA é constantemente desafiado por vários estressores endógenos e exógenos^10,11. A paralisação dos replissomos devido a essas lesões pode causar quebras de DNA e resultar em maior instabilidade do genoma. As quebras de DNA também surgem frequentemente como intermediários de replicação para facilitar o reparo do DNA¹². Além disso, vários agentes quimioterápicos induzem quebras de fita dupla dependentes da replicação (DSBs), como a camptotecina (CPT) ^{13 , 14 , 15}e os inibidores de PARP^{16 , 17} . Assim, este ensaio serve como uma metodologia poderosa para estudar a natureza das lesões de DNA, avaliar o processamento de garfos de replicação e investigar o potencial terapêutico de agentes prejudiciais ao DNA. Adaptações do ensaio que envolvem a marcação de DNA recém-sintetizado com BrdU têm sido úteis para estudar fenótipos de estresse associados à replicação 18,19,20,21. Notavelmente, o ensaio NC é um método confiável para estudar a indução de quebra de DNA no contexto da replicação, conforme demonstrado em estudos envolvendo a caracterização de proteínas fork^{22 , 23} , análise de intermediários de replicação^{24 , 25} e investigação de conflitos de transcrição e replicação na manutenção do genoma^{26 , 27}. Aqui, descrevemos um protocolo de ensaio NC com o objetivo de quantificar as quebras de DNA durante a replicação em células humanas. Este protocolo pode ser prontamente implementado por pesquisadores interessados em avaliar os danos associados ao estresse de replicação em uma ampla variedade de células humanas em divisão.

Protocolo

Este protocolo (Figura 1) utiliza principalmente linhagens de células cancerígenas U2OS aderentes, mas é adaptável a uma ampla variedade de células aderentes e em suspensão cultivadas em cultura de tecidos. As soluções e tampões usados neste estudo estão detalhados na Tabela 1. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de materiais

1. Antes do dia do experimento, coloque a garrafa fornecida com agarose de baixo ponto de fusão (1% de agarose de baixo ponto de fusão em PBS) em banho-maria por 5 a 10 minutos para garantir que a agarose derreta completamente.
   NOTA: Não aqueça a garrafa no micro-ondas.
2. Uma vez derretido, alíquota rápida de 100 μL da agarose para tubos de centrífuga de 1,5 mL conforme necessário e armazene os tubos a 4 °C. A agarose solidificada pode ser armazenada a 4 °C por até 1 ano.
3. No dia da experiência, retirar o número necessário de tubos de centrifugação da memória a 4 °C. Derreta a agarose colocando os tubos em um bloco de calor ou banho-maria a 42 °C.
   NOTA: Coloque os tubos a 42 °C antes de colher as células para garantir que a agarose esteja completamente derretida para ressuspensão (etapa 3.7).
4. Preparar um novo tampão de lise e tampão TAE no dia da experiência e armazená-los à temperatura ambiente e a 4 °C, respectivamente, até estarem prontos a utilizar. Além disso, alíquota 1x PBS em tubo cônico de 15 mL e coloque-o na geladeira para usar na etapa de ressuspensão (passo 3.5).
5. Marque as identificações de amostra na extremidade fosca das lâminas de cometa de 2 poços e armazene-as em temperatura ambiente até que estejam prontas para uso.

2. Preparação das amostras

1. Antes do dia do experimento, semeie as células em um prato de 6 poços e cultive durante a noite a 37 ° C com 5% de CO₂. Para células U2OS, aproximadamente 2-3 x 10⁵ células foram semeadas para cada amostra.
   NOTA: Os números das células podem precisar ser ajustados dependendo do tipo de célula usada para análises.
2. No dia do experimento, trate as células com as condições de acordo com o projeto experimental. Como controle positivo para demonstrar a indução de quebra dependente da replicação, trate as células com 1 μM de CPT por 1 h. O CPT é um inibidor da topoisomerase-1 que induz quebras de fita dupla de maneira dependente da replicação¹⁴.

3. Ressuspensão e lise celular

1. Aspire o meio de cultura celular e enxágue duas vezes com 1x PBS.
2. Adicione 300 μL de tripsina a cada poço. Incube o prato em uma incubadora de cultura de tecidos por 2-3 min.
   NOTA: A incubação prolongada em tripsina pode gerar resultados espúrios durante as análises de cometas.
3. Adicione 700 μL de meio de cultura celular a cada poço. Ressuspenda suavemente e transfira as amostras para tubos de centrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: A contagem de células nesta etapa é recomendada para obter a densidade celular apropriada na etapa 3.6 para reduzir a frequência de caudas sobrepostas durante a análise.
4. Centrifugue a suspensão da célula a 2400 x g por 5 min em temperatura ambiente.
5. Aspire o meio e ressuspenda as células em 1 mL de PBS 1x frio.
6. Repita a etapa 3.4 e a etapa 3.5 duas vezes e ressuspenda as células em PBS frio 1x a uma densidade celular de 2 x 10⁵ células por ml.
   NOTA: Recomenda-se avaliar a viabilidade celular nesta etapa para garantir que um número adequado de células viáveis esteja presente. Recomenda-se pelo menos 90% de viabilidade.
7. Ressuspender 10 μl da suspensão celular em alíquota de 100 μl de agarose derretida e, utilizando a mesma ponta de pipeta, misturar suavemente e espalhar a mistura uniformemente num dos alvéolos da lâmina. Repita esta etapa para todas as amostras, conforme necessário.
   NOTA: Evite remover todas as alíquotas do banho-maria a 42 °C de uma só vez para evitar que a agarose solidifique. Esta etapa deve ser realizada preferencialmente em banho-maria, e cada amostra é ressuspensa e espalhada de forma escalonada. Evite introduzir bolhas ao espalhar a agarose na lâmina, pois as bolsas de ar afetarão a migração das caudas do cometa durante a eletroforese (etapa 4.5) e introduzirão rachaduras na etapa de secagem (etapa 5.3)
8. Armazene as lâminas a 4 °C no escuro por 15-20 min para garantir que a agarose solidifique completamente (Figura 2A).
9. Coloque as lâminas em frascos Coplin e mergulhe as lâminas em tampão de lise por 1 h em temperatura ambiente.
10. Enxágue as lâminas uma vez com tampão TAE frio e mergulhe as lâminas em tampão TAE frio por 30 min a 4 °C.

4. Eletroforese

1. Configure a câmara eletroforética em uma superfície plana e nivele o sistema usando os quatro botões de nivelamento nas bordas do aparelho. Insira compressas frias na câmara inferior para manter a solução fria durante a eletroforese.
2. Despeje aproximadamente ~ 850 mL de tampão TAE 1x frio no aparelho.
3. Retirar as lâminas a 4 °C e colocá-las no tabuleiro de electroforese na orientação correcta para permitir a migração do ADN partido.
   NOTA: A bandeja comporta dez lâminas de 2 poços. Coloque as lâminas no centro da bandeja se estiver trabalhando com menos amostras. Se estiver trabalhando com um número ímpar de slides, inclua um slide em branco de modo que cada poço acomode 2 slides.
4. Coloque cuidadosamente a sobreposição da bandeja deslizante fornecida em cima da bandeja para cobrir as lâminas.
   NOTA: Para o funcionamento adequado do aparelho, o volume do tampão TAE não deve ser inferior à superfície inferior do revestimento e não deve exceder a superfície superior do revestimento.
5. Após conectar os cabos, ajuste a potência em 21 V e faça eletroforese (1 V/cm) por 40 min.
   NOTA: O tempo de eletroforese pode precisar ser ajustado dependendo do tipo de célula usada para análises. Caudas longas em amostras não tratadas indicam tempo de execução excessivo. Por outro lado, caudas curtas em amostras de controle positivo podem refletir tempo de execução insuficiente.

5. Coloração

1. Após a conclusão da eletroforese, remova as lâminas do aparelho e mergulhe-as em solução de precipitação de DNA por 30 min à temperatura ambiente.
2. Descarte a solução de precipitação de DNA e mergulhe as lâminas em solução de etanol a 70% por 30 minu em temperatura ambiente.
3. Descarte a solução de etanol a 70%. Remover as lâminas e secá-las em estufa de hibridização a 45 °C durante 30 min no escuro (figura 2B).
   NOTA: As lâminas podem ser deixadas em um local escuro e seco durante a noite para a etapa de secagem.
4. Incubar os poços com 100 μL de solução 1x SYBR Green por 30 min em temperatura ambiente no escuro.
5. Transvase a solução SYBR Green inclinando as lâminas e removendo o excesso esfregando suavemente a borda do poço com um pano sem fiapos.
6. Coloque as lâminas em uma gaveta e deixe secar por 30 min.
7. Prossiga com a imagem das lâminas.

6. Imagiologia e análises

1. Configure o microscópio para fins de imagem.
   NOTA: Todas as imagens foram adquiridas usando um microscópio de epifluorescência. A ampliação de 10x com abertura numérica de 0,45 foi usada com um tempo de exposição de 1/40s e um ganho de +6dB. O modo de captura de 8 bits monocromático foi utilizado com binning 2 x 2 e correção de balanço de preto.
2. Coloque as lâminas na platina do microscópio e comece a criar imagens usando o filtro FITC.
   NOTA: Use a amostra não tratada primeiro para testar o tempo de exposição. A maioria das células não exibe caudas de cometas, pois o DNA é mais compacto. Mude para o poço com células tratadas com CPT e imagem usando o mesmo tempo de exposição. Caudas de cometas com comprimentos aumentados serão observadas nesta amostra devido à migração de extremidades de DNA quebradas.
3. Adquira imagens de pelo menos 100 cometas por amostra usando o mesmo tempo de exposição em três réplicas técnicas.
   NOTA: As caudas dos cometas no final das lamínulas tendem a migrar de forma desigual e atuam como outliers na distribuição da amostra. A maioria dos cometas capturados para análises está presente perto do centro da lamínula (Figura 3).
4. Exporte imagens e marque os cometas manualmente (usando a Imagem J) ou usando o software de pontuação de cometas disponível gratuitamente. Os cometas que são individualmente distinguíveis e totalmente contidos no campo de visão são selecionados para pontuação. Cometas sobrepostos ou parcialmente visíveis não são considerados para análises posteriores (Figura 4).
   NOTA: Os usuários podem pontuar cometas na Imagem J usando o seguinte plugin: https://cometbio.org/index.html. Detalhes para pontuar cometas usando o software CometScore estão incluídos na Figura 5.
5. Plote os momentos da cauda adquiridos das análises como gráficos de caixa e bigode representando valores de percentil 10-90. Realize testes de normalidade para determinar se testes paramétricos ou não paramétricos devem ser utilizados para análises estatísticas.
   NOTA: Na maioria dos casos, os testes não paramétricos são aplicados usando o teste de Mann-Whitney se comparar apenas duas amostras ou o teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn se comparar três ou mais amostras.

Resultados

Análise da indução de quebra por reagentes de tensão de replicação
As células U2OS foram tratadas com DMSO, 4 de mM de hidroxiureia (HU) ou 100 nM de CPT por 4 h e analisadas quanto ao acúmulo de quebra pelo ensaio NC (Figura 6A). Enquanto o CPT induz quebras durante a fase S, bloqueando a topoisomerase-1¹³, a depleção induzida por HU de pools de nucleotídeos interrompe os garfos de replicação que são progressivamente convertidos em D...

Discussão

Este protocolo descreve um ensaio NC para avaliar quebras de DNA em células humanas submetidas a replicação ativa. O protocolo é relativamente simples de executar e os pesquisadores podem adaptá-lo prontamente a condições de pH alto para análises alcalinas⁸. Ele inclui duas etapas críticas, conforme descrito nas etapas 3.7 e 4.5. Na etapa 3.7, é essencial espalhar a agarose derretida com células uniformemente pelo poço para evitar que os cometas se sobreponham durante a análise. Certi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Gibco	14190144
Camptothecin	Selleckchem	S1288
Comet LMAgarose (LMA)	R&D systems	4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System II	R&D systems	4250-050-ES	Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore software	TriTek		open-sourced
CometSlide	R&D systems	4250-050-03
DMEM, high glucose	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	FisherSci	D128-4
Epifluorescence microscope	Keyence	BZ-X810
Fetal Bovine Serum - Premium	Bio-Techne	S11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
GraphPad Prism 10.0	GraphPad
HEK293T cells	ATCC	CRL-11268
hTERT-RPE-1 cells	ATCC	CRL-4000
Hydroxyurea	Millipore Sigma	H8627
PARP inhibitor Olaparib	Selleckchem	S8096
PowerPac	FisherSci	FB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate	FisherSci	FB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)	FisherSci	S7567
U2OS cells	ATCC	HTB-96
UVP HB-1000 Hybridization Incubator	FisherSci	UVP95003001