A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتوليد العضيات الوعائية باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

Abstract

تلخص العضيات الوعائية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) تنوع نوع الخلايا والهندسة المعمارية المعقدة لشبكات الأوعية الدموية البشرية. يحمل هذا النموذج ثلاثي الأبعاد (3D) إمكانات كبيرة لنمذجة أمراض الأوعية الدموية وفحص الأدوية في المختبر . على الرغم من التطورات الأخيرة ، لا يزال هناك تحد تقني رئيسي يتمثل في توليد العضيات بشكل متكرر بجودة متسقة ، وهو أمر بالغ الأهمية لفحوصات وتطبيقات المصب. هنا ، يتم تقديم بروتوكول معدل يحسن كلا من تجانس وقابلية التكاثر لتوليد العضيات الوعائية. يشتمل البروتوكول المعدل على استخدام الآبار الصغيرة وكوكتيل CEPT (chroman 1 ، emricasan ، polyamines ، ومثبط الاستجابة للإجهاد المتكامل ، عبر ISRIB) لتحسين تكوين الجسم الجنيني وبقاء الخلايا. تتميز العضيات الوعائية المتمايزة الناضجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول بفحص مجهري مناعي ثلاثي الأبعاد كامل لتحليل مورفولوجيتها والأوعية الدموية المعقدة. يتيح هذا البروتوكول إنتاج عضيات وعائية عالية الجودة بطريقة قابلة للتطوير ، مما قد يسهل استخدامها في نمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية.

Introduction

ظهرت نماذج الفيزيولوجيا الدقيقة في المختبر ، بما في ذلك الأنظمة العضوية والأنسجة على الرقاقة ، على مدار العقد الماضي1،2،3. تعالج هذه الأنظمة ثلاثية الأبعاد (3D) المشتقة من الخلايا البشرية القيود المفروضة على زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) والنماذج الحيوانية ، مثل عدم وجود العديد من المكونات في البيئة المكروية الفسيولوجية والاختلافات الجينية عبر الأنواع ، على التوالي. إنها توفر المزيد من الأفكار الفسيولوجية وهي أكثر ملاءمة لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية من النماذج التقليدية. من بين النماذج الفيزيولوجية الدقيقة ، ثبت أن العضي....

Protocol

يقدم الشكل 1 نظرة عامة على الخطوات المتضمنة في هذا البروتوكول. وترد معلومات مفصلة عن الكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يوصى بتسخين جميع الوسائط مسبقا عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع مواد ومستلزمات زراعة الخلايا إما معقمة أو معقمة ، ويجب أن تتم معالجة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعديل قيمة الأس الهيدروجيني لخليط الكولاجين I بعناية إلى درجة الحموضة 7.3 لتجنب مشكلات التصلب المحتملة.

1. صيانة iPSC البشرية

  1. قم بإذابة مستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي ....

النتائج

يعرض الشكل 1 أ مخطط هذا البروتوكول ، بما في ذلك المكونات الرئيسية المستخدمة في كل مرحلة. بدأ التمايز بتكوين EB ، تلاه تحريض الأديم المتوسط ومواصفات النسب الوعائي (الشكل 1B-D). نمت الركام بشكل أكبر وأقل كروية بمرور الوقت. بدأ?.......

Discussion

يتضمن البروتوكول الموصوف تعديلين رئيسيين للتوليد المتجانس والقابل للتكرار من العضيات الوعائية عالية الجودة. التعديل الأول هو استخدام لوحة microwell لتمكين التحكم بشكل أفضل في توحيد EB. كنقطة انطلاق لتمايز الأوعية الدموية ، يعد حجم EBs أمرا بالغ الأهمية لأنه ينظم مصير الخلايا.......

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن تقديرنا للدعم الفني من المورد المشترك للفحص المجهري المتحد البؤر والمتخصص لمركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان في جامعة كولومبيا ، والذي تم تمويله جزئيا من خلال منحة مركز المعاهد الوطنية للصحة (P30CA013696). هذا العمل مدعوم من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R21NS133635 ، Y.-H.L. ؛ UH3TR002151 ، ك. دبليو إل.). تم إنشاء الشكل 1 أ باستخدام BioRender.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)Gibco12587010thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4ProSpecCYT-081reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody abcamab28364dilution ratio: 1:400
CentrifugeEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1Tocris7163/10make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I Corning40236
Confocal MicroscopeNikonAXRMP/Ti2
Corning Elplasia PlatesCorning4441
Countess II FL automated cell counterThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco10565018
DMEM/F-12, powderGibco12500062make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGmake the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibodyCell Singali Technology97249dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2ProSpecCYT557reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)Gibco15710064
GlutaMAX supplement (100x)Gibco35050061
Heparin, 100 kUMilliporeSigma375095100KUreconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)Gibco15630080
IncubatorThermo Scientific13998123
Knockout Serum ReplacementGibco10828028thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning356230thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)Gibco11140050
Molecular Biology Grade WaterCorning46000CV
mTeSR plus kitSTEMCELL Technologies1001130thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)Gibco17502048thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)Cytiva HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713Sdilute with PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ antibodyR&DAF385dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)Sigma-AldrichP8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49SUNJIN LABRC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)Gibco25080094
Sodium deoxycholate monohydrateThermofisherJ6228822dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C

References

  1. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  2. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Griffith, L. G., Swartz, M. A.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

214

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved