توليد العضوية الوعائية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتوليد العضيات الوعائية باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

Abstract

تلخص العضيات الوعائية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) تنوع نوع الخلايا والهندسة المعمارية المعقدة لشبكات الأوعية الدموية البشرية. يحمل هذا النموذج ثلاثي الأبعاد (3D) إمكانات كبيرة لنمذجة أمراض الأوعية الدموية وفحص الأدوية في المختبر . على الرغم من التطورات الأخيرة ، لا يزال هناك تحد تقني رئيسي يتمثل في توليد العضيات بشكل متكرر بجودة متسقة ، وهو أمر بالغ الأهمية لفحوصات وتطبيقات المصب. هنا ، يتم تقديم بروتوكول معدل يحسن كلا من تجانس وقابلية التكاثر لتوليد العضيات الوعائية. يشتمل البروتوكول المعدل على استخدام الآبار الصغيرة وكوكتيل CEPT (chroman 1 ، emricasan ، polyamines ، ومثبط الاستجابة للإجهاد المتكامل ، عبر ISRIB) لتحسين تكوين الجسم الجنيني وبقاء الخلايا. تتميز العضيات الوعائية المتمايزة الناضجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول بفحص مجهري مناعي ثلاثي الأبعاد كامل لتحليل مورفولوجيتها والأوعية الدموية المعقدة. يتيح هذا البروتوكول إنتاج عضيات وعائية عالية الجودة بطريقة قابلة للتطوير ، مما قد يسهل استخدامها في نمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية.

Introduction

ظهرت نماذج الفيزيولوجيا الدقيقة في المختبر ، بما في ذلك الأنظمة العضوية والأنسجة على الرقاقة ، على مدار العقد الماضي^1،2،3. تعالج هذه الأنظمة ثلاثية الأبعاد (3D) المشتقة من الخلايا البشرية القيود المفروضة على زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) والنماذج الحيوانية ، مثل عدم وجود العديد من المكونات في البيئة المكروية الفسيولوجية والاختلافات الجينية عبر الأنواع ، على التوالي. إنها توفر المزيد من الأفكار الفسيولوجية وهي أكثر ملاءمة لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية من النماذج التقليدية. من بين النماذج الفيزيولوجية الدقيقة ، ثبت أن العضي....

Protocol

يقدم الشكل 1 نظرة عامة على الخطوات المتضمنة في هذا البروتوكول. وترد معلومات مفصلة عن الكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يوصى بتسخين جميع الوسائط مسبقا عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع مواد ومستلزمات زراعة الخلايا إما معقمة أو معقمة ، ويجب أن تتم معالجة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعديل قيمة الأس الهيدروجيني لخليط الكولاجين I بعناية إلى درجة الحموضة 7.3 لتجنب مشكلات التصلب المحتملة.

1. صيانة iPSC البشرية

1. قم بإذابة مستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي ....

النتائج

يعرض الشكل 1 أ مخطط هذا البروتوكول ، بما في ذلك المكونات الرئيسية المستخدمة في كل مرحلة. بدأ التمايز بتكوين EB ، تلاه تحريض الأديم المتوسط ومواصفات النسب الوعائي (الشكل 1B-D). نمت الركام بشكل أكبر وأقل كروية بمرور الوقت. بدأ?.......

Discussion

يتضمن البروتوكول الموصوف تعديلين رئيسيين للتوليد المتجانس والقابل للتكرار من العضيات الوعائية عالية الجودة. التعديل الأول هو استخدام لوحة microwell لتمكين التحكم بشكل أفضل في توحيد EB. كنقطة انطلاق لتمايز الأوعية الدموية ، يعد حجم EBs أمرا بالغ الأهمية لأنه ينظم مصير الخلايا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C