A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
يقدم هذا البروتوكول طريقة لتوليد العضيات الوعائية باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
تلخص العضيات الوعائية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) تنوع نوع الخلايا والهندسة المعمارية المعقدة لشبكات الأوعية الدموية البشرية. يحمل هذا النموذج ثلاثي الأبعاد (3D) إمكانات كبيرة لنمذجة أمراض الأوعية الدموية وفحص الأدوية في المختبر . على الرغم من التطورات الأخيرة ، لا يزال هناك تحد تقني رئيسي يتمثل في توليد العضيات بشكل متكرر بجودة متسقة ، وهو أمر بالغ الأهمية لفحوصات وتطبيقات المصب. هنا ، يتم تقديم بروتوكول معدل يحسن كلا من تجانس وقابلية التكاثر لتوليد العضيات الوعائية. يشتمل البروتوكول المعدل على استخدام الآبار الصغيرة وكوكتيل CEPT (chroman 1 ، emricasan ، polyamines ، ومثبط الاستجابة للإجهاد المتكامل ، عبر ISRIB) لتحسين تكوين الجسم الجنيني وبقاء الخلايا. تتميز العضيات الوعائية المتمايزة الناضجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول بفحص مجهري مناعي ثلاثي الأبعاد كامل لتحليل مورفولوجيتها والأوعية الدموية المعقدة. يتيح هذا البروتوكول إنتاج عضيات وعائية عالية الجودة بطريقة قابلة للتطوير ، مما قد يسهل استخدامها في نمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية.
ظهرت نماذج الفيزيولوجيا الدقيقة في المختبر ، بما في ذلك الأنظمة العضوية والأنسجة على الرقاقة ، على مدار العقد الماضي1،2،3. تعالج هذه الأنظمة ثلاثية الأبعاد (3D) المشتقة من الخلايا البشرية القيود المفروضة على زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) والنماذج الحيوانية ، مثل عدم وجود العديد من المكونات في البيئة المكروية الفسيولوجية والاختلافات الجينية عبر الأنواع ، على التوالي. إنها توفر المزيد من الأفكار الفسيولوجية وهي أكثر ملاءمة لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية من النماذج التقليدية. من بين النماذج الفيزيولوجية الدقيقة ، ثبت أن العضي....
يقدم الشكل 1 نظرة عامة على الخطوات المتضمنة في هذا البروتوكول. وترد معلومات مفصلة عن الكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يوصى بتسخين جميع الوسائط مسبقا عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع مواد ومستلزمات زراعة الخلايا إما معقمة أو معقمة ، ويجب أن تتم معالجة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعديل قيمة الأس الهيدروجيني لخليط الكولاجين I بعناية إلى درجة الحموضة 7.3 لتجنب مشكلات التصلب المحتملة.
1. صيانة iPSC البشرية
يعرض الشكل 1 أ مخطط هذا البروتوكول ، بما في ذلك المكونات الرئيسية المستخدمة في كل مرحلة. بدأ التمايز بتكوين EB ، تلاه تحريض الأديم المتوسط ومواصفات النسب الوعائي (الشكل 1B-D). نمت الركام بشكل أكبر وأقل كروية بمرور الوقت. بدأ?.......
يتضمن البروتوكول الموصوف تعديلين رئيسيين للتوليد المتجانس والقابل للتكرار من العضيات الوعائية عالية الجودة. التعديل الأول هو استخدام لوحة microwell لتمكين التحكم بشكل أفضل في توحيد EB. كنقطة انطلاق لتمايز الأوعية الدموية ، يعد حجم EBs أمرا بالغ الأهمية لأنه ينظم مصير الخلايا.......
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
نود أن نعرب عن تقديرنا للدعم الفني من المورد المشترك للفحص المجهري المتحد البؤر والمتخصص لمركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان في جامعة كولومبيا ، والذي تم تمويله جزئيا من خلال منحة مركز المعاهد الوطنية للصحة (P30CA013696). هذا العمل مدعوم من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R21NS133635 ، Y.-H.L. ؛ UH3TR002151 ، ك. دبليو إل.). تم إنشاء الشكل 1 أ باستخدام BioRender.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 711-546-152 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 705-606-147 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
B27 supplement minus vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle |
BMP4 | ProSpec | CYT-081 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
CD31 antibody | abcam | ab28364 | dilution ratio: 1:400 |
Centrifuge | Eppendorf | 022626001 | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423/10 | make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Chroman 1 | Tocris | 7163/10 | make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Collagen I | Corning | 40236 | |
Confocal Microscope | Nikon | AXRMP/Ti2 | |
Corning Elplasia Plates | Corning | 4441 | |
Countess II FL automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAF1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | |
DMEM/F-12, powder | Gibco | 12500062 | make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C. |
Edi042A | Cedars Sinai | ||
Emricasan | Medchemexpress LLC | HY1039610MG | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
ERG antibody | Cell Singali Technology | 97249 | dilution ratio: 1:400 |
Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | thaw at 4 °C and aliquot, store at -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month |
FGF2 | ProSpec | CYT557 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
Fluorodish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C |
Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15710064 | |
GlutaMAX supplement (100x) | Gibco | 35050061 | |
Heparin, 100 kU | MilliporeSigma | 375095100KU | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
Incubator | Thermo Scientific | 13998123 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828028 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x) | Gibco | 11140050 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | |
mTeSR plus kit | STEMCELL Technologies | 1001130 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
N2 supplement (100x) | Gibco | 17502048 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
NaOH solution (1 M) | Cytiva HyClone | SH31088.01 | |
NeuroBasal medium | Gibco | 21103049 | |
NIS-Elements, ver 5.42 | Nikon | ||
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research Labs | 17000121 | reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks |
paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713S | dilute with PBS |
PBST, 20x | Thermofisher | 28352 | |
PDGFRβ antibody | R&D | AF385 | dilution ratio: 1:400 |
polyamine supplement (1000x) | Sigma-Aldrich | P8483 | |
Rapiclear clearing reagent, 1.49 | SUNJIN LAB | RC149001 | |
Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080094 | |
Sodium deoxycholate monohydrate | Thermofisher | J6228822 | dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution |
TBST, 20x | Thermofisher | 28360 | |
trans-ISRIB | Tocris Bioscience | 5284/10 | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year. |
Tritin X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
VEGF-A | ProSpec | CYT-116 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved