인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

요약

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

초록

인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 혈관 오가노이드는 인간 혈관 네트워크의 세포 유형 다양성과 복잡한 구조를 요약합니다. 이 3차원(3D) 모델은 혈관 병리학 모델링 및 체외 약물 스크리닝에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 최근의 발전에도 불구하고 일관된 품질의 오가노이드를 재현성 있게 생성하는 것이 주요 기술적 과제로 남아 있으며, 이는 다운스트림 분석 및 응용 분야에 매우 중요합니다. 여기에서는 혈관 오가노이드 생성의 균질성과 재현성을 모두 향상시키는 수정된 프로토콜이 제시됩니다. 수정된 프로토콜은 배아체 형성 및 세포 생존을 개선하기 위해 마이크로웰과 CEPT 칵테일(크로만 1, 엠리카산, 폴리아민 및 통합 스트레스 반응 억제제, 트랜스-ISRIB)의 사용을 통합합니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 분화되고 성숙한 혈관 오가노이드는 전체 장착 3D 면역형광 현미경으로 특성화되어 형태 및 복잡한 혈관 구조를 분석합니다. 이 프로토콜은 확장 가능한 방식으로 고품질 혈관 오가노이드를 생산할 수 있도록 하여 잠재적으로 질병 모델링 및 약물 스크리닝 응용 분야에서 사용을 용이하게 할 수 있습니다.

서문

지난 10년 동안 오가노이드(organoid) 및 티슈온칩(tissue-on-a-chip) 시스템을 포함한 체외 미세생리학적 모델이 등장했습니다 ^1,2,3. 이러한 3차원(3D) 인간 세포 유래 시스템은 생리적 미세환경에 많은 구성 요소가 부족하고 종 간 유전적 차이와 같은 기존 2차원(2D) 세포 배양 및 동물 모델의 한계를 각각 해결합니다. 기존 모델보다 더 많은 생리학적 통찰력을 제공하고 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 더 적합합니다. 미세생리학적 모델 중 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 오가노이드는 천연 인간 조직의 구조적 특징을 효과적으로 재현하는 것으로 입증되었으며 뇌 ^4,5, 신장⁶, 간 ^7,8 및 망막⁹를 포함한 다양한 인간 장기를 모방하도록 개발되었습니다

프로토콜

그림 1 은 이 프로토콜과 관련된 단계의 개요를 보여줍니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약 및 재료에 대한 자세한 정보는 재료 표에 나와 있습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 매체는 사용하기 전에 37°C에서 예열하는 것이 좋습니다. 모든 세포 배양 물질 및 공급품은 고압멸균 또는 멸균 상태여야 하며, 세포 취급은 생물안전 작업대에서 이루어져야 합니다. 또한 콜라겐 I 혼합물의 pH 값은 가능한 응고 문제를 피하기 위해 pH 7.3으로 신중하게 조정해야 합니다.

1. 인체 iPSC 유지 관리

1. 기저막 매트릭스 추출물을 얼음에 해동하고 병을 부드럽게 흔들어 용액을 섞은 다음 P1000 피펫과 사전 냉장 팁을 사용하여 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 0.5mL 분취액을 만듭니다. 부분 표본을 -20 °C에서 최대 1년 동안 보관하십시오.
2. 매트릭스 추출물 1분취액(0.5mL)을 얼음에 해동합니다. 50mL 튜브에 49.5mL의 사전 냉각된 DMEM/F12 배지와 혼합합니다. 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰(1.5mL/웰)에 분배한 다음 플레....

토론

설명된 프로토콜에는 고품질 혈관 오가노이드의 균질하고 재현 가능한 생성을 위한 두 가지 주요 수정 사항이 포함되어 있습니다. 첫 번째 수정은 EB 균일성을 더 잘 제어할 수 있도록 마이크로웰 플레이트를 사용하는 것입니다. 혈관 분화의 시작점으로서 EB의 크기는 줄기세포의 운명과 다른 계통에 대한 분화 효능을 조절하기 때문에 매우 중요합니다. EB 크기의 변화는 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C