인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

요약

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

초록

인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 혈관 오가노이드는 인간 혈관 네트워크의 세포 유형 다양성과 복잡한 구조를 요약합니다. 이 3차원(3D) 모델은 혈관 병리학 모델링 및 체외 약물 스크리닝에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 최근의 발전에도 불구하고 일관된 품질의 오가노이드를 재현성 있게 생성하는 것이 주요 기술적 과제로 남아 있으며, 이는 다운스트림 분석 및 응용 분야에 매우 중요합니다. 여기에서는 혈관 오가노이드 생성의 균질성과 재현성을 모두 향상시키는 수정된 프로토콜이 제시됩니다. 수정된 프로토콜은 배아체 형성 및 세포 생존을 개선하기 위해 마이크로웰과 CEPT 칵테일(크로만 1, 엠리카산, 폴리아민 및 통합 스트레스 반응 억제제, 트랜스-ISRIB)의 사용을 통합합니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 분화되고 성숙한 혈관 오가노이드는 전체 장착 3D 면역형광 현미경으로 특성화되어 형태 및 복잡한 혈관 구조를 분석합니다. 이 프로토콜은 확장 가능한 방식으로 고품질 혈관 오가노이드를 생산할 수 있도록 하여 잠재적으로 질병 모델링 및 약물 스크리닝 응용 분야에서 사용을 용이하게 할 수 있습니다.

서문

지난 10년 동안 오가노이드(organoid) 및 티슈온칩(tissue-on-a-chip) 시스템을 포함한 체외 미세생리학적 모델이 등장했습니다 ^1,2,3. 이러한 3차원(3D) 인간 세포 유래 시스템은 생리적 미세환경에 많은 구성 요소가 부족하고 종 간 유전적 차이와 같은 기존 2차원(2D) 세포 배양 및 동물 모델의 한계를 각각 해결합니다. 기존 모델보다 더 많은 생리학적 통찰력을 제공하고 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 더 적합합니다. 미세생리학적 모델 중 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 오가노이드는 천연 인간 조직의 구조적 특징을 효과적으로 재현하는 것으로 입증되었으며 뇌 ^4,5, 신장⁶, 간 ^7,8 및 망막⁹를 포함한 다양한 인간 장기를 모방하도록 개발되었습니다. 여기에서는 특히 hiPSC에서 혈관 오가노이드 생성에 중점을 두고 서로 다른 오가노이드 샘플과 배치 간의 변동을 최소화하여 전반적인 재현성을 개선하는 것을 목표로 하는 간소화된 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

혈관은 모든 인체 장기에서 생리적 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 혈관 형성은 혈관 형성 및 혈관 형성 과정을 포함하며, 내피 세포와 벽화 (예 : pericyte 및 vascular smooth muscle cells) 세포 간의 상호 작용을 통해 조정되고 다양한 자극의 영향을받습니다¹⁰. Penninger, Wimmer 및 동료들은 이 두 가지 과정을 모방한 최초의 혈관 오가노이드 생성 방법^11,12을 개발했습니다. 이 방법에서 생성된 오가노이드를 통해 그룹¹² 및 us^13,14는 질병의 혈관 기능 장애를 모델링하기 위한 혈관 오가노이드의 잠재력을 입증했습니다. 예를 들어, 우리의 최근 연구^13,14에서는 질병을 모방하는 혈관 오가노이드와 야생형 오가노이드 간에 혈관 발아 및 벽화 세포 구성 변화와 같은 뚜렷한 표현형이 관찰되었습니다. 이러한 예는 혈관 오가노이드 모델이 질병 관련 혈관 기능 장애를 모방하여 약물 스크리닝을 위한 플랫폼 역할을 할 수 있음을 강조합니다.

초기 혈관 오가노이드 생성 작업^11,12를 기반으로 구축된 수정된 프로토콜은 동일한 오가노이드 생성 배치 내에서 종종 볼 수 있는 변동을 최소화하는 데 중요한 요소인 균질한 배아체(EB) 형성을 촉진하기 위한 마이크로웰의 사용을 포함하는 것으로 제시됩니다. 또한 크로만 1, 엠리카산, 폴리아민 및 통합 스트레스 반응 억제제(trans-ISRIB)¹⁵의 조합인 CEPT 칵테일은 EB 형성 과정에서 hiPSC 및 분화된 세포의 생존력을 향상시키는 데 사용됩니다. 이 수정은 주로 서로 다른 오가노이드 샘플과 배치 간의 변동을 줄이기 위한 것입니다. 이 약 2주간의 프로토콜로 균일한 혈관 오가노이드를 생산할 수 있으며, 여기서 혈관 형성을 유도하여 1일차에 내피가 원시 세관 네트워크로 조직화되도록 돕고, 5일차에 혈관 신생 유도를 통해 오가노이드에서 복잡한 혈관 네트워크를 발달시킵니다. 12-15일째에 생성된 오가노이드는 내피 세포와 벽화 세포로 구성된 성숙한 혈관 네트워크를 보여야 합니다.

프로토콜

그림 1 은 이 프로토콜과 관련된 단계의 개요를 보여줍니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약 및 재료에 대한 자세한 정보는 재료 표에 나와 있습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 매체는 사용하기 전에 37°C에서 예열하는 것이 좋습니다. 모든 세포 배양 물질 및 공급품은 고압멸균 또는 멸균 상태여야 하며, 세포 취급은 생물안전 작업대에서 이루어져야 합니다. 또한 콜라겐 I 혼합물의 pH 값은 가능한 응고 문제를 피하기 위해 pH 7.3으로 신중하게 조정해야 합니다.

1. 인체 iPSC 유지 관리

1. 기저막 매트릭스 추출물을 얼음에 해동하고 병을 부드럽게 흔들어 용액을 섞은 다음 P1000 피펫과 사전 냉장 팁을 사용하여 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 0.5mL 분취액을 만듭니다. 부분 표본을 -20 °C에서 최대 1년 동안 보관하십시오.
2. 매트릭스 추출물 1분취액(0.5mL)을 얼음에 해동합니다. 50mL 튜브에 49.5mL의 사전 냉각된 DMEM/F12 배지와 혼합합니다. 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰(1.5mL/웰)에 분배한 다음 플레이트를 부드럽게 흔들어 액체 용액이 전체 웰을 덮도록 합니다. 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
3. 표 1에 설명된 대로 hiPSC 확장 매체를 준비합니다. 전체 배지(40mL/튜브)의 부분 표본을 만들고 -20°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
4. 사전 코팅된 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 hiPSC 배양 1시간 전에 넣습니다.
5. 37°C에서 hiPSC 팽창 배지(40mL)를 사전 데우고 표 2에 설명된 대로 hiPSC 파종 배지를 준비합니다.
6. 코팅된 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 생물안전 작업대로 옮깁니다. 코팅된 플레이트의 배지를 hiPSC 파종 배지(1mL/웰)로 교체합니다.
7. 극저온 탱크에서 hiPSC의 냉동 보존된 바이알을 37°C 수조에서 1분 동안 해동합니다.
8. 세포를 15mL 튜브에 옮긴 다음 5mL의 DMEM/F12 배지를 첨가한 다음 실온에서 3분 동안 100 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집합니다.
9. 상층액을 흡인하고 1.5mL의 hiPSC 파종 배지로 세포를 재현탁시킵니다. 15mL 튜브의 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.
10. 세포 현탁액 10μL를 분취하고 10μL의 트리판 블루 용액과 혼합합니다. 10μL 혼합물을 혈구계 슬라이드로 옮기고 커버슬립으로 덮습니다.
11. 슬라이드를 홀더에 장착하고 자동 셀 카운터에 삽입합니다. 측량기가 초점을 찾을 때까지 기다리거나 화면의 초점 +/- 버튼을 눌러 수동으로 초점을 조정합니다. 그런 다음 기본 설정을 사용하고 캡처 버튼을 누릅니다. LIVE 세포 밀도 판독 값을 1.9단계에서 준비한 hiPSC 현탁액의 농도로 사용합니다.
12. 각 웰에 2 × 10⁵ 개의 세포를 파종하고 세포가 웰에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
13. 37°C에서 5%_CO2 로 세포를 배양하고 24시간 후에 배지를 hiPSC 팽창 배지(1.5mL/웰)로 교체합니다.
14. 세포가 80%의 밀도에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하십시오. 세포 형태와 콜로니 크기를 정기적으로 확인하여 자발적인 분화가 발생하지 않도록 합니다. 배양액을 폐기하고 광범위한(>5%) 자발적 분화가 관찰되는 경우 새로운 hiPSC 배치로 다시 시작합니다.

2. EB 형성 (Day 0)

1. 0일차에 DMEM/F12 배지, hiPSC 파종 배지 및 세포 분리 용액을 준비하고 37°C에서 20-30분 동안 사전 예열합니다.
2. 6-웰 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 예열된 세포 분리 용액(1.5mL/웰)을 추가합니다. 37°C에서 5-7분 동안 플레이트를 배양합니다.
3. 플레이트를 생물안전 작업대로 옮기고 플레이트를 두드려 hiPSC 콜로니를 분리하고 응집체를 분해합니다.
4. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 옮깁니다. DMEM/F12 배지 4.5mL를 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 거품이 발생하지 않도록 합니다.
5. 실온에서 100 x g 으로 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
6. 상층액을 흡입하고 P1000 피펫을 사용하여 1mL의 hiPSC 파종 배지로 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.
7. 세포 계수를 위해 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루 용액을 혼합합니다. 혼합물 10μL를 혈구계 슬라이드로 옮기고 커버슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 홀더에 장착하고 자동 셀 카운터에 삽입합니다. 기기가 초점을 찾은 후 Capture 버튼을 누르고 LIVE 세포 밀도 판독 값을 사용하여 hiPSC 현탁액의 농도를 측정합니다.
8. 밀도가 2.7 × 10⁵ cells/well인 초저 부착 원형 바닥 마이크로웰 플레이트에 세포를 파종하여 EB당 500-1,000개의 세포를 생성합니다.
9. 각 웰에 2mL의 hiPSC 파종 배지를 추가하고 용액을 부드럽게 혼합하여 세포가 고르게 분포되도록 합니다.
10. 37 ° C에서 24 시간 동안 5 % CO₂ 로 세포를 배양합니다.

3. 혈관 분화(Day 1 - 5)

1. 1일차에 표 3 및 표 4 에 기재된 바와 같이 중배엽 유도 매체(MIM)를 준비하고 37°C에서 20분 동안 예열한다. MIM 매체는 새로 만들어야 합니다.
2. P200 피펫을 사용하여 하단의 EB를 방해하지 않고 마이크로웰 플레이트에서 매체를 조심스럽게 흡입합니다.
3. P2.5 피펫을 사용하여 200mL의 MIM을 천천히 추가합니다. 37 ° C에서 2 일 동안 5 % CO₂ 로 MIM의 EB를 배양합니다.
4. 3일째에는 마이크로웰 바닥의 EB를 방해하지 않고 미리 따뜻하게 만든 갓 만든 2.5mL의 혈관 분화 배지 1(VDM1, 표 5)로 배지를 부드럽게 교체합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 2 일 더 세포를 배양합니다.

4. 하이드로겔 임베딩(5일차)

1. 표 6에 기재된 바와 같이 콜라겐 I 혼합물을 제조한다. 얼음 위에 50mL 튜브를 놓고 콜라겐 I 용액, H₂O, 10× DMEM / F12 매체, 중탄산 나트륨 및 HEPES를 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 잘 섞는다. 혼합 용액을 흔들면서 1M NaOH 용액을 적가하여 pH 값을 7.3으로 조정하고 pH 측정기로 혼합물의 pH 값을 확인합니다.
   알림: 모든 용액은 사용하기 전에 얼음으로 미리 냉각해야 합니다. 항상 생물 안전 캐비닛의 얼음 위에서 절차를 수행하십시오. NaOH 용액을 추가하는 것이 중요하며, 콜라겐 I의 국소 경화를 피하기 위해 균질한 용액을 만들기 위한 빠른 분산이 필요합니다. NaOH의 부피는 사용된 콜라겐 I 용액의 로트 수에 따라 달라질 수 있습니다. 전단 응력으로 인해 원치 않는 사전 경화가 발생할 수 있으므로 혼합을 위해 세게 피펫하지 마십시오.
2. 표 7에 기재된 바와 같이 콜라겐 I-기저막 매트릭스 혼합물을 준비한다. 1.25 mL의 기저막 매트릭스를 4.1 단계에서 준비한 5mL 콜라겐 I 혼합물에 첨가합니다. 튜브를 흔들어 용액을 부드럽게 섞습니다.
3. 12웰 플레이트를 얼음 위에 2분 동안 놓습니다.
4. 와이드 보어 팁을 사용하여 콜라겐 I-basement membrane matrix 혼합물을 12-well plate(1.5mL/well)에 천천히 추가합니다. 혼합물이 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
5. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 2시간 동안 넣어 하이드로겔의 첫 번째 층을 응고시킵니다.
6. 나중에 사용할 수 있도록 남은 콜라겐 I-기저막 매트릭스 혼합물을 얼음에 보관하십시오.
7. ~60개의 세포 응집체를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 옮기고 튜브를 얼음으로 5분 동안 냉각합니다. P200 피펫 팁으로 배지를 조심스럽게 제거합니다.
   알림: 1.5단계 후 4.5시간 후에 이 단계를 시작합니다.
8. 골재에 1.5mL의 콜라겐 I-기저막 혼합물을 넣고 구경이 넓은 P200 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.
9. 인큐베이터(단계 4.5)에서 하이드로겔의 첫 번째 층이 있는 플레이트를 생물안전 작업대로 옮깁니다.
10. 경화된 층에 1.5mL의 응집체 현탁액을 추가합니다. 골재가 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 거품이 발생하지 않도록 합니다.
11. 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 플레이트를 2 시간 더 배양합니다.
12. 혈관 분화 배지 2(VDM2; 표 8) 사용하기 전에 37°C 수조에서 20분 동안 매체를 예열합니다.
13. 각 웰에 2mL의 VDM2를 추가하고 37 ° C에서 5 % CO 2 로 세포를 배양_합니다.
14. 미리 따뜻해진 갓 만든 VDM2로 3일마다 매체를 교체합니다.
    참고: (선택 사항) 혈관 오가노이드는 주사기 바늘로 겔을 제거하여 겔 혼합물에서 방출할 수 있습니다. 겔에서 회수한 혈관 오가노이드는 VDM2(200 μL/well)가 있는 96웰 플레이트에서 개별적으로 유지할 수 있습니다. 2-3일마다 매체를 교체하십시오.

5. 3D Immunofluorescent assay (면역형광 분석)

1. 혈관 오가노이드는 대략 13일째에 성숙해야 합니다. 하이드로겔에 내장된 오가노이드의 경우 배지를 조심스럽게 흡입하고 2mL PBS로 3회(매회 10분) 세척합니다. 겔에서 회수한 오가노이드의 경우(4.14단계 후) 2mL 미세 원심분리기 튜브에 6-10개의 오가노이드를 수집하고 배지를 흡입한 다음 2mL PBS로 3회(각 10분) 세척합니다.
2. 4% 파라포름알데히드(PFA) 2mL를 샘플에 넣고 파라핀 필름 밀봉으로 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. PFA 용액을 제거하고 샘플을 2mL PBS로 4회(매회 15분) 세척합니다.
4. 차단 완충액 2mL(표 9)를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
5. 차단 완충액을 제거하고 1.5mL의 1차 항체를 추가합니다(항체 정보는 재료 표 참조, 항체는 차단 완충액에 희석해야 함). 4 °C에서 2 일 동안 부드럽게 흔들어 1 차 항체가 있는 샘플을 배양합니다.
   참고: 1차 항체(CD31, PDGFRβ, ERG1)는 차단 완충액에 1:400의 비율로 희석하는 것이 권장됩니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
6. 1차 항체 용액을 제거하고 2mL PBST로 1시간 동안 6회 세척합니다.
7. 2mL의 2차 항체(항체 정보는 재료 표 참조, 항체는 PBST에 희석해야 함)를 샘플에 추가합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 4°C에서 부드럽게 흔들어 2일 동안 배양합니다.
   참고: 2차 항체는 PBST에 1:1000의 비율로 희석하는 것이 권장됩니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 배양하는 동안 접시를 빛으로부터 유지하고 나중에 이 단계에서 세척하십시오.
8. 2차 항체 용액을 제거하고 2mL TBST로 6회(매회 1시간) 세척합니다. 핵 염색이 필요한 경우 마지막 세척 단계에 사용된 세척 버퍼에 DAPI(1μg/mL)를 추가합니다.
9. 이러한 겔 포매 오가노이드의 경우 겔을 4조각으로 자르고 주걱으로 2mL 미세 원심분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 검색된 오가노이드의 경우 세척 버퍼를 제거합니다.
10. 물티슈를 사용하여 겔이나 오가노이드를 건드리지 않고 남은 용액을 흡수하십시오.
11. 각 튜브에 수용성 조직 투명화 시약 2mL(굴절 지수 = 1.49)를 추가합니다. 오가노이드가 투명해질 때까지(보통 하룻밤) 어두운 어두운 곳에서 투명화 시약으로 샘플을 배양합니다. 샘플을 흔들지 마십시오.
12. 투명화 시약이 있는 오가노이드를 주걱을 사용하여 유리 바닥 접시의 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다.
13. 오가노이드 또는 젤 조각을 24mm × 24mm 커버슬립으로 덮습니다.
14. 커버슬립이 평평하게 놓일 때까지 부드럽게 아래로 누르고 샘플을 유리 바닥에 끼웁니다.
15. 접시에 있는 여분의 투명화 시약을 제거하고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
16. 3D 이미징의 경우 10× 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경을 사용하십시오. 타일 스캔 및 Z-스택 스캔을 사용하여 오가노이드의 전체 마운트 이미지를 얻을 수 있습니다.

결과

그림 1A는 각 단계에서 사용되는 주요 구성 요소를 포함하여 이 프로토콜의 체계를 보여줍니다. 분화는 EB 형성으로 시작하여 중배엽 유도 및 혈관 계통 사양이 뒤따랐습니다(그림 1B-D). 응집체는 시간이 지남에 따라 더 커지고 구형이 줄어들었습니다. 오가노이드는 5일째에 거친 가장자리를 보이기 시?...

토론

설명된 프로토콜에는 고품질 혈관 오가노이드의 균질하고 재현 가능한 생성을 위한 두 가지 주요 수정 사항이 포함되어 있습니다. 첫 번째 수정은 EB 균일성을 더 잘 제어할 수 있도록 마이크로웰 플레이트를 사용하는 것입니다. 혈관 분화의 시작점으로서 EB의 크기는 줄기세포의 운명과 다른 계통에 대한 분화 효능을 조절하기 때문에 매우 중요합니다. EB 크기의 변화는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C