Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
* Эти авторы внесли равный вклад
В этом протоколе представлен метод получения сосудистых органоидов с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека.
Сосудистые органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), повторяют разнообразие типов клеток и сложную архитектуру сосудистых сетей человека. Эта трехмерная (3D) модель обладает значительным потенциалом для моделирования сосудистой патологии и скрининга лекарственных препаратов in vitro . Несмотря на последние достижения, ключевой технической проблемой остается воспроизводимое получение органоидов стабильного качества, что имеет решающее значение для последующих анализов и приложений. Здесь представлен модифицированный протокол, который улучшает как однородность, так и воспроизводимость генерации сосудистых органоидов. Модифицированный протокол включает в себя использование микролунок и коктейля CEPT (хроман 1, эмриказан, полиамины и интегрированный ингибитор реакции на стресс, транс-ISRIB) для улучшения формирования эмбриоидных тел и выживаемости клеток. Дифференцированные, зрелые сосудистые органоиды, полученные с использованием этого протокола, характеризуются 3D-иммунофлуоресцентной микроскопией для анализа их морфологии и сложной сосудистой системы. Этот протокол позволяет производить высококачественные сосудистые органоиды масштабируемым образом, потенциально облегчая их использование в моделировании заболеваний и скрининге лекарств.
Микрофизиологические модели in vitro, включая органоидные системы и системы «ткань на чипе», появились за последнее десятилетие 1,2,3. Эти трехмерные (3D) системы, полученные из человеческих клеток, устраняют ограничения обычных двумерных (2D) клеточных культур и животных моделей, такие как отсутствие многих компонентов в физиологическом микроокружении и генетические различия между видами, соответственно. Они дают больше физиологических знаний и больше подходят для моделирования заболеваний и скрининга лекарств, чем обычные модели. С....
На рисунке 1 представлен обзор шагов, связанных с этим протоколом. Подробная информация о реагентах и материалах, используемых в этом протоколе, приведена в Таблице материалов. Рекомендуется предварительно нагреть все носители до 37 °C перед использованием, если не указано иное. Все материалы и принадлежности для клеточных культур должны быть либо автоклавными, либо стерильными, а работа с клетками должна производиться в шкафу биобезопасности. Кроме того, значение pH смеси коллагена I должно быть тщательно отрегулировано до pH 7,3, чтобы избежать возможных проблем с затвердеванием.
На рисунке 1А представлена схема этого протокола, включая ключевые компоненты, используемые на каждом этапе. Дифференцировка началась с формирования БЭ, за которой последовала индукция мезодермы и уточнение сосудистой линии (Рисунок 1B-D
Описанный протокол включает в себя две ключевые модификации для гомогенной и воспроизводимой генерации высококачественных сосудистых органоидов. Первая модификация заключается в использовании микролуночного планшета для лучшего контроля однородности EB. В качест?.......
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Мы хотели бы выразить признательность за техническую поддержку со стороны совместного ресурса по конфокальной и специализированной микроскопии Комплексного онкологического центра Герберта Ирвинга при Колумбийском университете, частично финансируемой за счет гранта Центра NIH (P30CA013696). Эта работа поддержана NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Рисунок 1А был создан с помощью BioRender.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 711-546-152 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Labs | 705-606-147 | reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol, store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000 |
B27 supplement minus vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle |
BMP4 | ProSpec | CYT-081 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
CD31 antibody | abcam | ab28364 | dilution ratio: 1:400 |
Centrifuge | Eppendorf | 022626001 | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423/10 | make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Chroman 1 | Tocris | 7163/10 | make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
Collagen I | Corning | 40236 | |
Confocal Microscope | Nikon | AXRMP/Ti2 | |
Corning Elplasia Plates | Corning | 4441 | |
Countess II FL automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAF1000 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | |
DMEM/F-12, powder | Gibco | 12500062 | make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C. |
Edi042A | Cedars Sinai | ||
Emricasan | Medchemexpress LLC | HY1039610MG | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year. |
ERG antibody | Cell Singali Technology | 97249 | dilution ratio: 1:400 |
Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | thaw at 4 °C and aliquot, store at -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month |
FGF2 | ProSpec | CYT557 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C |
Fluorodish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C |
Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15710064 | |
GlutaMAX supplement (100x) | Gibco | 35050061 | |
Heparin, 100 kU | MilliporeSigma | 375095100KU | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
Incubator | Thermo Scientific | 13998123 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828028 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix | Corning | 356230 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x) | Gibco | 11140050 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | |
mTeSR plus kit | STEMCELL Technologies | 1001130 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
N2 supplement (100x) | Gibco | 17502048 | thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle |
NaOH solution (1 M) | Cytiva HyClone | SH31088.01 | |
NeuroBasal medium | Gibco | 21103049 | |
NIS-Elements, ver 5.42 | Nikon | ||
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research Labs | 17000121 | reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks |
paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713S | dilute with PBS |
PBST, 20x | Thermofisher | 28352 | |
PDGFRβ antibody | R&D | AF385 | dilution ratio: 1:400 |
polyamine supplement (1000x) | Sigma-Aldrich | P8483 | |
Rapiclear clearing reagent, 1.49 | SUNJIN LAB | RC149001 | |
Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080094 | |
Sodium deoxycholate monohydrate | Thermofisher | J6228822 | dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution |
TBST, 20x | Thermofisher | 28360 | |
trans-ISRIB | Tocris Bioscience | 5284/10 | make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year. |
Tritin X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
VEGF-A | ProSpec | CYT-116 | reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены