Генерация сосудистых органоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Резюме

В этом протоколе представлен метод получения сосудистых органоидов с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека.

Аннотация

Сосудистые органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), повторяют разнообразие типов клеток и сложную архитектуру сосудистых сетей человека. Эта трехмерная (3D) модель обладает значительным потенциалом для моделирования сосудистой патологии и скрининга лекарственных препаратов in vitro . Несмотря на последние достижения, ключевой технической проблемой остается воспроизводимое получение органоидов стабильного качества, что имеет решающее значение для последующих анализов и приложений. Здесь представлен модифицированный протокол, который улучшает как однородность, так и воспроизводимость генерации сосудистых органоидов. Модифицированный протокол включает в себя использование микролунок и коктейля CEPT (хроман 1, эмриказан, полиамины и интегрированный ингибитор реакции на стресс, транс-ISRIB) для улучшения формирования эмбриоидных тел и выживаемости клеток. Дифференцированные, зрелые сосудистые органоиды, полученные с использованием этого протокола, характеризуются 3D-иммунофлуоресцентной микроскопией для анализа их морфологии и сложной сосудистой системы. Этот протокол позволяет производить высококачественные сосудистые органоиды масштабируемым образом, потенциально облегчая их использование в моделировании заболеваний и скрининге лекарств.

Введение

Микрофизиологические модели in vitro, включая органоидные системы и системы «ткань на чипе», появились за последнее десятилетие ^1,2,3. Эти трехмерные (3D) системы, полученные из человеческих клеток, устраняют ограничения обычных двумерных (2D) клеточных культур и животных моделей, такие как отсутствие многих компонентов в физиологическом микроокружении и генетические различия между видами, соответственно. Они дают больше физиологических знаний и больше подходят для моделирования заболеваний и скрининга лекарств, чем обычные модели. С....

протокол

На рисунке 1 представлен обзор шагов, связанных с этим протоколом. Подробная информация о реагентах и материалах, используемых в этом протоколе, приведена в Таблице материалов. Рекомендуется предварительно нагреть все носители до 37 °C перед использованием, если не указано иное. Все материалы и принадлежности для клеточных культур должны быть либо автоклавными, либо стерильными, а работа с клетками должна производиться в шкафу биобезопасности. Кроме того, значение pH смеси коллагена I должно быть тщательно отрегулировано до pH 7,3, чтобы избежать возможных проблем с затвердеванием.

Результаты

На рисунке 1А представлена схема этого протокола, включая ключевые компоненты, используемые на каждом этапе. Дифференцировка началась с формирования БЭ, за которой последовала индукция мезодермы и уточнение сосудистой линии (Рисунок 1B-D

Обсуждение

Описанный протокол включает в себя две ключевые модификации для гомогенной и воспроизводимой генерации высококачественных сосудистых органоидов. Первая модификация заключается в использовании микролуночного планшета для лучшего контроля однородности EB. В качест?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C