Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе представлен метод получения сосудистых органоидов с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека.

Аннотация

Сосудистые органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), повторяют разнообразие типов клеток и сложную архитектуру сосудистых сетей человека. Эта трехмерная (3D) модель обладает значительным потенциалом для моделирования сосудистой патологии и скрининга лекарственных препаратов in vitro . Несмотря на последние достижения, ключевой технической проблемой остается воспроизводимое получение органоидов стабильного качества, что имеет решающее значение для последующих анализов и приложений. Здесь представлен модифицированный протокол, который улучшает как однородность, так и воспроизводимость генерации сосудистых органоидов. Модифицированный протокол включает в себя использование микролунок и коктейля CEPT (хроман 1, эмриказан, полиамины и интегрированный ингибитор реакции на стресс, транс-ISRIB) для улучшения формирования эмбриоидных тел и выживаемости клеток. Дифференцированные, зрелые сосудистые органоиды, полученные с использованием этого протокола, характеризуются 3D-иммунофлуоресцентной микроскопией для анализа их морфологии и сложной сосудистой системы. Этот протокол позволяет производить высококачественные сосудистые органоиды масштабируемым образом, потенциально облегчая их использование в моделировании заболеваний и скрининге лекарств.

Введение

Микрофизиологические модели in vitro, включая органоидные системы и системы «ткань на чипе», появились за последнее десятилетие 1,2,3. Эти трехмерные (3D) системы, полученные из человеческих клеток, устраняют ограничения обычных двумерных (2D) клеточных культур и животных моделей, такие как отсутствие многих компонентов в физиологическом микроокружении и генетические различия между видами, соответственно. Они дают больше физиологических знаний и больше подходят для моделирования заболеваний и скрининга лекарств, чем обычные модели. С....

протокол

На рисунке 1 представлен обзор шагов, связанных с этим протоколом. Подробная информация о реагентах и материалах, используемых в этом протоколе, приведена в Таблице материалов. Рекомендуется предварительно нагреть все носители до 37 °C перед использованием, если не указано иное. Все материалы и принадлежности для клеточных культур должны быть либо автоклавными, либо стерильными, а работа с клетками должна производиться в шкафу биобезопасности. Кроме того, значение pH смеси коллагена I должно быть тщательно отрегулировано до pH 7,3, чтобы избежать возможных проблем с затвердеванием.

Результаты

На рисунке 1А представлена схема этого протокола, включая ключевые компоненты, используемые на каждом этапе. Дифференцировка началась с формирования БЭ, за которой последовала индукция мезодермы и уточнение сосудистой линии (Рисунок 1B-D

Обсуждение

Описанный протокол включает в себя две ключевые модификации для гомогенной и воспроизводимой генерации высококачественных сосудистых органоидов. Первая модификация заключается в использовании микролуночного планшета для лучшего контроля однородности EB. В качест?.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность за техническую поддержку со стороны совместного ресурса по конфокальной и специализированной микроскопии Комплексного онкологического центра Герберта Ирвинга при Колумбийском университете, частично финансируемой за счет гранта Центра NIH (P30CA013696). Эта работа поддержана NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Рисунок 1А был создан с помощью BioRender.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)Gibco12587010thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4ProSpecCYT-081reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody abcamab28364dilution ratio: 1:400
CentrifugeEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1Tocris7163/10make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I Corning40236
Confocal MicroscopeNikonAXRMP/Ti2
Corning Elplasia PlatesCorning4441
Countess II FL automated cell counterThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco10565018
DMEM/F-12, powderGibco12500062make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGmake the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibodyCell Singali Technology97249dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2ProSpecCYT557reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)Gibco15710064
GlutaMAX supplement (100x)Gibco35050061
Heparin, 100 kUMilliporeSigma375095100KUreconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)Gibco15630080
IncubatorThermo Scientific13998123
Knockout Serum ReplacementGibco10828028thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning356230thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)Gibco11140050
Molecular Biology Grade WaterCorning46000CV
mTeSR plus kitSTEMCELL Technologies1001130thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)Gibco17502048thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)Cytiva HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713Sdilute with PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ antibodyR&DAF385dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)Sigma-AldrichP8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49SUNJIN LABRC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)Gibco25080094
Sodium deoxycholate monohydrateThermofisherJ6228822dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C

Ссылки

  1. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  2. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Griffith, L. G., Swartz, M. A.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

214

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены