Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Riepilogo

Questo protocollo presenta un metodo per generare organoidi vascolari utilizzando cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

Gli organoidi vascolari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) ricapitolano la diversità dei tipi cellulari e la complessa architettura delle reti vascolari umane. Questo modello tridimensionale (3D) ha un notevole potenziale per la modellazione della patologia vascolare e lo screening dei farmaci in vitro . Nonostante i recenti progressi, rimane una sfida tecnica fondamentale per la generazione riproducibile di organoidi con una qualità costante, che è fondamentale per i saggi e le applicazioni a valle. Qui viene presentato un protocollo modificato che migliora sia l'omogeneità che la riproducibilità della generazione di organoidi vascolari. Il protocollo modificato incorpora l'uso di micropozzetti e del cocktail CEPT (chroman 1, emricasan, poliammine e l'inibitore integrato della risposta allo stress, trans-ISRIB) per migliorare la formazione del corpo embrioide e la sopravvivenza cellulare. Gli organoidi vascolari maturi e differenziati generati utilizzando questo protocollo sono caratterizzati dalla microscopia a immunofluorescenza 3D a montaggio intero per analizzarne la morfologia e la vascolarizzazione complessa. Questo protocollo consente la produzione di organoidi vascolari di alta qualità in modo scalabile, facilitando potenzialmente il loro utilizzo nella modellazione delle malattie e nelle applicazioni di screening dei farmaci.

Introduzione

Nell'ultimo decennio sono emersi modelli microfisiologici in vitro, inclusi organoidi e sistemi tissue-on-a-chip ^1,2,3. Questi sistemi tridimensionali (3D) derivati da cellule umane affrontano i limiti delle colture cellulari bidimensionali convenzionali (2D) e dei modelli animali, come la mancanza di molti componenti nel microambiente fisiologico e le differenze genetiche tra le specie, rispettivamente. Forniscono più informazioni fisiologiche e sono più adatti per la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci rispetto ai modelli convenzionali. Tra i modelli microfisiologici, è stato dimostrato che gli organoidi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) ricapitolano efficacemente le caratteristiche architettoniche dei tessuti umani nativi e sono stati sviluppati per imitare diversi organi umani, tra cui il cervello ^4,5, il rene⁶, il fegato ^7,8 e la retina⁹. Qui, ci concentriamo in particolare sulla generazione di organoidi vascolari da hiPSC e delineiamo un protocollo semplificato che mira a ridurre al minimo le variazioni tra diversi campioni e lotti di organoidi, migliorando così la riproducibilità complessiva.

La vascolarizzazione svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi fisiologica in tutti gli organi umani. La formazione del sistema vascolare coinvolge i processi di vasculogenesi e angiogenesi, orchestrati attraverso le interazioni tra cellule endoteliali e murali (ad esempio, periciti e cellule muscolari lisce vascolari) e influenzati da vari stimoli¹⁰. Penninger, Wimmer e colleghi hanno sviluppato il primo metodo di generazione di organoidi vascolari^11,12 che imita questi due processi. Con gli organoidi generati da questo metodo, il loro gruppo¹² e noi^13,14 hanno dimostrato il potenziale degli organoidi vascolari per la modellazione di disfunzioni vascolari nelle malattie. Ad esempio, nei nostri recenti lavori ^13,14, sono stati osservati fenotipi distinti, come la germinazione dei vasi e le variazioni della composizione cellulare murale, tra gli organoidi vascolari che imitano la malattia e le loro controparti wild-type. Questi esempi evidenziano che il modello di organoide vascolare potrebbe fungere da piattaforma per lo screening dei farmaci imitando i malfunzionamenti vascolari correlati alla malattia.

Costruito sui lavori iniziali di generazione di organoidi vascolari^11,12, viene presentato un protocollo rivisto che include l'uso di micropozzetti per facilitare la formazione di corpi embrioidi omogenei (EB), un fattore critico per ridurre al minimo le variazioni spesso osservate all'interno dello stesso lotto di generazione di organoidi. Inoltre, il cocktail CEPT, una combinazione di cromo 1, emricasan, poliammine e l'inibitore integrato della risposta allo stress (trans-ISRIB)¹⁵, viene impiegato per migliorare la vitalità delle hiPSC e delle cellule differenziate durante il processo di formazione dell'EB. Questa modifica serve principalmente a ridurre le variazioni tra i diversi campioni e lotti di organoidi. Con questo protocollo della durata di circa due settimane, è possibile produrre organoidi vascolari uniformi, in cui la vasculogenesi viene indotta per aiutare l'endotelio a organizzarsi in reti tubulari primitive il giorno 1, seguita dall'induzione dell'angiogenesi il giorno 5 per sviluppare reti vascolari complesse negli organoidi. Nei giorni 12-15, gli organoidi generati dovrebbero mostrare reti vascolari mature composte sia da endotelio che da cellule murali.

Protocollo

La Figura 1 presenta una panoramica dei passaggi coinvolti in questo protocollo. Informazioni dettagliate sui reagenti e sui materiali utilizzati in questo protocollo sono riportate nella Tabella dei materiali. Si consiglia di preriscaldare tutti i fluidi a 37 °C prima dell'uso, se non diversamente specificato. Tutti i materiali e le forniture per la coltura cellulare devono essere sterilizzati in autoclave o sterili e la manipolazione delle cellule deve essere effettuata in una cabina di biosicurezza. Inoltre, il valore del pH della miscela di collagene I deve essere attentamente regolato a pH 7,3 per evitare possibili problemi di solidificazione.

1. Mantenimento dell'iPSC umana

1. Scongelare l'estratto della matrice della membrana basale con ghiaccio, agitare delicatamente il flacone per miscelare la soluzione e preparare aliquote da 0,5 mL in provette per microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000 e puntali pre-refrigerati. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 1 anno.
2. Scongelare un'aliquota di estratto di matrice (0,5 mL) con ghiaccio. Miscelare con 49,5 mL di terreno DMEM/F12 pre-raffreddato in una provetta da 50 mL. Distribuire la miscela in ciascun pozzetto (1,5 ml/pozzetto) in piastre a 6 pozzetti, quindi agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che la soluzione liquida copra l'intero pozzetto. Sigillare le piastre con pellicola di paraffina e conservarle a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
3. Preparare il mezzo di espansione hiPSC come descritto nella Tabella 1. Prelevare aliquote dell'intero terreno (40 mL/provetta) e conservare a -20 °C per un massimo di 1 anno.
4. Mettere una piastra pre-rivestita nell'incubatore a 37 °C per 1 ora prima della coltura hiPSC.
5. Preriscaldare il terreno di espansione hiPSC (40 mL) a 37 °C e preparare il terreno di semina hiPSC come descritto nella Tabella 2.
6. Trasferire la piastra rivestita dall'incubatore a 37 °C alla camera di biosicurezza. Sostituire il terreno nella piastra rivestita con il terreno di semina hiPSC (1 mL/pozzetto).
7. Scongelare una fiala crioconservata di hiPSC dal crioserbatoio in un bagno d'acqua a 37 °C per 1 minuto.
8. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL e quindi aggiungere 5 mL di terreno DMEM/F12, seguito da centrifugazione a 100 x g per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le cellule.
9. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 1,5 mL di terreno di semina hiPSC. Risospendere delicatamente le cellule nella provetta da 15 mL.
10. Aliquotare 10 μl della sospensione cellulare e miscelare con 10 μl di soluzione di blu di tripano. Trasferire 10 μL di miscela nel vetrino dell'ematocitometro e coprirla con un vetrino coprioggetti.
11. Montare la slitta sul supporto e inserirla nel contatore automatico di celle. Attendere che lo strumento trovi la messa a fuoco o regolare manualmente la messa a fuoco premendo il pulsante di messa a fuoco +/- sullo schermo. Successivamente, utilizzare l'impostazione predefinita e premere il pulsante Capture . Utilizzare la lettura della densità cellulare LIVE come concentrazione della sospensione hiPSC preparata dal punto 1.9.
12. Seminare 2 × 10⁵ celle in ogni pozzetto e assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente nel pozzetto.
13. Coltivare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e sostituire il terreno con un terreno di espansione hiPSC (1,5 mL/pozzetto) dopo 24 ore.
14. Cambiare il terreno ogni giorno fino a quando le celle raggiungono una confluenza dell'80%. Controllare regolarmente la morfologia cellulare e le dimensioni della colonia per garantire l'assenza di differenziazione spontanea. Scartare la coltura e ricominciare con un nuovo lotto di hiPSC se si osserva un'ampia differenziazione spontanea (>5%).

2. Formazione EB (Giorno 0)

1. Il giorno 0, preparare e preriscaldare il terreno DMEM/F12, il terreno di semina hiPSC e la soluzione di distacco cellulare a 37 °C per 20-30 minuti.
2. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 6 pozzetti e aggiungere la soluzione di distacco cellulare preriscaldata (1,5 mL/pozzetto). Incubare la piastra a 37 °C per 5-7 minuti.
3. Trasferire la piastra nella cabina di biosicurezza, picchiettare la piastra per staccare le colonie di hiPSC e rompere gli aggregati.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL. Aggiungere 4,5 mL di terreno DMEM/F12. Pipettare delicatamente la miscela su e giù utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL cinque volte per dissociare le cellule in una sospensione a cellula singola. Evita di generare bolle.
5. Centrifugare a 100 x g per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le cellule.
6. Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule con 1 mL di terreno di semina hiPSC utilizzando una pipetta P1000.
7. Miscelare 10 μl di sospensione cellulare con 10 μl di soluzione di blu di tripano per la conta cellulare. Trasferire 10 μl della miscela nel vetrino dell'ematocitometro e coprirlo con un vetrino coprioggetti. Montare la slitta sul supporto e inserirla nel contatore automatico di celle. Dopo che lo strumento ha trovato il fuoco, premere il pulsante Capture e utilizzare la lettura della densità cellulare LIVE per determinare la concentrazione della sospensione hiPSC.
8. Seminare le cellule nella piastra per micropozzetti a fondo tondo a bassissimo attaccamento con una densità di 2,7 × 10⁵ cellule/pozzetto per ottenere 500-1.000 cellule per EB.
9. Aggiungere 2 mL di terreno di semina hiPSC in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente la soluzione per distribuire uniformemente le cellule.
10. Coltivare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ per 24 ore.

3. Differenziazione vascolare (Giorno 1 - 5)

1. Il giorno 1, preparare il mezzo di induzione del mesoderma (MIM) come descritto nella Tabella 3 e nella Tabella 4 e preriscaldarlo a 37 °C per 20 minuti. Il mezzo MIM deve essere preparato fresco.
2. Utilizzare una pipetta P200 per aspirare con cura il terreno dalla piastra a micropozzetti senza disturbare gli EB sul fondo.
3. Aggiungere lentamente 2,5 mL di MIM utilizzando una pipetta P200. Coltivare gli EB in MIM a 37 °C con il 5% di CO₂ per 2 giorni.
4. Il giorno 3, sostituire delicatamente il terreno con 2,5 mL preriscaldati e appena preparati del terreno di differenziazione vascolare 1 (VDM1, Tabella 5) senza disturbare gli EB sul fondo del micropozzetto. Coltivare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ per altri 2 giorni.

4. Inclusione di idrogel (giorno 5)

1. Preparare la miscela di collagene I come descritto nella Tabella 6. Posizionare una provetta da 50 ml sul ghiaccio e aggiungere successivamente la soluzione di collagene I, H₂O, 10× DMEM/F12, bicarbonato di sodio e HEPES. Mescolare accuratamente agitando delicatamente il tubo. Aggiungere 1 soluzione di NaOH M goccia a goccia agitando la soluzione miscelata per regolare il valore del pH a 7,3 e controllare il valore del pH della miscela con un pHmetro.
   NOTA: Tutte le soluzioni devono essere pre-raffreddate con ghiaccio prima dell'uso. Eseguire sempre la procedura sul ghiaccio nella cabina di biosicurezza. L'aggiunta della soluzione di NaOH è fondamentale ed è necessaria una rapida dispersione per ottenere una soluzione omogenea per evitare la polimerizzazione locale del collagene I. Il volume di NaOH può variare in base al numero di lotto della soluzione di collagene I utilizzata. Non pipettare energicamente per la miscelazione, poiché lo sforzo di taglio potrebbe causare una pre-polimerizzazione indesiderata.
2. Preparare la miscela di collagene I-matrice della membrana basale come descritto nella Tabella 7. Aggiungere 1,25 mL di matrice della membrana basale alla miscela di collagene I da 5 mL preparata dal passaggio 4.1. Mescolare delicatamente la soluzione agitando il tubo.
3. Mettere una piastra a 12 pozzetti sul ghiaccio per 2 minuti.
4. Aggiungere lentamente la miscela di matrice della membrana del basamento al collagene nella piastra a 12 pozzetti (1,5 mL/pozzetto) utilizzando le punte a foro largo. Assicurati che il composto sia distribuito uniformemente.
5. Mettere la piastra nell'incubatore a 37 °C per 2 ore per solidificare il primo strato di idrogel.
6. Conservare la restante miscela di collagene I-basement membrane matrix sul ghiaccio per un uso successivo.
7. Trasferire ~60 aggregati cellulari in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e raffreddare la provetta con ghiaccio per 5 minuti. Rimuovere con cautela il terreno con un puntale per pipetta P200.
   NOTA: Iniziare questo passaggio 1,5 ore dopo il passaggio 4.5.
8. Goccia a goccia, aggiungere 1,5 mL di miscela di collagene I-membrana basale agli aggregati e mescolarli delicatamente utilizzando puntali per pipette P200 a foro largo.
9. Trasferire la piastra con il primo strato di idrogel dall'incubatore (passaggio 4.5) alla cappa di biosicurezza.
10. Aggiungere 1,5 mL della sospensione aggregata sullo strato polimerizzato. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente gli aggregati. Evitare di generare bolle.
11. Incubare la piastra a 37 °C con CO₂ al 5% per altre 2 ore.
12. Preparare il mezzo di differenziazione vascolare 2 (VDM2; Tabella 8) e preriscaldare il fluido in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti prima dell'uso.
13. Aggiungere 2 mL di VDM2 a ciascun pozzetto e coltivare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂.
14. Cambiare il fluido ogni 3 giorni con VDM2 preriscaldato e appena fatto.
    NOTA: (Opzionale) Gli organoidi vascolari possono essere rilasciati dalla miscela di gel rimuovendo il gel con un ago da siringa. Gli organoidi vascolari recuperati dal gel possono essere conservati singolarmente in una piastra a 96 pozzetti con VDM2 (200 μL/pozzetto). Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.

5. 3D Saggio di immunofluorescenza

1. Gli organoidi vascolari dovrebbero diventare maturi all'incirca il giorno 13. Per gli organoidi incorporati nell'idrogel, aspirare accuratamente il terreno e lavare con 2 mL di PBS tre volte (10 min ogni volta). Per gli organoidi recuperati dal gel (dopo il passaggio 4.14), raccogliere 6-10 organoidi in una provetta da microcentrifuga da 2 mL, aspirare il terreno e lavare con 2 mL di PBS tre volte (10 min ciascuna).
2. Aggiungere 2 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% al campione e incubare a 4 °C per una notte con sigillatura con film di paraffina.
3. Rimuovere la soluzione di PFA e lavare il campione con 2 mL di PBS quattro volte (15 minuti ogni volta).
4. Aggiungere 2 mL di tampone bloccante (Tabella 9) e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
5. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 1,5 mL di anticorpi primari (vedere la Tabella dei materiali per informazioni sugli anticorpi; gli anticorpi devono essere diluiti nel tampone bloccante). Incubare il campione con anticorpi primari a 4 °C per 2 giorni agitando delicatamente.
   NOTA: Si consiglia di diluire l'anticorpo primario (CD31, PDGFRβ ed ERG1) nel tampone bloccante con un rapporto di 1:400 (per ulteriori informazioni, vedere la Tabella dei materiali ).
6. Rimuovere la soluzione di anticorpi primari e lavare con 2 mL di PBST per 1 ora sei volte.
7. Aggiungere 2 mL di anticorpi secondari (vedere la Tabella dei materiali per le informazioni sugli anticorpi; gli anticorpi devono essere diluiti in PBST) al campione. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio e incubare a 4 °C per 2 giorni agitando delicatamente.
   NOTA: Si raccomanda di diluire l'anticorpo secondario in PBST in un rapporto di 1:1000 (per ulteriori informazioni, vedere la Tabella dei materiali ). Tenere la piastra lontana dalla luce durante l'incubazione e lavare da questo passaggio successivo.
8. Rimuovere la soluzione di anticorpi secondari e lavare con 2 mL di TBST sei volte (1 ora ogni volta). Se è necessaria la colorazione dei nuclei, aggiungere DAPI (1 μg/mL) nel tampone di lavaggio utilizzato per l'ultima fase di lavaggio.
9. Per questi organoidi incorporati nel gel, tagliare il gel in 4 pezzi e trasferirli con cura in provette da microcentrifuga da 2 ml con una spatola. Per gli organoidi recuperati, rimuovere il tampone di lavaggio.
10. Utilizzare salviette per assorbire la soluzione rimanente senza toccare il gel o gli organoidi.
11. Aggiungere 2 mL di reagente idrosolubile per la pulizia dei tessuti (indice di rifrazione = 1,49) in ciascuna provetta. Incubare i campioni con il reagente chiarificante a temperatura ambiente al buio fino a quando gli organoidi non diventano limpidi (di solito durante la notte). Non agitare i campioni.
12. Trasferire con cura gli organoidi con il reagente chiarificante al centro del piatto con fondo di vetro utilizzando una spatola.
13. Coprire gli organoidi o il pezzo di gel con un vetrino coprioggetti da 24 mm × 24 mm.
14. Spingere delicatamente il vetrino coprioggetti verso il basso fino a quando non si appiattisce e inserire i campioni con il fondo di vetro.
15. Rimuovere il reagente di pulizia ridondante nel piatto e sigillare il vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie.
16. Per l'imaging 3D, utilizzare un microscopio confocale con un obiettivo da 10×. Utilizza la scansione tile e la scansione Z-stack per ottenere immagini a montaggio intero di organoidi.

Risultati

La Figura 1A presenta lo schema di questo protocollo, compresi i componenti chiave utilizzati in ogni fase. La differenziazione è iniziata con la formazione di EB, seguita dall'induzione del mesoderma e dalla specificazione del lignaggio vascolare (Figura 1B-D). Gli aggregati sono diventati più grandi e meno sferici nel tempo. Gli organoidi hanno iniziato a mostrare spigoli vivi il giorno 5. D...

Discussione

Il protocollo descritto include due modifiche chiave per la generazione omogenea e riproducibile di organoidi vascolari di alta qualità. La prima modifica è l'uso di una piastra a micropozzetti per consentire un migliore controllo dell'uniformità EB. Come punto di partenza della differenziazione vascolare, la dimensione degli EB è fondamentale in quanto regola il destino delle cellule staminali e l'efficacia della differenziazione verso diversi lignaggi. Le variazioni nelle dimension...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C