Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Riepilogo

Questo protocollo presenta un metodo per generare organoidi vascolari utilizzando cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

Gli organoidi vascolari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) ricapitolano la diversità dei tipi cellulari e la complessa architettura delle reti vascolari umane. Questo modello tridimensionale (3D) ha un notevole potenziale per la modellazione della patologia vascolare e lo screening dei farmaci in vitro . Nonostante i recenti progressi, rimane una sfida tecnica fondamentale per la generazione riproducibile di organoidi con una qualità costante, che è fondamentale per i saggi e le applicazioni a valle. Qui viene presentato un protocollo modificato che migliora sia l'omogeneità che la riproducibilità della generazione di organoidi vascolari. Il protocollo modificato incorpora l'uso di micropozzetti e del cocktail CEPT (chroman 1, emricasan, poliammine e l'inibitore integrato della risposta allo stress, trans-ISRIB) per migliorare la formazione del corpo embrioide e la sopravvivenza cellulare. Gli organoidi vascolari maturi e differenziati generati utilizzando questo protocollo sono caratterizzati dalla microscopia a immunofluorescenza 3D a montaggio intero per analizzarne la morfologia e la vascolarizzazione complessa. Questo protocollo consente la produzione di organoidi vascolari di alta qualità in modo scalabile, facilitando potenzialmente il loro utilizzo nella modellazione delle malattie e nelle applicazioni di screening dei farmaci.

Introduzione

Nell'ultimo decennio sono emersi modelli microfisiologici in vitro, inclusi organoidi e sistemi tissue-on-a-chip ^1,2,3. Questi sistemi tridimensionali (3D) derivati da cellule umane affrontano i limiti delle colture cellulari bidimensionali convenzionali (2D) e dei modelli animali, come la mancanza di molti componenti nel microambiente fisiologico e le differenze genetiche tra le specie, rispettivamente. Forniscono più informazioni fisiologiche e sono più adatti per la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci rispetto a....

Protocollo

La Figura 1 presenta una panoramica dei passaggi coinvolti in questo protocollo. Informazioni dettagliate sui reagenti e sui materiali utilizzati in questo protocollo sono riportate nella Tabella dei materiali. Si consiglia di preriscaldare tutti i fluidi a 37 °C prima dell'uso, se non diversamente specificato. Tutti i materiali e le forniture per la coltura cellulare devono essere sterilizzati in autoclave o sterili e la manipolazione delle cellule deve essere effettuata in una cabina di biosicurezza. Inoltre, il valore del pH della miscela di collagene I deve essere attentamente regolat....

Discussione

Il protocollo descritto include due modifiche chiave per la generazione omogenea e riproducibile di organoidi vascolari di alta qualità. La prima modifica è l'uso di una piastra a micropozzetti per consentire un migliore controllo dell'uniformità EB. Come punto di partenza della differenziazione vascolare, la dimensione degli EB è fondamentale in quanto regola il destino delle cellule staminali e l'efficacia della differenziazione verso diversi lignaggi. Le variazioni nelle dimension.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C