Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Gefäßorganoiden unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen vor.

Zusammenfassung

Vaskuläre Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen werden, rekapitulieren die Zelltypenvielfalt und die komplexe Architektur menschlicher Gefäßnetzwerke. Dieses dreidimensionale (3D) Modell birgt ein erhebliches Potenzial für die Modellierung der Gefäßpathologie und das In-vitro-Wirkstoffscreening . Trotz der jüngsten Fortschritte besteht nach wie vor eine zentrale technische Herausforderung darin, Organoide mit gleichbleibender Qualität reproduzierbar zu erzeugen, was für nachgelagerte Assays und Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist. Hier wird ein modifiziertes Protokoll vorgestellt, das sowohl die Homogenität als auch die Reproduzierbarkeit der Generierung von vaskulären Organoiden verbessert. Das modifizierte Protokoll beinhaltet die Verwendung von Mikrowells und des CEPT-Cocktails (Chroman 1, Emricasan, Polyamine und der integrierte Stressreaktionshemmer trans-ISRIB), um die Körperbildung von Embryoiden und das Überleben der Zellen zu verbessern. Differenzierte, reife Gefäßorganoide, die mit diesem Protokoll erzeugt werden, werden mittels 3D-Immunfluoreszenzmikroskopie charakterisiert, um ihre Morphologie und komplexe Gefäßstruktur zu analysieren. Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Herstellung hochwertiger vaskulärer Organoide und erleichtert so möglicherweise deren Einsatz in der Krankheitsmodellierung und beim Wirkstoffscreening.

Einleitung

In vitro sind in den letzten zehn Jahren mikrophysiologische In-vitro-Modelle, einschließlich Organoid- und Tissue-on-a-Chip-Systeme, entstanden ^1,2,3. Diese dreidimensionalen (3D), aus menschlichen Zellen gewonnenen Systeme beheben die Einschränkungen herkömmlicher zweidimensionaler (2D) Zellkultur- und Tiermodelle, wie z. B. das Fehlen vieler Komponenten in der physiologischen Mikroumgebung bzw. genetische Unterschiede zwischen den Arten. Sie liefern physiologischere Erkenntnisse und eignen sich besser für die Modellierung von Kran....

Protokoll

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Schritte, die an diesem Protokoll beteiligt sind. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Materialien finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C vorzuwärmen, sofern nicht anders angegeben. Alle Zellkulturmaterialien und -materialien sollten entweder autoklaviert oder steril sein, und die Zellhandhabung sollte in einer Biosicherheitswerkbank erfolgen. Zusätzlich sollte der pH-Wert der Kollagen-I-Mischung sorgfältig auf pH 7,3 eingestellt werden, um möglich....

Diskussion

Das beschriebene Protokoll umfasst zwei wichtige Modifikationen für die homogene und reproduzierbare Erzeugung hochwertiger vaskulärer Organoide. Die erste Modifikation ist die Verwendung einer Mikrotiterplatte, um eine bessere Kontrolle der EB-Gleichmäßigkeit zu ermöglichen. Als Ausgangspunkt für die vaskuläre Differenzierung ist die Größe der EBs von entscheidender Bedeutung, da sie das Schicksal der Stammzellen und die Wirksamkeit der Differenzierung gegenüber verschiedenen .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C