Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Gefäßorganoiden unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen vor.

Zusammenfassung

Vaskuläre Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen werden, rekapitulieren die Zelltypenvielfalt und die komplexe Architektur menschlicher Gefäßnetzwerke. Dieses dreidimensionale (3D) Modell birgt ein erhebliches Potenzial für die Modellierung der Gefäßpathologie und das In-vitro-Wirkstoffscreening . Trotz der jüngsten Fortschritte besteht nach wie vor eine zentrale technische Herausforderung darin, Organoide mit gleichbleibender Qualität reproduzierbar zu erzeugen, was für nachgelagerte Assays und Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist. Hier wird ein modifiziertes Protokoll vorgestellt, das sowohl die Homogenität als auch die Reproduzierbarkeit der Generierung von vaskulären Organoiden verbessert. Das modifizierte Protokoll beinhaltet die Verwendung von Mikrowells und des CEPT-Cocktails (Chroman 1, Emricasan, Polyamine und der integrierte Stressreaktionshemmer trans-ISRIB), um die Körperbildung von Embryoiden und das Überleben der Zellen zu verbessern. Differenzierte, reife Gefäßorganoide, die mit diesem Protokoll erzeugt werden, werden mittels 3D-Immunfluoreszenzmikroskopie charakterisiert, um ihre Morphologie und komplexe Gefäßstruktur zu analysieren. Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Herstellung hochwertiger vaskulärer Organoide und erleichtert so möglicherweise deren Einsatz in der Krankheitsmodellierung und beim Wirkstoffscreening.

Einleitung

In vitro sind in den letzten zehn Jahren mikrophysiologische In-vitro-Modelle, einschließlich Organoid- und Tissue-on-a-Chip-Systeme, entstanden ^1,2,3. Diese dreidimensionalen (3D), aus menschlichen Zellen gewonnenen Systeme beheben die Einschränkungen herkömmlicher zweidimensionaler (2D) Zellkultur- und Tiermodelle, wie z. B. das Fehlen vieler Komponenten in der physiologischen Mikroumgebung bzw. genetische Unterschiede zwischen den Arten. Sie liefern physiologischere Erkenntnisse und eignen sich besser für die Modellierung von Krankheiten und das Wirkstoffscreening als herkömmliche Modelle. Unter den mikrophysiologischen Modellen haben Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen wurden, bewiesen, dass sie die architektonischen Merkmale nativer menschlicher Gewebe effektiv rekapitulieren und so entwickelt wurden, dass sie verschiedene menschliche Organe nachahmen, einschließlich des Gehirns ^4,5, der Niere⁶, der Leber ^7,8 und der Netzhaut⁹. Hier konzentrieren wir uns insbesondere auf die Erzeugung von vaskulären Organoiden aus hiPS-Zellen und skizzieren ein schlankes Protokoll, das darauf abzielt, die Variationen zwischen verschiedenen Organoidproben und -chargen zu minimieren und dadurch die Reproduzierbarkeit insgesamt zu verbessern.

Das Gefäßsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der physiologischen Homöostase in allen menschlichen Organen. Die Bildung von Gefäßen umfasst die Prozesse der Vaskulogenese und Angiogenese, die durch die Wechselwirkungen zwischen Endothel- und Wandzellen (z. B. Perizyten und vaskuläre glatte Muskelzellen) orchestriert und durch verschiedene Reize beeinflusst werden¹⁰. Penninger, Wimmer und Kollegen entwickelten die erste Methode zur Erzeugung von vaskulären Organoiden^11,12, die diese beiden Prozesse nachahmt. Mit den aus dieser Methode generierten Organoiden haben ihre Gruppe¹² und wir^13,14 das Potenzial von Gefäßorganoiden für die Modellierung von Gefäßstörungen bei Krankheiten demonstriert. Zum Beispiel wurden in unseren jüngsten Arbeiten ^13,14 unterschiedliche Phänotypen beobachtet, wie z.B. Gefäßkeimungen und Variationen der Zusammensetzung von Wandzellen, zwischen krankheitsimitierenden Gefäßorganoiden und ihren Wildtyp-Gegenstücken. Diese Beispiele zeigen, dass das Modell der vaskulären Organoide als Plattform für das Wirkstoffscreening dienen könnte, indem es krankheitsbedingte Gefäßfehlfunktionen nachahmt.

Aufbauend auf den ersten Arbeiten zur Generierung von Gefäßorganoiden^11,12 wird ein überarbeitetes Protokoll vorgestellt, das die Verwendung von Mikrowells zur Erleichterung der Bildung eines homogenen Embryoidkörpers (EB) beinhaltet, ein kritischer Faktor bei der Minimierung der Variationen, die häufig innerhalb derselben Organoid-Generationscharge auftreten. Darüber hinaus wird der CEPT-Cocktail, eine Kombination aus Chroman 1, Emricasan, Polyaminen und dem integrierten Stress-Response-Inhibitor (trans-ISRIB)¹⁵, eingesetzt, um die Lebensfähigkeit von hiPSCs und differenzierten Zellen während des EB-Bildungsprozesses zu verbessern. Diese Modifikation dient hauptsächlich dazu, die Schwankungen zwischen verschiedenen Organoidproben und Chargen zu reduzieren. Mit diesem etwa zweiwöchigen Protokoll können einheitliche vaskuläre Organoide hergestellt werden, bei denen die Vaskulogenese induziert wird, um das Endothel an Tag 1 in primitiven röhrenförmigen Netzwerken zu organisieren, gefolgt von einer Angiogenese-Induktion an Tag 5, um komplexe Gefäßnetzwerke in Organoiden zu entwickeln. An Tag 12-15 sollten die erzeugten Organoide reife Gefäßnetzwerke aufweisen, die sowohl aus Endothel- als auch aus Wandzellen bestehen.

Protokoll

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Schritte, die an diesem Protokoll beteiligt sind. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Materialien finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C vorzuwärmen, sofern nicht anders angegeben. Alle Zellkulturmaterialien und -materialien sollten entweder autoklaviert oder steril sein, und die Zellhandhabung sollte in einer Biosicherheitswerkbank erfolgen. Zusätzlich sollte der pH-Wert der Kollagen-I-Mischung sorgfältig auf pH 7,3 eingestellt werden, um mögliche Verfestigungsprobleme zu vermeiden.

1. Aufrechterhaltung der menschlichen iPS-Zellen

1. Tauen Sie den Basalmembranmatrix-Extrakt auf Eis auf, schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um die Lösung zu mischen, und stellen Sie mit einer P1000-Pipette und vorgekühlten Spitzen 0,5-ml-Aliquote in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen her. Lagern Sie die Aliquots bis zu 1 Jahr bei -20 °C.
2. Tauen Sie ein Aliquot des Matrixextrakts (0,5 mL) auf Eis auf. Mischen Sie es mit 49,5 mL vorgekühltem DMEM/F12-Medium in einem 50-ml-Röhrchen. Verteilen Sie die Mischung in 6-Well-Platten und schütteln Sie die Platte dann vorsichtig, um sicherzustellen, dass die flüssige Lösung die gesamte Vertiefung bedeckt. Verschließen Sie die Platten mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bis zu 1 Woche bei 4 °C.
3. Bereiten Sie das hiPSC-Expansionsmedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Das gesamte Medium (40 ml/Röhrchen) aliquotiert und bis zu 1 Jahr bei -20 °C lagern.
4. Legen Sie eine vorbeschichtete Platte für 1 h in den 37 °C-Inkubator, bevor Sie die hiPSC-Kultur beginnen.
5. Das hiPSC-Expansionsmedium (40 mL) bei 37 °C vorwärmen und das hiPSC-Saatmedium wie in Tabelle 2 beschrieben vorbereiten.
6. Übertragen Sie die beschichtete Platte aus dem 37 °C Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Ersetzen Sie das Medium in der beschichteten Platte durch hiPSC-Sämedium (1 mL/Well).
7. Tauen Sie ein kryokonserviertes Fläschchen mit hiPS-Zellen aus dem Kryotank in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 min auf.
8. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen und fügen Sie dann 5 mL DMEM/F12-Medium hinzu, gefolgt von einer Zentrifugation bei 100 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu sammeln.
9. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 1,5 mL hiPSC-Seeding-Medium. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig im 15-ml-Röhrchen.
10. Aliquotieren Sie 10 μl der Zellsuspension und mischen Sie sie mit 10 μl Trypanblaulösung. Übertragen Sie die 10-μl-Mischung auf den Objektträger des Hämazytometers und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.
11. Montieren Sie den Objektträger auf der Halterung und setzen Sie ihn in den automatischen Zellzähler ein. Warten Sie, bis das Instrument den Fokus gefunden hat, oder stellen Sie den Fokus manuell ein, indem Sie die Fokustaste +/- auf dem Bildschirm drücken. Verwenden Sie anschließend die Standardeinstellung und drücken Sie die Aufnahmetaste. Verwenden Sie den LIVE-Zelldichtemesswert als Konzentration der in Schritt 1.9 hergestellten hiPSC-Suspension.
12. Saat 2 × 10⁵ Zellen in jede Vertiefung und achtet darauf, dass die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung verteilt sind.
13. Kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und ersetzen Sie das Medium nach 24 h durch hiPSC-Expansionsmedium (1,5 mL/Well).
14. Wechseln Sie das Medium täglich, bis die Zellen eine Konfluenz von 80% erreichen. Überprüfen Sie routinemäßig die Zellmorphologie und die Koloniegröße, um sicherzustellen, dass keine spontane Differenzierung erfolgt. Verwerfen Sie die Kultur und starten Sie sie mit einer neuen Charge von hiPSCs neu, wenn eine umfangreiche (>5%) spontane Differenzierung beobachtet wird.

2. EB-Bildung (Tag 0)

1. Bereiten Sie an Tag 0 das DMEM/F12-Medium, das hiPSC-Aussaatmedium und die Zellablösung, und wärmen Sie es 20-30 Minuten lang bei 37 °C vor.
2. Nehmen Sie das Nährmedium von der 6-Well-Platte und fügen Sie eine vorgewärmte Zellablösungslösung (1,5 ml/Well) hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 5-7 min.
3. Übertragen Sie die Platte in die Biosicherheitswerkbank, klopfen Sie auf die Platte, um hiPS-Kolonien zu lösen, und brechen Sie die Aggregate auf.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 4,5 mL DMEM/F12-Medium hinzu. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig mit einer serologischen 10-ml-Pipette fünfmal auf und ab, um die Zellen in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
5. Zentrifugieren Sie bei 100 x g für 3 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu sammeln.
6. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml hiPSC-Seeding-Medium unter Verwendung einer P1000-Pipette.
7. Mischen Sie 10 μl Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau-Lösung für die Zellzählung. Übertragen Sie 10 μl der Mischung auf den Objektträger des Hämazytometers und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Montieren Sie den Objektträger auf der Halterung und setzen Sie ihn in den automatischen Zellzähler ein. Nachdem das Gerät den Fokus gefunden hat, drücken Sie die Capture-Taste und verwenden Sie den LIVE-Zelldichtemesswert , um die Konzentration der hiPSC-Suspension zu bestimmen.
8. Aussaat der Zellen in der Mikrotiterplatte mit extrem geringer Bindung mit rundem Boden und einer Dichte von 2,7 × 10⁵ Zellen/Well, um 500-1.000 Zellen pro EB zu erhalten.
9. Geben Sie 2 ml hiPSC-Aussaatmedium in jede Vertiefung und mischen Sie die Lösung vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
10. Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 h kultiviert.

3. Gefäßdifferenzierung (Tag 1 - 5)

1. Bereiten Sie an Tag 1 das Mesoderm-Induktionsmedium (MIM) wie in Tabelle 3 und Tabelle 4 beschrieben vor und wärmen Sie es 20 Minuten lang bei 37 °C vor. Das MIM-Medium muss frisch hergestellt werden.
2. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um das Medium vorsichtig aus der Mikrotiterplatte zu aspirieren, ohne die EBs am Boden zu stören.
3. Geben Sie langsam 2,5 ml MIM mit einer P200-Pipette hinzu. Kultivieren Sie die EBs 2 Tage lang in MIM bei 37 °C mit 5 % CO₂ .
4. Ersetzen Sie das Medium an Tag 3 vorsichtig durch vorgewärmte, frisch hergestellte 2,5 mL des Gefäßdifferenzierungsmediums 1 (VDM1, Tabelle 5), ohne die EBs am Boden der Mikrovertiefung zu stören. Kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5% CO₂ für weitere 2 Tage.

4. Hydrogel-Einbettung (Tag 5)

1. Bereiten Sie die Kollagen-I-Mischung wie in Tabelle 6 beschrieben vor. Stellen Sie ein 50-ml-Röhrchen auf Eis und fügen Sie anschließend Kollagen-I-Lösung, H₂O, 10 × DMEM/F12-Medium, Natriumbicarbonat und HEPES hinzu. Mischen Sie gründlich, indem Sie die Tube leicht schütteln. Geben Sie 1 M NaOH-Lösung tropfenweise hinzu, während Sie die gemischte Lösung schütteln, um den pH-Wert auf 7,3 einzustellen, und überprüfen Sie den pH-Wert der Mischung mit einem pH-Messgerät.
   HINWEIS: Alle Lösungen sollten vor der Verwendung auf Eis vorgekühlt werden. Führen Sie den Eingriff die ganze Zeit auf Eis in der Biosicherheitswerkbank durch. Die Zugabe der NaOH-Lösung ist von entscheidender Bedeutung, und eine schnelle Dispergierung zur Herstellung einer homogenen Lösung ist erforderlich, um eine lokale Aushärtung von Kollagen I zu vermeiden. Das Volumen von NaOH kann je nach Chargennummer der verwendeten Kollagen-I-Lösung variieren. Zum Mischen nicht kräftig pipettieren, da die Scherspannung zu einer unerwünschten Vorhärtung führen kann.
2. Bereiten Sie die Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Mischung wie in Tabelle 7 beschrieben vor. Geben Sie 1,25 ml Basalmembranmatrix zu der 5 ml Kollagen I-Mischung, die in Schritt 4.1 hergestellt wurde. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie das Röhrchen schütteln.
3. Stellen Sie eine 12-Well-Platte für 2 Minuten auf Eis.
4. Geben Sie die Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Mischung langsam mit den Spitzen mit breiter Bohrung in die 12-Well-Platte (1,5 ml/Well). Achten Sie darauf, dass die Mischung gleichmäßig verteilt ist.
5. Legen Sie die Platte für 2 h in den 37 °C Inkubator, um die erste Schicht Hydrogel zu verfestigen.
6. Bewahren Sie die restliche Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Mischung für die spätere Verwendung auf Eis auf.
7. Übertragen Sie ~60 Zellaggregate in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und kühlen Sie das Röhrchen 5 Minuten lang auf Eis ab. Entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer P200-Pipettenspitze.
   HINWEIS: Starten Sie diesen Schritt 1,5 Stunden nach Schritt 4.5.
8. Geben Sie tropfenweise 1,5 ml Kollagen-I-Basalmembran-Mischung zu den Aggregaten und mischen Sie sie vorsichtig mit P200-Pipettenspitzen mit breiter Bohrung.
9. Übertragen Sie die Platte mit der ersten Schicht Hydrogel aus dem Inkubator (Schritt 4.5) in die Biosicherheitswerkbank.
10. Geben Sie 1,5 mL der Zuschlagstoffsuspension auf die ausgehärtete Schicht. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zuschlagstoffe gleichmäßig zu verteilen. Vermeiden Sie die Erzeugung von Blasen.
11. Die Platte bei 37 °C mit 5 % CO₂ für weitere 2 h inkubieren.
12. Bereiten Sie das vaskuläre Differenzierungsmedium 2 (VDM2; Tabelle 8) und das Medium vor der Verwendung 20 min in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
13. Geben Sie 2 ml VDM2 in jede Vertiefung und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂.
14. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage mit vorgewärmtem, frisch zubereitetem VDM2.
    HINWEIS: (Optional) Gefäßorganoide können aus der Gelmischung freigesetzt werden, indem das Gel mit einer Spritzennadel entfernt wird. Die aus dem Gel gewonnenen Gefäßorganoide können einzeln in einer 96-Well-Platte mit VDM2 (200 μL/Well) aufbewahrt werden. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.

5. 3D Immunfluoreszenz-Assay

1. Gefäßorganoide sollten etwa am 13. Tag reif werden. Bei Organoiden, die in das Hydrogel eingebettet sind, aspirieren Sie das Medium vorsichtig und waschen Sie es dreimal (jeweils 10 min) mit 2 mL PBS. Für Organoide, die aus dem Gel entnommen werden (nach Schritt 4.14), sammeln Sie 6-10 Organoide in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie es dreimal (jeweils 10 min) mit 2 mL PBS.
2. Geben Sie 2 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) in die Probe und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C mit Paraffinfilmversiegelung.
3. Entfernen Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Probe viermal (jeweils 15 min) mit 2 mL PBS.
4. 2 ml Blockierungspuffer (Tabelle 9) zugeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie 1,5 ml Primärantikörper hinzu (siehe Materialtabelle für Antikörperinformationen; Antikörper sollten im Blockierungspuffer verdünnt werden). Die Probe wird 2 Tage lang unter leichtem Schütteln mit Primärantikörpern bei 4 °C inkubiert.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, den Primärantikörper (CD31, PDGFRβ und ERG1) im Blockierungspuffer im Verhältnis 1:400 zu verdünnen (weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle ).
6. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie sie sechsmal 1 h lang mit 2 mL PBST.
7. Geben Sie 2 ml Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle für die Antikörperinformationen; Antikörper sollten in PBST verdünnt werden) in die Probe. Wickeln Sie die Platte mit Alufolie ein und inkubieren Sie sie 2 Tage lang bei 4 °C unter leichtem Schütteln.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, den Sekundärantikörper in PBST im Verhältnis 1:1000 zu verdünnen (weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle ). Halten Sie die Platte während der Inkubation vom Licht fern und waschen Sie sie anschließend aus diesem Schritt.
8. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie sie sechsmal (jeweils 1 h) mit 2 mL TBST. Geben Sie DAPI (1 μg/ml) in den Waschpuffer, der für den letzten Waschschritt verwendet wird, wenn eine Zellkernfärbung erforderlich ist.
9. Schneiden Sie für diese in Gel eingebetteten Organoide das Gel in 4 Stücke und geben Sie sie vorsichtig mit einem Spatel in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie für die zurückgewonnenen Organoide den Waschpuffer.
10. Verwenden Sie Tücher, um die restliche Lösung aufzunehmen, ohne das Gel oder die Organoide zu berühren.
11. Geben Sie 2 ml wasserlösliches gewebereinigendes Reagenz (Brechungsindex = 1,49) in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben mit dem Clearing-Reagenz bei Raumtemperatur im Dunkeln, bis die Organoide klar sind (in der Regel über Nacht). Schütteln Sie die Proben nicht.
12. Übertragen Sie die Organoide mit dem Clearing-Reagenz vorsichtig mit einem Spatel in die Mitte der Glasbodenschale.
13. Decken Sie die Organoide oder das Gelstück mit einem Deckglas von 24 mm × 24 mm ab.
14. Schieben Sie das Deckglas vorsichtig nach unten, bis es flach liegt, und legen Sie die Proben auf den Glasboden.
15. Entfernen Sie das überflüssige Reinigungsreagenz in der Schale und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.
16. Verwenden Sie für die 3D-Bildgebung ein konfokales Mikroskop mit einem 10×Objektiv. Verwenden Sie den Kachelscan und den Z-Stapel-Scan, um Whole-Mount-Images von Organoiden zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt das Schema dieses Protokolls, einschließlich der Schlüsselkomponenten, die in jeder Phase verwendet werden. Die Differenzierung begann mit der EB-Bildung, gefolgt von der Mesoderminduktion und der Spezifizierung der Gefäßlinie (Abbildung 1B-D). Die Aggregate wurden im Laufe der Zeit größer und weniger kugelförmig. Organoide zeigten ab Tag 5 Ecken und Kanten. Nach der Ei...

Diskussion

Das beschriebene Protokoll umfasst zwei wichtige Modifikationen für die homogene und reproduzierbare Erzeugung hochwertiger vaskulärer Organoide. Die erste Modifikation ist die Verwendung einer Mikrotiterplatte, um eine bessere Kontrolle der EB-Gleichmäßigkeit zu ermöglichen. Als Ausgangspunkt für die vaskuläre Differenzierung ist die Größe der EBs von entscheidender Bedeutung, da sie das Schicksal der Stammzellen und die Wirksamkeit der Differenzierung gegenüber verschiedenen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C