Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Resumo

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Resumo

Organoides vasculares derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) recapitulam a diversidade do tipo de célula e a arquitetura complexa das redes vasculares humanas. Este modelo tridimensional (3D) possui um potencial substancial para modelagem de patologia vascular e triagem de drogas in vitro . Apesar dos avanços recentes, um desafio técnico importante permanece na geração reprodutível de organoides com qualidade consistente, o que é crucial para ensaios e aplicações a jusante. Aqui, é apresentado um protocolo modificado que melhora a homogeneidade e a reprodutibilidade da geração de organoides vasculares. O protocolo modificado incorpora o uso de micropoços e o coquetel CEPT (croman 1, emricasan, poliaminas e o inibidor integrado de resposta ao estresse, trans-ISRIB) para melhorar a formação do corpo embrióide e a sobrevivência celular. Organoides vasculares maduros e diferenciados gerados usando este protocolo são caracterizados por microscopia de imunofluorescência 3D de montagem total para analisar sua morfologia e vasculatura complexa. Este protocolo permite a produção de organoides vasculares de alta qualidade de maneira escalável, potencialmente facilitando seu uso em aplicações de modelagem de doenças e triagem de medicamentos.

Introdução

Modelos microfisiológicos in vitro, incluindo sistemas organoides e de tecido em chip, surgiram na última década ^1,2,3. Esses sistemas tridimensionais (3D) derivados de células humanas abordam as limitações da cultura de células bidimensionais (2D) convencionais e modelos animais, como a falta de muitos componentes no microambiente fisiológico e diferenças genéticas entre as espécies, respectivamente. Eles fornecem mais informações fisiológicas e são mais adequados para modelagem de doenças e triagem de medicamentos do que os modelos....

Protocolo

A Figura 1 apresenta uma visão geral das etapas envolvidas neste protocolo. Informações detalhadas sobre os reagentes e materiais utilizados neste protocolo são fornecidas na Tabela de Materiais. Recomenda-se que todos os meios sejam pré-aquecidos a 37 °C antes do uso, salvo indicação em contrário. Todos os materiais e suprimentos de cultura de células devem ser autoclavados ou estéreis, e o manuseio das células deve ser feito em um gabinete de biossegurança. Além disso, o valor do pH da mistura de colágeno I deve ser cuidadosamente ajustado para pH 7,3 para evitar possíveis problemas de ....

Discussão

O protocolo descrito inclui duas modificações principais para a geração homogênea e reprodutível de organoides vasculares de alta qualidade. A primeira modificação é o uso de uma placa de micropoços para permitir um melhor controle da uniformidade do EB. Como ponto de partida da diferenciação vascular, o tamanho dos EBs é crítico, pois regula o destino das células-tronco e a eficácia da diferenciação em diferentes linhagens. Variações no tamanho do EB geralmente levam.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C