Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Resumo

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Resumo

Organoides vasculares derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) recapitulam a diversidade do tipo de célula e a arquitetura complexa das redes vasculares humanas. Este modelo tridimensional (3D) possui um potencial substancial para modelagem de patologia vascular e triagem de drogas in vitro . Apesar dos avanços recentes, um desafio técnico importante permanece na geração reprodutível de organoides com qualidade consistente, o que é crucial para ensaios e aplicações a jusante. Aqui, é apresentado um protocolo modificado que melhora a homogeneidade e a reprodutibilidade da geração de organoides vasculares. O protocolo modificado incorpora o uso de micropoços e o coquetel CEPT (croman 1, emricasan, poliaminas e o inibidor integrado de resposta ao estresse, trans-ISRIB) para melhorar a formação do corpo embrióide e a sobrevivência celular. Organoides vasculares maduros e diferenciados gerados usando este protocolo são caracterizados por microscopia de imunofluorescência 3D de montagem total para analisar sua morfologia e vasculatura complexa. Este protocolo permite a produção de organoides vasculares de alta qualidade de maneira escalável, potencialmente facilitando seu uso em aplicações de modelagem de doenças e triagem de medicamentos.

Introdução

Modelos microfisiológicos in vitro, incluindo sistemas organoides e de tecido em chip, surgiram na última década ^1,2,3. Esses sistemas tridimensionais (3D) derivados de células humanas abordam as limitações da cultura de células bidimensionais (2D) convencionais e modelos animais, como a falta de muitos componentes no microambiente fisiológico e diferenças genéticas entre as espécies, respectivamente. Eles fornecem mais informações fisiológicas e são mais adequados para modelagem de doenças e triagem de medicamentos do que os modelos convencionais. Entre os modelos microfisiológicos, organoides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) provaram recapitular as características arquitetônicas dos tecidos humanos nativos de forma eficaz e foram desenvolvidos para imitar diferentes órgãos humanos, incluindo o cérebro ^4,5, rim⁶, fígado ^7,8 e retina⁹. Aqui, nos concentramos particularmente na geração de organoides vasculares a partir de hiPSCs e delineamos um protocolo simplificado que visa minimizar as variações entre diferentes amostras e lotes de organoides, melhorando assim a reprodutibilidade geral.

A vasculatura desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase fisiológica em todos os órgãos humanos. A formação da vasculatura envolve os processos de vasculogênese e angiogênese, orquestrados por meio das interações entre células endoteliais e murais (por exemplo, pericitos e células musculares lisas vasculares) e influenciados por vários estímulos¹⁰. Penninger, Wimmer e colegas desenvolveram o primeiro método de geração de organoides vasculares^11,12 que imita esses dois processos. Com os organoides gerados a partir desse método, seu grupo¹² e nós^13,14 demonstraram o potencial dos organoides vasculares para modelar disfunções vasculares em doenças. Por exemplo, em nossos trabalhos recentes ^13,14, fenótipos distintos foram observados, como brotamento de vasos e variações na composição de células murais, entre organoides vasculares que imitam doenças e suas contrapartes do tipo selvagem. Esses exemplos destacam que o modelo organoide vascular pode servir como uma plataforma para triagem de drogas, imitando disfunções vasculares relacionadas à doença.

Construído com base nos trabalhos iniciais de geração de organoides vasculares^11,12, é apresentado um protocolo revisado que inclui o uso de micropoços para facilitar a formação de corpos embrióides homogêneos (EB), um fator crítico para minimizar as variações frequentemente observadas dentro do mesmo lote de geração de organoides. Além disso, o coquetel CEPT, uma combinação de cromano 1, emricasan, poliaminas e o inibidor integrado da resposta ao estresse (trans-ISRIB)¹⁵, é empregado para melhorar a viabilidade de hiPSCs e células diferenciadas durante o processo de formação de EB. Essa modificação é principalmente para reduzir as variações entre diferentes amostras e lotes de organoides. Organoides vasculares uniformes podem ser produzidos com este protocolo de aproximadamente duas semanas, onde a vasculogênese é induzida para ajudar o endotélio a se organizar em redes tubulares primitivas no Dia 1, seguida pela indução da angiogênese no Dia 5 para desenvolver redes vasculares complexas em organoides. No dia 12-15, os organoides gerados devem mostrar redes vasculares maduras compostas por endotélio e células murais.

Protocolo

A Figura 1 apresenta uma visão geral das etapas envolvidas neste protocolo. Informações detalhadas sobre os reagentes e materiais utilizados neste protocolo são fornecidas na Tabela de Materiais. Recomenda-se que todos os meios sejam pré-aquecidos a 37 °C antes do uso, salvo indicação em contrário. Todos os materiais e suprimentos de cultura de células devem ser autoclavados ou estéreis, e o manuseio das células deve ser feito em um gabinete de biossegurança. Além disso, o valor do pH da mistura de colágeno I deve ser cuidadosamente ajustado para pH 7,3 para evitar possíveis problemas de solidificação.

1. Manutenção humana do iPSC

1. Descongele o extrato da matriz da membrana basal no gelo, agite suavemente o frasco para misturar a solução e faça alíquotas de 0,5 mL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta P1000 e pontas pré-refrigeradas. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 1 ano.
2. Descongelar uma alíquota de extracto de matriz (0,5 ml) no gelo. Misture com 49,5 mL de meio DMEM/F12 pré-resfriado em um tubo de 50 mL. Distribua a mistura para cada poço (1,5 mL / poço) em placas de 6 poços e, em seguida, agite suavemente a placa para garantir que a solução líquida cubra todo o poço. Sele as placas com filme de parafina e guarde-as a 4 °C por até 1 semana.
3. Prepare o meio de expansão hiPSC conforme descrito na Tabela 1. Fazer alíquotas do meio completo (40 ml/tubo) e conservar a -20 °C até 1 ano.
4. Colocar uma placa pré-revestida na incubadora a 37 °C durante 1 h antes da cultura hiPSC.
5. Pré-aqueça o meio de expansão hiPSC (40 ml) a 37 °C e prepare o meio de semeadura hiPSC conforme descrito na Tabela 2.
6. Transfira a placa revestida da incubadora a 37 °C para o gabinete de biossegurança. Substitua o meio na placa revestida por meio de semeadura hiPSC (1 mL / poço).
7. Descongele um frasco criopreservado de hiPSCs do tanque criogênico em banho-maria a 37 °C por 1 min.
8. Transfira as células para um tubo de 15 mL e, em seguida, adicione 5 mL de meio DMEM / F12, seguido de centrifugação a 100 x g por 3 min em temperatura ambiente para coletar as células.
9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 1,5 ml de meio de semeadura hiPSC. Ressuspenda suavemente as células no tubo de 15 mL.
10. Alíquota de 10 μl da suspensão celular e misturar com 10 μl de solução de azul de tripano. Transferir a mistura de 10 μL para a lâmina do hemacitómetro e cobri-la com uma lamínula.
11. Monte a corrediça no suporte e insira-a no contador de células automatizado. Aguarde até que o instrumento encontre o foco ou ajuste manualmente o foco pressionando o botão de foco +/- na tela. Depois, use a configuração padrão e pressione o botão Capturar . Utilizar a leitura da densidade celular VIVA como a concentração da suspensão hiPSC preparada a partir do passo 1.9.
12. Semeie 2 × 10⁵ células em cada poço e certifique-se de que as células sejam distribuídas uniformemente no poço.
13. Cultive as células a 37 ° C com 5% de CO₂ e substitua o meio por meio de expansão hiPSC (1,5 mL / poço) após 24 h.
14. Troque o meio diariamente até que as células atinjam uma confluência de 80%. Verifique a morfologia celular e o tamanho da colônia rotineiramente para garantir que não haja diferenciação espontânea. Descarte a cultura e reinicie com um novo lote de hiPSCs se for observada diferenciação espontânea extensa (>5%).

2. Formação EB (Dia 0)

1. No Dia 0, prepare e pré-aqueça o meio DMEM/F12, o meio de semeadura hiPSC e a solução de descolamento celular a 37 °C por 20-30 min.
2. Remova o meio de cultura da placa de 6 poços e adicione a solução de descolamento de células pré-aquecida (1,5 mL / poço). Incubar a placa a 37 °C durante 5-7 min.
3. Transfira a placa para o gabinete de biossegurança, bata na placa para separar as colônias de hiPSC e quebre os agregados.
4. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL. Adicione 4,5 mL de meio DMEM/F12. Pipete suavemente a mistura para cima e para baixo usando uma pipeta sorológica de 10 mL cinco vezes para dissociar as células em uma suspensão unicelular. Evite gerar bolhas.
5. Centrifugue a 100 x g por 3 min em temperatura ambiente para coletar as células.
6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células com 1 mL de meio de semeadura hiPSC usando uma pipeta P1000.
7. Misture 10 μL de suspensão celular com 10 μL de solução de azul de tripano para contagem de células. Transferir 10 μL da mistura para a lâmina do hemacitómetro e cobri-la com uma lamínula. Monte a corrediça no suporte e insira-a no contador de células automatizado. Depois que o instrumento encontrar o foco, pressione o botão Capturar e use a leitura da densidade celular LIVE para determinar a concentração da suspensão hiPSC.
8. Semeie as células na placa de micropoços de fundo redondo de fixação ultrabaixa com uma densidade de 2,7 × 10⁵ células/poço para produzir 500-1.000 células por EB.
9. Adicione 2 mL de meio de semeadura hiPSC a cada poço e misture a solução suavemente para distribuir as células uniformemente.
10. Cultivar as células a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 h.

3. Diferenciação vascular (dia 1 - 5)

1. No Dia 1, prepare o meio de indução do mesoderma (MIM) conforme descrito na Tabela 3 e na Tabela 4 e pré-aqueça a 37 ° C por 20 min. O meio MIM deve ser feito na hora.
2. Use uma pipeta P200 para aspirar cuidadosamente o meio da placa de micropoços sem perturbar os EBs na parte inferior.
3. Adicione 2,5 mL de MIM lentamente usando uma pipeta P200. Cultive os EBs em MIM a 37 °C com 5% de CO₂ por 2 dias.
4. No Dia 3, substitua suavemente o meio por 2,5 mL pré-aquecidos e recém-produzidos do meio de diferenciação vascular 1 (VDM1, Tabela 5) sem perturbar os EBs na parte inferior do micropoço. Cultive as células a 37 °C com 5% de CO₂ por mais 2 dias.

4. Incorporação de hidrogel (dia 5)

1. Prepare a mistura de colágeno I conforme descrito na Tabela 6. Coloque um tubo de 50 mL no gelo e adicione a solução de colágeno I, H₂O, 10× meio DMEM/F12, bicarbonato de sódio e HEPES posteriormente. Misture bem agitando o tubo suavemente. Adicione a solução de NaOH 1 M gota a gota enquanto agita a solução misturada para ajustar o valor do pH para 7.3 e verifique o valor do pH da mistura com um medidor de pH.
   NOTA: Todas as soluções devem ser pré-resfriadas em gelo antes do uso. Realize o procedimento no gelo no gabinete de biossegurança o tempo todo. A adição da solução de NaOH é crítica, e é necessária uma dispersão rápida para fazer uma solução homogênea para evitar a cura local do colágeno I. O volume de NaOH pode variar de acordo com o número de lote da solução de colágeno I usada. Não pipete vigorosamente para misturar, pois a tensão de cisalhamento pode causar pré-cura indesejada.
2. Prepare a mistura de matriz de membrana basal de colágeno I conforme descrito na Tabela 7. Adicione 1,25 mL de matriz de membrana basal à mistura de 5 mL de colágeno I preparada a partir da etapa 4.1. Misture a solução suavemente agitando o tubo.
3. Coloque um prato de 12 poços no gelo por 2 min.
4. Adicione a mistura de matriz de membrana basal de colágeno I lentamente à placa de 12 poços (1,5 mL / poço) usando as pontas de furo largo. Certifique-se de que a mistura seja distribuída uniformemente.
5. Coloque a placa na incubadora a 37 °C por 2 h para solidificar a primeira camada de hidrogel.
6. Mantenha a mistura restante da matriz da membrana basal de colágeno I no gelo para uso posterior.
7. Transfira ~ 60 agregados de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e resfrie o tubo em gelo por 5 min. Remova cuidadosamente o meio com uma ponta de pipeta P200.
   NOTA: Inicie esta etapa 1.5h após a Etapa 4.5.
8. Gota a gota, adicione 1,5 mL de mistura de membrana basal de colágeno I aos agregados e misture-os suavemente usando pontas de pipeta P200 de diâmetro largo.
9. Transfira a placa com a primeira camada de hidrogel da incubadora (etapa 4.5) para o gabinete de biossegurança.
10. Adicione 1,5 mL da suspensão agregada à camada curada. Agite suavemente a placa para distribuir os agregados uniformemente. Evite gerar bolhas.
11. Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO₂ durante mais 2 h.
12. Preparar o meio de diferenciação vascular 2 (VDM2; Tabela 8) e pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C por 20 min antes do uso.
13. Adicione 2 mL de VDM2 a cada poço e cultive as células a 37 ° C com 5% de CO₂.
14. Troque o meio a cada 3 dias com VDM2 pré-aquecido e recém-feito.
    NOTA: (Opcional) Os organoides vasculares podem ser liberados da mistura de gel removendo o gel com uma agulha de seringa. Os organoides vasculares recuperados do gel podem ser mantidos individualmente em uma placa de 96 poços com VDM2 (200 μL/poço). Troque o meio a cada 2-3 dias.

5. 3D Ensaio de imunofluorescência

1. Os organoides vasculares devem amadurecer aproximadamente no dia 13. Para organoides embutidos no hidrogel, aspire o meio cuidadosamente e lave com 2 mL de PBS três vezes (10 min de cada vez). Para organoides recuperados do gel (após a Etapa 4.14), colete de 6 a 10 organoides em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, aspire o meio e lave com 2 mL de PBS três vezes (10 min cada).
2. Adicione 2 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% à amostra e incube a 4 °C durante a noite com selagem por filme de parafina.
3. Remova a solução de PFA e lave a amostra com 2 mL de PBS quatro vezes (15 min de cada vez).
4. Adicione 2 mL de tampão de bloqueio (Tabela 9) e incube em temperatura ambiente por 2 h.
5. Remova o tampão de bloqueio e adicione 1,5 mL de anticorpos primários (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre anticorpos; os anticorpos devem ser diluídos no tampão de bloqueio). Incubar a amostra com anticorpos primários a 4 °C durante 2 dias com agitação suave.
   NOTA: Recomenda-se que o anticorpo primário (CD31, PDGFRβ e ERG1) seja diluído no tampão de bloqueio na proporção de 1:400 (consulte a Tabela de Materiais para obter mais informações).
6. Remova a solução primária de anticorpos e lave com 2 mL de PBST por 1 h seis vezes.
7. Adicione 2 mL de anticorpos secundários (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre anticorpos; os anticorpos devem ser diluídos em PBST) à amostra. Envolva a placa com papel alumínio e incube a 4 °C durante 2 dias agitando suavemente.
   NOTA: Recomenda-se que o anticorpo secundário seja diluído em PBST na proporção de 1:1000 (consulte a Tabela de Materiais para obter mais informações). Mantenha a placa longe da luz durante a incubação e lave a partir desta etapa depois.
8. Remova a solução de anticorpo secundário e lave com 2 mL de TBST seis vezes (1 h de cada vez). Adicione DAPI (1 μg/mL) no tampão de lavagem usado para a última etapa de lavagem se for necessária coloração dos núcleos.
9. Para esses organoides embebidos em gel, corte o gel em 4 pedaços e transfira-os cuidadosamente para tubos de microcentrífuga de 2 mL com uma espátula. Para os organoides recuperados, remova o tampão de lavagem.
10. Use lenços para absorver a solução restante sem tocar no gel ou nos organoides.
11. Adicione 2 mL de reagente de limpeza de tecido solúvel em água (Índice de Refração = 1,49) a cada tubo. Incubar as amostras com reagente de limpeza à temperatura ambiente no escuro até que os organoides fiquem claros (geralmente durante a noite). Não agite as amostras.
12. Transfira os organoides com o reagente de limpeza cuidadosamente para o centro do prato com fundo de vidro usando uma espátula.
13. Cubra os organoides ou a peça de gel com uma lamínula de 24 mm × 24 mm.
14. Empurre a lamínula suavemente para baixo até que fique plana e coloque as amostras no fundo de vidro.
15. Remova o reagente de limpeza redundante no prato e sele a lamínula com esmalte.
16. Para imagens 3D, use um microscópio confocal com objetiva de 10×. Use a varredura de bloco e a varredura de pilha Z para obter imagens de organoides de montagem inteira.

Resultados

A Figura 1A apresenta o esquema deste protocolo, incluindo os principais componentes usados em cada estágio. A diferenciação iniciou-se com a formação de EB, seguida pela indução do mesoderma e especificação da linhagem vascular (Figura 1B-D). Os agregados cresceram maiores e menos esféricos ao longo do tempo. Os organoides começaram a mostrar arestas no dia 5. Depois de incorporadas ...

Discussão

O protocolo descrito inclui duas modificações principais para a geração homogênea e reprodutível de organoides vasculares de alta qualidade. A primeira modificação é o uso de uma placa de micropoços para permitir um melhor controle da uniformidade do EB. Como ponto de partida da diferenciação vascular, o tamanho dos EBs é crítico, pois regula o destino das células-tronco e a eficácia da diferenciação em diferentes linhagens. Variações no tamanho do EB geralmente levam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C