Generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Resumen

Este protocolo presenta un método para generar organoides vasculares utilizando células madre pluripotentes humanas.

Resumen

Los organoides vasculares derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) recapitulan la diversidad de tipos celulares y la compleja arquitectura de las redes vasculares humanas. Este modelo tridimensional (3D) tiene un potencial sustancial para el modelado de patologías vasculares y el cribado de fármacos in vitro . A pesar de los avances recientes, sigue existiendo un desafío técnico clave en la generación reproducible de organoides con una calidad constante, que es crucial para los ensayos y aplicaciones posteriores. Aquí, se presenta un protocolo modificado que mejora tanto la homogeneidad como la reproducibilidad de la generación de organoides vasculares. El protocolo modificado incorpora el uso de micropocillos y el cóctel CEPT (croma 1, emricasan, poliaminas y el inhibidor integrado de la respuesta al estrés, trans-ISRIB) para mejorar la formación de cuerpos embrioides y la supervivencia celular. Los organoides vasculares maduros y diferenciados generados mediante este protocolo se caracterizan mediante microscopía de inmunofluorescencia 3D de montaje completo para analizar su morfología y vasculatura compleja. Este protocolo permite la producción de organoides vasculares de alta calidad de forma escalable, lo que podría facilitar su uso en aplicaciones de modelado de enfermedades y cribado de fármacos.

Introducción

En la última década han surgido modelos microfisiológicos in vitro, incluidos los sistemas de organoides y tejidos en un chip ^1,2,3. Estos sistemas tridimensionales (3D) derivados de células humanas abordan las limitaciones del cultivo celular bidimensional (2D) convencional y de los modelos animales, como la falta de muchos componentes en el microambiente fisiológico y las diferencias genéticas entre especies, respectivamente. Proporcionan más información fisiológica y son más adecuados para el modelado de enfermedades y el cribado ....

Protocolo

La Figura 1 presenta una descripción general de los pasos involucrados en este protocolo. La información detallada sobre los reactivos y materiales utilizados en este protocolo se proporciona en la Tabla de Materiales. Se recomienda que todos los medios se precalienten a 37 °C antes de su uso, a menos que se especifique lo contrario. Todos los materiales y suministros de cultivo celular deben ser esterilizados en autoclave, y el manejo de las células debe realizarse en un gabinete de bioseguridad. Además, el valor de pH de la mezcla de colágeno I debe ajustarse cuidadosamente a un pH de 7....

Resultados

La Figura 1A presenta el esquema de este protocolo, incluidos los componentes clave utilizados en cada etapa. La diferenciación comenzó con la formación de EB, seguida de la inducción del mesodermo y la especificación del linaje vascular (Figura 1B-D). Los agregados se hicieron más grandes y menos esféricos con el tiempo. Los organoides comenzaron a mostrar bordes ásperos el día 5. Desp.......

Discusión

El protocolo descrito incluye dos modificaciones clave para la generación homogénea y reproducible de organoides vasculares de alta calidad. La primera modificación es el uso de una placa de micropocillos para permitir un mejor control de la uniformidad del EB. Como punto de partida de la diferenciación vascular, el tamaño de las EB es crítico, ya que regula el destino de las células madre y la eficacia de la diferenciación hacia diferentes linajes. Las variaciones en el tamaño .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C