ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

要約

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。

要約

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来する血管オルガノイドは、ヒト血管ネットワークの細胞型の多様性と複雑な構造を再現しています。この3次元(3D)モデルは、血管病理モデリングや in vitro 薬物スクリーニングに大きな可能性を秘めています。近年の進歩にもかかわらず、一貫した品質のオルガノイドを再現性よく作製するという重要な技術的課題が残っており、これはダウンストリームのアッセイやアプリケーションにとって非常に重要です。ここでは、血管オルガノイド生成の均質性と再現性の両方を改善する修正されたプロトコルを示します。修正されたプロトコルには、マイクロウェルとCEPTカクテル(クロマン1、エムリカサン、ポリアミン、および統合ストレス応答阻害剤であるtrans-ISRIB)の使用が組み込まれており、胚様体の形成と細胞生存を改善します。このプロトコールを使用して作製した分化した成熟血管オルガノイドは、ホールマウント3D免疫蛍光顕微鏡によって特徴付けられ、その形態と複雑な血管系を解析します。このプロトコルにより、高品質な血管オルガノイドをスケーラブルな方法で作製することができ、疾患モデリングや薬物スクリーニングアプリケーションでの使用が容易になる可能性があります。

概要

オルガノイド系やTissue-on-a-chip系などのin vitro微生理学的モデルが、過去10年間で登場しました^1,2,3。これらの3次元(3D)ヒト細胞由来システムは、従来の2次元(2D)細胞培養および動物モデルにおける制限(生理学的微小環境における多くの成分の欠如や種間の遺伝的差異など)に対処します。従来のモデルよりも生理学的な洞察が得られ、疾患モデリングや薬物スクリーニングに適しています。ミクロ生理学的モデルの中で、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来するオルガノイドは、天然のヒト組織の構造的特徴を効果的に再現することが証明されており、脳^4,5、腎臓⁶、肝臓^7,8、網膜⁹などのさまざまなヒト臓器を模倣するように開発されています.ここでは、特にヒトiPS細胞からの血管オルガノイドの作製に焦点を当て、異なるオルガノイドサンプルやバッチ間のばらつきを最小限に抑え、全体的な再現性を向上させることを目的とした合理化されたプロトコールの概要を説明します。

血管系は、すべての人間の臓器の生理学的恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。血管系の形成には、血管新生および血管新生の過程が関与し、内皮細胞と壁細胞(例えば、周皮細胞および血管平滑筋細胞)細胞との間の相互作用を通じて調整され、さまざまな刺激によって影響を受ける¹⁰。Penninger、Wimmerらは、これら2つのプロセスを模倣した最初の血管オルガノイド生成法^11,12を開発した。この方法で生成されたオルガノイドにより、彼らのグループ¹²と私たち^13,14は、血管オルガノイドが疾患の血管機能不全をモデル化する可能性を実証しました。例えば、最近の研究^13,14では、疾患を模倣する血管オルガノイドとそれに対応する野生型オルガノイドとの間で、血管の発芽や壁細胞組成の変動など、異なる表現型が観察された。これらの例は、血管オルガノイドモデルが、疾患関連の血管機能不全を模倣することにより、薬物スクリーニングのプラットフォームとして役立つ可能性があることを強調しています。

初期の血管オルガノイド生成研究^11,12に基づいて、同じオルガノイド生成バッチ内でしばしば見られる変動を最小限に抑えるための重要な要素である均質な胚様体(EB)形成を促進するためのマイクロウェルの使用を含む改訂されたプロトコルが提示されます。さらに、クロマン1、エムリカサン、ポリアミン、および統合ストレス応答阻害剤(trans-ISRIB)¹⁵を組み合わせたCEPTカクテルは、EB形成過程におけるhiPS細胞および分化細胞の生存率を改善するために用いられる。この変更は、主に異なるオルガノイドサンプルとバッチ間のばらつきを減らすためのものです。この約2週間のプロトコルでは、1日目に血管形成を誘導して内皮を原始的な尿細管網に組織化させ、続いて5日目に血管新生を誘導してオルガノイドに複雑な血管網を発達させるという、均一な血管オルガノイドを作製することができます。12-15日目に、生成されたオルガノイドは、内皮細胞と壁細胞の両方で構成される成熟した血管ネットワークを示すはずです。

プロトコル

図 1 は、このプロトコルに関連する手順の概要を示しています。このプロトコールで使用される試薬および材料に関する詳細な情報は、 材料の表に記載されています。特に指定がない限り、すべてのメディアは使用前に37°Cで予温することをお勧めします。すべての細胞培養材料と消耗品はオートクレーブ滅菌または滅菌済みで、細胞の取り扱いはバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。さらに、コラーゲンI混合物のpH値は、固化の問題を避けるために、pH 7.3に慎重に調整する必要があります。

1. ヒトiPS細胞のメンテナンス

1. 基底膜マトリックス抽出物を氷上で解凍し、ボトルを静かに振って溶液を混合し、P1000ピペットと冷蔵チップを使用して1.5mLの微量遠心チューブに0.5mLのアリコートを作製します。アリコートは-20°Cで最大1年間保管します。
2. マトリックス抽出物1アリコート(0.5mL)を氷上で解凍します。50 mLチューブに49.5 mLの予冷済みDMEM/F12培地と混合します。混合物を6ウェルプレートの各ウェル(1.5 mL/ウェル)に分配し、プレートを静かに振とうして、液体溶液がウェル全体を覆うようにします。プレートをパラフィンフィルムで密封し、4°Cで最大1週間保存します。
3. 表 1 の説明に従って、hiPSC 拡張メディアを準備します。培地全体(40 mL/チューブ)で分注し、-20°Cで最大1年間保存します。
4. プレコートプレートを37°Cのインキュベーターに1時間入れてから、hiPSCを培養します。
5. hiPSC増殖培地(40mL)を37°Cで予温し、 表2に記載の通りにhiPSC播種培地を調製します。
6. コーティングされたプレートを37°Cインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移します。コーティングしたプレートの培地をhiPSC播種培地(1 mL/ウェル)と交換します。
7. クライオタンクから凍結保存された hiPSC のバイアルを 37 °C のウォーターバスで 1 分間解凍します。
8. 細胞を15 mLチューブに移し、5 mLのDMEM/F12培地を添加した後、100 x g で室温で3分間遠心分離して細胞を回収します。
9. 上清を吸引し、1.5 mLのhiPSC播種培地で細胞を再懸濁します。15 mLチューブに細胞を穏やかに再懸濁します。
10. 細胞懸濁液10μLを分量し、トリパンブルー溶液10μLと混合します。10 μLの混合物を血球計算盤スライドに移し、カバースリップで覆います。
11. スライドをホルダーに取り付け、自動セルカウンターに挿入します。機器がフォーカスを見つけるのを待つか、画面上の フォーカス+/- ボタンを押して手動でフォーカスを調整します。その後、デフォルト設定 を使用してキャプチャボタンを押します 。 LIVE細胞密度の読み取り 値を、ステップ1.9で調製したhiPSC懸濁液の濃度として使用します。
12. 各ウェルに2個×10個の⁵ 個の細胞を播種し、細胞がウェル内に均一に分布していることを確認します。
13. 細胞を5% CO₂ で37°Cで培養し、24時間後に培地をhiPSC増殖培地(1.5 mL/ウェル)と交換します。
14. 細胞が80%のコンフルエントに達するまで、毎日培地を交換します。細胞の形態とコロニーサイズを定期的にチェックして、自然分化がないことを確認してください。培養物を廃棄し、広範囲(>5%)の自然分化が観察された場合は、新しいhiPSCのバッチで再開します。

2. EB形成(0日目)

1. 0日目に、DMEM/F12培地、hiPSC播種培地、および細胞剥離溶液を調製し、37°Cで20〜30分間予温します。
2. 6ウェルプレートから培地を取り出し、予め加温した細胞剥離溶液(1.5 mL/ウェル)を加えます。プレートを37°Cで5〜7分間インキュベートします。
3. プレートをバイオセーフティキャビネットに移し、プレートを軽くたたいてhiPSCコロニーを分離し、凝集体を分解します。
4. 細胞懸濁液を15mLチューブに移します。4.5 mLのDMEM/F12培地を加えます。10 mLの血清ピペットを5回使用して混合物を静かに上下にピペッティングし、細胞を解離して単一細胞懸濁液にします。気泡の発生を避けてください。
5. 100 x g で室温で3分間遠心分離し、細胞を回収します。
6. 上清を吸引し、P1000ピペットを使用して1 mLのhiPSC播種培地で細胞を穏やかに再懸濁します。
7. 細胞懸濁液10 μLをトリパンブルー溶液10 μLと混合して細胞計数します。混合物10μLを血球計算盤スライドに移し、カバースリップで覆います。スライドをホルダーに取り付け、自動セルカウンターに挿入します。装置がフォーカスを見つけたら、 Capture ボタンを押し、 LIVE細胞密度の読み取り 値を使用して、hiPSC懸濁液の濃度を決定します。
8. 超低接着の丸底マイクロウェルプレートに、密度2.7 × 10⁵ 細胞/ウェルの細胞を播種し、EBあたり500〜1,000個の細胞を生成します。
9. 各ウェルに2 mLのhiPSC播種培地を加え、溶液を穏やかに混合して細胞を均一に分配します。
10. 細胞を37°Cで5%_CO2 で24時間培養します。

3. 血管分化(1日目 - 5日目)

1. 1日目に、 表3 および 表4 に記載されているように中胚葉誘導培地(MIM)を調製し、37°Cで20分間予温します。MIM媒体は、新しく作られている必要があります。
2. P200ピペットを使用して、底部のEBを乱さずにマイクロウェルプレートから培地を慎重に吸引します。
3. P200ピペットを使用して2.5mLのMIMをゆっくりと加えます。EBをMIMで37°C、5%_CO2 で2日間培養します。
4. 3日目に、マイクロウェルの底部にあるEBを乱さずに、温めたばかりの作りたての血管分化培地1(VDM1、 表5)と培地を静かに交換します。細胞を5%_CO2 で37°Cでさらに2日間培養します。

4. ハイドロゲル包埋(5日目)

1. 表6に記載されているように、コラーゲンI混合物を調製します。50mLのチューブを氷の上に置き、続いてコラーゲンI溶液、H₂O、10× DMEM/F12培地、重炭酸ナトリウム、HEPESを加えます。チューブを軽く振ってよく混ぜます。混合溶液を振とうしながら1 M NaOH溶液を滴下してpH値を7.3に調整し、pHメーターで混合物のpH値を確認します。
   注:すべての溶液は、使用前に氷上で予冷する必要があります。バイオセーフティキャビネット内の氷上で常に手順を実行してください。NaOH溶液の添加は重要であり、コラーゲンIの局所硬化を避けるためには、均一な溶液を作るための迅速な分散が必要です。NaOHの量は、使用するコラーゲンI溶液のロット数によって異なる場合があります。せん断応力が望ましくない予備硬化を引き起こす可能性があるため、混合のために激しくピペッティングしないでください。
2. 表7に記載されているように、コラーゲンI基底膜マトリックス混合物を調製します。ステップ4.1で調製した5 mLのコラーゲンI混合物に、1.25 mLの基底膜マトリックスを加えます。チューブを振って溶液を穏やかに混合します。
3. 12ウェルプレートを氷上に2分間置きます。
4. コラーゲンI基底膜マトリックス混合物を、ワイドボアチップを使用して12ウェルプレート(1.5 mL/ウェル)にゆっくりと加えます。混合物が均等に分布していることを確認してください。
5. プレートを37°Cインキュベーターに2時間入れて、ヒドロゲルの最初の層を固めます。
6. 残りのコラーゲンI基底膜マトリックス混合物は、後で使用するために氷上に置いておきます。
7. ~60個の細胞凝集体を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、チューブを氷上で5分間冷却します。P200ピペットチップで培地を慎重に取り外します。
   注意: この手順は、手順4.5の1.5時間後に開始します。
8. 滴下して、1.5 mLのコラーゲンI基底メンブレン混合物を凝集体に加え、ワイドボアP200ピペットチップを使用してそれらを穏やかに混合します。
9. ハイドロゲルの第1層が入ったプレートをインキュベーター(ステップ4.5)からバイオセーフティキャビネットに移します。
10. 硬化層に骨材懸濁液1.5 mLを加えます。プレートを静かに振って、骨材を均等に分散させます。気泡の発生は避けてください。
11. プレートを5%CO₂ とともに37°Cでさらに2時間インキュベートします。
12. 血管分化培地2(VDM2; 表8)使用前に培地を37°Cのウォーターバスで20分間予温します。
13. 各ウェルに2 mLのVDM2を添加し、5% CO₂で細胞を37°Cで培養します。
14. 3日ごとに、あらかじめ温めた作りたてのVDM2とメディウムを交換します。
    注:(オプション)血管オルガノイドは、シリンジ針でゲルを除去することにより、ゲル混合物から放出することができます。ゲルから取り出した血管オルガノイドは、VDM2(200 μL/well)を塗布した96ウェルプレートで個別に保持することができます。2〜3日ごとに媒体を交換してください。

5. 3D 免疫蛍光染色法

1. 血管オルガノイドは、およそ13日目に成熟するはずです。ハイドロゲルに埋め込まれたオルガノイドの場合は、培地を慎重に吸引し、2 mL PBSで3回(毎回10分)洗浄します。ゲルから取り出したオルガノイドの場合(ステップ4.14以降)、2 mLの微量遠心チューブに6〜10個のオルガノイドを回収し、培地を吸引し、2 mLのPBSで3回(各10分)洗浄します。
2. 2 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をサンプルに加え、パラフィンフィルムシーリングを使用して4°Cで一晩インキュベートします。
3. PFA溶液を取り出し、サンプルを2 mL PBSで4回(毎回15分)洗浄します。
4. ブロッキングバッファー2 mL(表9)を加え、室温で2時間インキュベートします。
5. ブロッキングバッファーを取り出し、1.5 mLの一次抗体を添加します(抗体情報については 、材料の表 を参照;抗体はブロッキングバッファーで希釈する必要があります)。サンプルを一次抗体と4°Cで2日間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
   注意:一次抗体(CD31、PDGFRβ、およびERG1)は、ブロッキングバッファー中で1:400の比率で希釈することをお勧めします(詳細については 、材料の表 を参照)。
6. 一次抗体溶液を取り出し、2 mLのPBSTで1時間6回洗浄します。
7. 2 mLの二次抗体をサンプルに加えます(抗体情報については 「Table of Materials 」を参照、抗体はPBSTで希釈する必要があります)。プレートをアルミホイルで包み、4°Cで2日間、穏やかに振ってインキュベートします。
   注:二次抗体は、PBSTで1:1000の比率で希釈することをお勧めします(詳細については、 材料の表 を参照)。インキュベーション中はプレートを光から遠ざけ、その後このステップから洗い流してください。
8. 二次抗体溶液を取り出し、TBST2 mLで6回(各回1時間)洗浄します。核染色が必要な場合は、最後の洗浄ステップで使用した洗浄バッファーにDAPI(1 μg/mL)を添加します。
9. これらのゲル包埋オルガノイドの場合は、ゲルを4分割し、スパチュラで2 mLの微量遠心チューブに慎重に移します。回収したオルガノイドについては、洗浄バッファーを取り出します。
10. ワイプを使用して、ゲルやオルガノイドに触れずに残りの溶液を吸収します。
11. 各チューブに2 mLの水溶性組織透明試薬(屈折率= 1.49)を加えます。透明化試薬と透明化試薬を室温で暗所でインキュベートし、オルガノイドが透明になるまで(通常は一晩中)。サンプルを振らないでください。
12. 透明化試薬を含ませたオルガノイドを、ヘラを使ってガラス底の皿の中央に慎重に移します。
13. オルガノイドまたはゲルピースを24 mm×24 mmのカバースリップで覆います。
14. カバースリップを平らになるまで静かに押し下げ、サンプルをガラスの底に挟みます。
15. 皿の中の余分なクリア試薬を取り除き、カバーガラスをマニキュアで密封します。
16. 3Dイメージングには、対物レンズが10×の共焦点顕微鏡を使用します。タイルスキャンとZスタックスキャンを使用して、オルガノイドの全マウント画像を取得します。

結果

図1Aは、各ステージで使用される主要なコンポーネントを含む、このプロトコルのスキームを示しています。分化はEB形成から始まり、中胚葉誘導と血管系譜の仕様が続きました(図1B-D)。凝集体は時間の経過とともに大きくなり、球形が少なくなりました。オルガノイドは5日目から粗いエッジを示...

ディスカッション

記載されているプロトコールには、高品質の血管オルガノイドを均一で再現性よく生成するための2つの主要な修飾が含まれています。最初の変更は、EB均一性をより適切に制御できるようにするためのマイクロウェルプレートの使用です。血管分化の出発点として、EBのサイズは幹細胞の運命とさまざまな系統に対する分化効果を調節するため、非常に重要です。EB?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C