ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

要約

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。

要約

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来する血管オルガノイドは、ヒト血管ネットワークの細胞型の多様性と複雑な構造を再現しています。この3次元(3D)モデルは、血管病理モデリングや in vitro 薬物スクリーニングに大きな可能性を秘めています。近年の進歩にもかかわらず、一貫した品質のオルガノイドを再現性よく作製するという重要な技術的課題が残っており、これはダウンストリームのアッセイやアプリケーションにとって非常に重要です。ここでは、血管オルガノイド生成の均質性と再現性の両方を改善する修正されたプロトコルを示します。修正されたプロトコルには、マイクロウェルとCEPTカクテル(クロマン1、エムリカサン、ポリアミン、および統合ストレス応答阻害剤であるtrans-ISRIB)の使用が組み込まれており、胚様体の形成と細胞生存を改善します。このプロトコールを使用して作製した分化した成熟血管オルガノイドは、ホールマウント3D免疫蛍光顕微鏡によって特徴付けられ、その形態と複雑な血管系を解析します。このプロトコルにより、高品質な血管オルガノイドをスケーラブルな方法で作製することができ、疾患モデリングや薬物スクリーニングアプリケーションでの使用が容易になる可能性があります。

概要

オルガノイド系やTissue-on-a-chip系などのin vitro微生理学的モデルが、過去10年間で登場しました^1,2,3。これらの3次元(3D)ヒト細胞由来システムは、従来の2次元(2D)細胞培養および動物モデルにおける制限(生理学的微小環境における多くの成分の欠如や種間の遺伝的差異など)に対処します。従来のモデルよりも生理学的な洞察が得られ、疾患モデリングや薬物スクリーニングに適しています。ミクロ生理学的モデルの中で、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来するオルガノイドは、天然のヒト組織の構造的特徴を効果的に再現することが証明されており、脳^4,5、腎臓⁶、肝臓^7,8、網膜⁹などのさまざまなヒト臓器を模倣するように開発されています.ここでは、特にヒトiPS細胞からの血管オルガノイドの作製に焦点を当て、異なるオルガノイドサンプ....

プロトコル

図 1 は、このプロトコルに関連する手順の概要を示しています。このプロトコールで使用される試薬および材料に関する詳細な情報は、 材料の表に記載されています。特に指定がない限り、すべてのメディアは使用前に37°Cで予温することをお勧めします。すべての細胞培養材料と消耗品はオートクレーブ滅菌または滅菌済みで、細胞の取り扱いはバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。さらに、コラーゲンI混合物のpH値は、固化の問題を避けるために、pH 7.3に慎重に調整する必要があります。

1. ヒトiPS細胞のメンテナンス

1. 基底膜マトリックス抽出物を氷上で解凍し、ボトルを静かに振って溶液を混合し、P1000ピペットと冷蔵チップを使用して1.5mLの微量遠心チューブに0.5mLのアリコートを作製します。アリコートは-20°Cで最大1年間保管します。
2. マトリックス抽出物1アリコート(0.5mL)を氷上で解凍します。50 mLチューブに49.5 mLの予冷済みDMEM/F12培地と混合します。混合物を6ウェルプレートの各ウェル(1.5 mL/ウェル)に分配し、プレートを静かに振とうして、液体溶液がウェル全体を覆うようにします。プレートをパラフィンフィルムで密封し....

ディスカッション

記載されているプロトコールには、高品質の血管オルガノイドを均一で再現性よく生成するための2つの主要な修飾が含まれています。最初の変更は、EB均一性をより適切に制御できるようにするためのマイクロウェルプレートの使用です。血管分化の出発点として、EBのサイズは幹細胞の運命とさまざまな系統に対する分化効果を調節するため、非常に重要です。EB?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C