İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

Özet

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen vasküler organoidler, insan vasküler ağlarının hücre tipi çeşitliliğini ve karmaşık mimarisini özetler. Bu üç boyutlu (3D) model, vasküler patoloji modellemesi ve in vitro ilaç taraması için önemli bir potansiyele sahiptir. Son zamanlardaki gelişmelere rağmen, aşağı akış tahlilleri ve uygulamaları için çok önemli olan, tutarlı kaliteye sahip organoidlerin tekrarlanabilir şekilde üretilmesinde önemli bir teknik zorluk devam etmektedir. Burada, vasküler organoid oluşumunun hem homojenliğini hem de tekrarlanabilirliğini artıran modifiye edilmiş bir protokol sunulmaktadır. Modifiye edilmiş protokol, embriyoid vücut oluşumunu ve hücre sağkalımını iyileştirmek için mikro kuyuların ve CEPT kokteylinin (kroman 1, emricasan, poliaminler ve entegre stres yanıt inhibitörü, trans-ISRIB) kullanımını içerir. Bu protokol kullanılarak oluşturulan farklılaşmış, olgun vasküler organoidler, morfolojilerini ve karmaşık vaskülatürlerini analiz etmek için tam montajlı 3D immünofloresan mikroskobu ile karakterize edilir. Bu protokol, yüksek kaliteli vasküler organoidlerin ölçeklenebilir bir şekilde üretilmesini sağlayarak, potansiyel olarak hastalık modellemesi ve ilaç tarama uygulamalarında kullanımlarını kolaylaştırır.

Giriş

Organoid ve çip üzerinde doku sistemleri de dahil olmak üzere in vitro mikrofizyolojik modeller son on yılda ortaya çıkmıştır ^1,2,3. Bu üç boyutlu (3D), insan hücresinden türetilmiş sistemler, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve hayvan modellerindeki, sırasıyla fizyolojik mikro çevrede birçok bileşenin eksikliği ve türler arasındaki genetik farklılıklar gibi sınırlamaları ele alır. Daha fazla fizyolojik içgörü sağlarlar ve geleneksel modellere göre hastalık modellemesi ve ilaç taraması için daha uygundurlar. Mikrofizyolojik ....

Protokol

Şekil 1 , bu protokolde yer alan adımlara genel bir bakış sunmaktadır. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve malzemeler ile ilgili detaylı bilgi Malzeme Tablosunda verilmiştir. Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamların kullanımdan önce 37 °C'de önceden ısıtılması önerilir. Tüm hücre kültürü materyalleri ve malzemeleri ya otoklavlanmalı ya da steril olmalı ve hücre kullanımı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Ek olarak, olası katılaşma sorunlarını önlemek için kollajen I karışımının pH değeri dikkatlice pH 7.3'e ayarlanmalıdır.

1. İnsan iPSC bakımı

Tartışmalar

Açıklanan protokol, yüksek kaliteli vasküler organoidlerin homojen ve tekrarlanabilir üretimi için iki temel modifikasyon içerir. İlk modifikasyon, EB homojenliğinin daha iyi kontrol edilmesini sağlamak için bir mikro kuyu plakasının kullanılmasıdır. Vasküler farklılaşmanın başlangıç noktası olarak, EB'lerin boyutu, kök hücre kaderini ve farklı soylara doğru farklılaşma etkinliğini düzenlediği için kritik öneme sahiptir. EB boyutundaki değişiklikler g.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C