İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

Özet

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen vasküler organoidler, insan vasküler ağlarının hücre tipi çeşitliliğini ve karmaşık mimarisini özetler. Bu üç boyutlu (3D) model, vasküler patoloji modellemesi ve in vitro ilaç taraması için önemli bir potansiyele sahiptir. Son zamanlardaki gelişmelere rağmen, aşağı akış tahlilleri ve uygulamaları için çok önemli olan, tutarlı kaliteye sahip organoidlerin tekrarlanabilir şekilde üretilmesinde önemli bir teknik zorluk devam etmektedir. Burada, vasküler organoid oluşumunun hem homojenliğini hem de tekrarlanabilirliğini artıran modifiye edilmiş bir protokol sunulmaktadır. Modifiye edilmiş protokol, embriyoid vücut oluşumunu ve hücre sağkalımını iyileştirmek için mikro kuyuların ve CEPT kokteylinin (kroman 1, emricasan, poliaminler ve entegre stres yanıt inhibitörü, trans-ISRIB) kullanımını içerir. Bu protokol kullanılarak oluşturulan farklılaşmış, olgun vasküler organoidler, morfolojilerini ve karmaşık vaskülatürlerini analiz etmek için tam montajlı 3D immünofloresan mikroskobu ile karakterize edilir. Bu protokol, yüksek kaliteli vasküler organoidlerin ölçeklenebilir bir şekilde üretilmesini sağlayarak, potansiyel olarak hastalık modellemesi ve ilaç tarama uygulamalarında kullanımlarını kolaylaştırır.

Giriş

Organoid ve çip üzerinde doku sistemleri de dahil olmak üzere in vitro mikrofizyolojik modeller son on yılda ortaya çıkmıştır ^1,2,3. Bu üç boyutlu (3D), insan hücresinden türetilmiş sistemler, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve hayvan modellerindeki, sırasıyla fizyolojik mikro çevrede birçok bileşenin eksikliği ve türler arasındaki genetik farklılıklar gibi sınırlamaları ele alır. Daha fazla fizyolojik içgörü sağlarlar ve geleneksel modellere göre hastalık modellemesi ve ilaç taraması için daha uygundurlar. Mikrofizyolojik modeller arasında, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen organoidlerin, doğal insan dokularının mimari özelliklerini etkili bir şekilde özetlediği kanıtlanmıştır ve beyin ^4,5, böbrek⁶, karaciğer ^7,8 ve retina⁹ dahil olmak üzere farklı insan organlarını taklit etmek üzere geliştirilmiştir. Burada, özellikle hiPSC'lerden vasküler organoidlerin üretilmesine odaklanıyoruz ve farklı organoid numuneleri ve partileri arasındaki varyasyonları en aza indirmeyi ve böylece genel tekrarlanabilirliği iyileştirmeyi amaçlayan kolaylaştırılmış bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz.

Vaskülatür, tüm insan organlarında fizyolojik homeostazın korunmasında çok önemli bir rol oynar. Vaskülatür oluşumu, endotel ve mural (örneğin, perisitler ve vasküler düz kas hücreleri) hücreler arasındaki etkileşimler yoluyla düzenlenen ve çeşitli uyaranlardan etkilenen vaskülogenez ve anjiyogenez süreçlerini içerir¹⁰. Penninger, Wimmer ve meslektaşları, bu iki süreci taklit eden ilk vasküler organoid üretim yöntemini^11,12 geliştirdiler. Bu yöntemden üretilen organoidlerle, onların grubu¹² ve biz^13,14, hastalıklardaki vasküler arızaları modellemek için vasküler organoidlerin potansiyelini göstermiştir. Örneğin, son çalışmalarımızda^13,14, hastalığı taklit eden vasküler organoidler ile bunların vahşi tip muadilleri arasında damar filizlenmesi ve duvar hücre bileşimi varyasyonları gibi farklı fenotipler gözlenmiştir. Bu örnekler, vasküler organoid modelin, hastalığa bağlı vasküler arızaları taklit ederek ilaç taraması için bir platform görevi görebileceğini vurgulamaktadır.

İlk vasküler organoid üretim çalışmaları^11,12 üzerine inşa edilen, aynı organoid üretim partisinde sıklıkla görülen varyasyonları en aza indirmede kritik bir faktör olan homojen embriyoid cisim (EB) oluşumunu kolaylaştırmak için mikrokuyu kullanımını içeren revize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Ek olarak, kroman 1, emricasan, poliaminler ve entegre stres yanıt inhibitörü (trans-ISRIB)^15'in bir kombinasyonu olan CEPT kokteyli, EB oluşum süreci sırasında hiPSC'lerin ve farklılaşmış hücrelerin canlılığını iyileştirmek için kullanılır. Bu modifikasyon esas olarak farklı organoid numuneleri ve partileri arasındaki varyasyonları azaltmak içindir. Üniform vasküler organoidler, 1. günde endotelin ilkel tübüler ağlara dönüşmesine yardımcı olmak için vaskülogenezin indüklendiği ve ardından organoidlerde karmaşık vasküler ağlar geliştirmek için 5. günde anjiyogenez indüksiyonunun yapıldığı bu kabaca iki haftalık protokolle üretilebilir. 12-15. günlerde, üretilen organoidler hem endotel hem de duvar hücrelerinden oluşan olgun vasküler ağlar göstermelidir.

Protokol

Şekil 1 , bu protokolde yer alan adımlara genel bir bakış sunmaktadır. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve malzemeler ile ilgili detaylı bilgi Malzeme Tablosunda verilmiştir. Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamların kullanımdan önce 37 °C'de önceden ısıtılması önerilir. Tüm hücre kültürü materyalleri ve malzemeleri ya otoklavlanmalı ya da steril olmalı ve hücre kullanımı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Ek olarak, olası katılaşma sorunlarını önlemek için kollajen I karışımının pH değeri dikkatlice pH 7.3'e ayarlanmalıdır.

1. İnsan iPSC bakımı

1. Bazal membran matris ekstraktını buz üzerinde çözdürün, çözeltiyi karıştırmak için şişeyi hafifçe sallayın ve bir P1000 pipeti ve önceden soğutulmuş uçlar kullanarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 0,5 mL alikotlar yapın. Alikotları -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
2. Buz üzerinde bir matris özütü (0.5 mL) çözdürün. 50 mL'lik bir tüpte 49,5 mL önceden soğutulmuş DMEM / F12 ortamı ile karıştırın. Karışımı her bir oyuğa (1,5 mL / oyuk) 6 oyuklu plakalarda dağıtın ve ardından sıvı çözeltinin tüm kuyuyu kapladığından emin olmak için plakayı hafifçe sallayın. Plakaları parafin film ile kapatın ve 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
3. hiPSC genleşme ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Tam ortamın (40 mL / tüp) alikotlarını yapın ve -20 ° C'de 1 yıla kadar saklayın.
4. HiPSC kültüründen önce 37 ° C'lik inkübatöre 1 saat boyunca önceden kaplanmış bir plaka koyun.
5. hiPSC genleşme ortamını (40 mL) 37 °C'de önceden ısıtın ve hiPSC tohumlama ortamını Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlayın.
6. Kaplanmış plakayı 37 °C'lik inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın. Kaplanmış plakadaki ortamı hiPSC tohumlama ortamı (1 mL/kuyucuk) ile değiştirin.
7. Kriyotanktan dondurularak saklanmış bir hiPSC şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 dakika boyunca çözdürün.
8. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve ardından 5 mL DMEM / F12 ortamı ekleyin, ardından hücreleri toplamak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
9. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1.5 mL hiPSC tohumlama ortamı ile yeniden süspanse edin. 15 mL'lik tüpteki hücreleri yavaşça yeniden süspanse edin.
10. 10 μL hücre süspansiyonunu çıkarın ve 10 μL tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. 10 μL'lik karışımı hemasitometre lamına aktarın ve üzerini bir lamel ile örtün.
11. Sürgüyü tutucuya monte edin ve otomatik hücre sayacına yerleştirin. Enstrümanın odağı bulmasını bekleyin veya ekrandaki odak +/- düğmesine basarak odağı manuel olarak ayarlayın. Ardından, varsayılan ayarı kullanın ve Ele geçirmek düğmesine basın. Adım 1.9'dan itibaren hazırlanan hiPSC süspansiyonunun konsantrasyonu olarak CANLI hücre yoğunluğu okumasını kullanın.
12. Her oyuğa 2 ×^{10 5} hücre tohumlayın ve hücrelerin kuyuya eşit olarak dağıldığından emin olun.
13. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile kültürleyin ve ortamı 24 saat sonra hiPSC genleşme ortamı (1.5 mL / kuyu) ile değiştirin.
14. Hücreler% 80'lik bir birleşmeye ulaşana kadar ortamı günlük olarak değiştirin. Spontan farklılaşma olmadığından emin olmak için hücre morfolojisini ve koloni boyutunu rutin olarak kontrol edin. Kültürü atın ve geniş (%>5) spontan farklılaşma gözlenirse yeni bir hiPSC partisi ile yeniden başlatın.

2. EB oluşumu (Gün 0)

1. 0. Günde, DMEM/F12 ortamı, hiPSC tohumlama ortamı ve hücre ayırma çözeltisini 37 °C'de 20-30 dakika hazırlayın ve önceden ısıtın.
2. Kültür ortamını 6 oyuklu plakadan çıkarın ve önceden ısıtılmış hücre ayırma çözeltisi (1.5 mL / oyuk) ekleyin. Plakayı 37 °C'de 5-7 dakika inkübe edin.
3. Plakayı biyogüvenlik kabinine aktarın, hiPSC kolonilerini ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve agregaları parçalayın.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 4.5 mL DMEM / F12 ortamı ekleyin. Hücreleri tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak karışımı beş kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Baloncuk oluşturmaktan kaçının.
5. Hücreleri toplamak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
6. Süpernatanı aspire edin ve bir P1000 pipeti kullanarak hücreleri 1 mL hiPSC tohumlama ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin.
7. Hücre sayımı için 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Karışımın 10 μL'sini hemasitometre lamına aktarın ve bir lamel ile örtün. Sürgüyü tutucuya monte edin ve otomatik hücre sayacına yerleştirin. Cihaz odağı bulduktan sonra, Yakala düğmesine basın ve hiPSC süspansiyonunun konsantrasyonunu belirlemek için CANLI hücre yoğunluğu okumasını kullanın.
8. EB başına 500-1.000 hücre elde etmek için hücreleri 2.7 ×^{10 5} hücre / kuyu yoğunluğuna sahip ultra düşük bağlantılı yuvarlak tabanlı mikro kuyu plakasına tohumlayın.
9. Her oyuğa 2 mL hiPSC tohumlama ortamı ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için çözeltiyi hafifçe karıştırın.
10. Hücreleri 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 CO₂ ile kültürleyin.

3. Vasküler farklılaşma (Gün 1 - 5)

1. 1. Günde, mezoderm indüksiyon ortamını (MIM) Tablo 3 ve Tablo 4'te açıklandığı gibi hazırlayın ve 37 ° C'de 20 dakika önceden ısıtın. MIM besiyeri taze olarak yapılmalıdır.
2. Alttaki EB'leri rahatsız etmeden ortamı mikro kuyu plakasından dikkatlice aspire etmek için bir P200 pipeti kullanın.
3. Bir P200 pipeti kullanarak yavaşça 2,5 mL MIM ekleyin. MIM'deki EB'leri 2 gün boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de kültürleyin.
4. 3. Günde, mikrokuyunun dibindeki EB'leri rahatsız etmeden ortamı önceden ısıtılmış, taze yapılmış 2,5 mL vasküler farklılaşma ortamı 1 (VDM1, Tablo 5) ile nazikçe değiştirin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 2 gün daha kültürleyin.

4. Hidrojel gömme (5. Gün)

1. Kollajen I karışımını Tablo 6'da anlatıldığı gibi hazırlayın. Buzun üzerine 50 mL'lik bir tüp yerleştirin ve ardından kollajen I solüsyonu, H₂O, 10× DMEM / F12 ortamı, sodyum bikarbonat ve HEPES ekleyin. Tüpü hafifçe sallayarak iyice karıştırın. pH değerini 7.3'e ayarlamak için karıştırılan çözeltiyi çalkalarken damla damla 1 M NaOH çözeltisi ekleyin ve karışımın pH değerini bir pH metre ile kontrol edin.
   NOT: Tüm çözeltiler kullanılmadan önce buz üzerinde önceden soğutulmalıdır. Prosedürü her zaman biyogüvenlik kabinindeki buz üzerinde gerçekleştirin. NaOH çözeltisinin eklenmesi kritiktir ve kollajen I'in lokal kürlenmesini önlemek için homojen bir çözelti elde etmek için hızlı dispersiyon gereklidir. NaOH hacmi, kullanılan kollajen I çözeltisinin lot sayısına bağlı olarak değişebilir. Karıştırma için kuvvetlice pipetlemeyin, çünkü kesme gerilimi istenmeyen ön kürlemeye neden olabilir.
2. Kollajen I-bazal membran matris karışımını Tablo 7'de tarif edildiği gibi hazırlayın. Adım 4.1'den hazırlanan 5 mL kollajen I karışımına 1.25 mL bazal membran matrisi ekleyin. Tüpü sallayarak çözeltiyi hafifçe karıştırın.
3. 12 oyuklu bir plakayı 2 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
4. Geniş delikli uçları kullanarak kollajen I-bazal membran matris karışımını 12 oyuklu plakaya (1,5 mL/kuyu) yavaşça ekleyin. Karışımın eşit şekilde dağıldığından emin olun.
5. İlk hidrojel katmanını katılaştırmak için plakayı 37 ° C'lik inkübatöre 2 saat koyun.
6. Kalan kollajen I-bazal membran matris karışımını daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutun.
7. ~ 60 hücre agregasını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 5 dakika buz üzerinde soğutun. Ortamı bir P200 pipet ucuyla dikkatlice çıkarın.
   NOT: Bu adımı, Adım 4.5'ten 1.5 saat sonra başlatın.
8. Damla damla, agregalara 1,5 mL kollajen I-bazal membran karışımı ekleyin ve bunları geniş delikli P200 pipet uçları kullanarak nazikçe karıştırın.
9. İlk hidrojel tabakasının bulunduğu plakayı inkübatörden (adım 4.5) biyogüvenlik kabinine aktarın.
10. Kürlenmiş tabaka üzerine 1.5 mL agrega süspansiyonu ekleyin. Agregaları eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın. Herhangi bir baloncuk oluşturmaktan kaçının.
11. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 2 saat daha inkübe edin.
12. Vasküler farklılaşma ortamını 2 (VDM2; Tablo 8) ve kullanmadan önce ortamı 37 °C'lik bir su banyosunda 20 dakika önceden ısıtın.
13. Her oyuğa 2 mL VDM2 ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile kültürleyin.
14. Ortamı önceden ısıtılmış, taze yapılmış VDM2 ile her 3 günde bir değiştirin.
    NOT: (İsteğe bağlı) Vasküler organoidler, jelin bir şırınga iğnesi ile çıkarılmasıyla jel karışımından salınabilir. Jeden alınan vasküler organoidler, VDM2 (200 μL / oyuk) ile 96 oyuklu bir plakada ayrı ayrı muhafaza edilebilir. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.

5. 3D İmmünofloresan testi

1. Vasküler organoidler kabaca 13. günde olgunlaşmalıdır. Hidrojel içine gömülü organoidler için, ortamı dikkatlice aspire edin ve üç kez (her seferinde 10 dakika) 2 mL PBS ile yıkayın. Jelden alınan organoidler için (Adım 4.14'ten sonra), 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 6-10 organoid toplayın, ortamı aspire edin ve 2 mL PBS ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkayın.
2. Numuneye 2 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve parafin film sızdırmazlığı ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
3. PFA solüsyonunu çıkarın ve numuneyi 2 mL PBS ile dört kez (her seferinde 15 dakika) yıkayın.
4. 2 mL bloke edici tampon ekleyin (Tablo 9) ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
5. Bloke edici tamponu çıkarın ve 1.5 mL primer antikor ekleyin (antikor bilgisi için Malzeme Tablosuna bakınız; antikorlar bloke edici tamponda seyreltilmelidir). Numuneyi birincil antikorlarla 4 ° C'de 2 gün boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
   NOT: Birincil antikorun (CD31, PDGFRβ ve ERG1) bloke edici tamponda 1:400 oranında seyreltilmesi önerilir (daha fazla bilgi için Malzeme Tablosuna bakınız).
6. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve 2 mL PBST ile 1 saat altı kez yıkayın.
7. Numuneye 2 mL ikincil antikor ekleyin (antikor bilgisi için Malzeme Tablosuna bakınız; antikorlar PBST'de seyreltilmelidir). Plakayı alüminyum folyo ile sarın ve hafifçe çalkalayarak 2 gün boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   NOT: İkincil antikorun PBST'de 1:1000 oranında seyreltilmesi önerilir (daha fazla bilgi için Malzeme Tablosuna bakınız). İnkübasyon sırasında plakayı ışıktan uzak tutun ve daha sonra bu adımdan itibaren yıkayın.
8. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve altı kez (her seferinde 1 saat) 2 mL TBST ile yıkayın. Çekirdek boyama gerekiyorsa, son yıkama adımı için kullanılan yıkama tamponuna DAPI (1 μg/mL) ekleyin.
9. Bu jel gömülü organoidler için jeli 4 parçaya bölün ve bir spatula ile dikkatlice 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Alınan organoidler için yıkama tamponunu çıkarın.
10. Jele veya organoidlere dokunmadan kalan çözeltiyi emmek için mendil kullanın.
11. Her tüpe 2 mL suda çözünür doku temizleme reaktifi (Kırılma İndeksi = 1.49) ekleyin. Numuneleri, organoidler berraklaşana kadar (genellikle gece boyunca) karanlıkta oda sıcaklığında temizleme reaktifi ile inkübe edin. Numuneleri sallamayın.
12. Organoidleri temizleme reaktifi ile bir spatula kullanarak dikkatlice cam tabanlı tabağın ortasına aktarın.
13. Organoidleri veya jel parçasını 24 mm × 24 mm lamel ile örtün.
14. Lameli düz bir şekilde uzanana kadar yavaşça aşağı doğru itin ve numuneleri cam tabanla sandviçleyin.
15. Tabaktaki gereksiz temizleme reaktifini çıkarın ve lameli oje ile kapatın.
16. 3D görüntüleme için 10 × objektifli konfokal bir mikroskop kullanın. Organoidlerin tam montajlı görüntülerini elde etmek için döşeme taraması ve Z-yığını taraması kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1A, her aşamada kullanılan temel bileşenler de dahil olmak üzere bu protokolün şemasını sunar. Farklılaşma EB oluşumu ile başladı, ardından mezoderm indüksiyonu ve vasküler soy spesifikasyonu izledi (Şekil 1B-D). Agregalar zamanla büyüdü ve daha az küresel hale geldi. Organoidler 5. günde pürüzlü kenarlar göstermeye başladı. Kollajen I-bazal membran matris kar?...

Tartışmalar

Açıklanan protokol, yüksek kaliteli vasküler organoidlerin homojen ve tekrarlanabilir üretimi için iki temel modifikasyon içerir. İlk modifikasyon, EB homojenliğinin daha iyi kontrol edilmesini sağlamak için bir mikro kuyu plakasının kullanılmasıdır. Vasküler farklılaşmanın başlangıç noktası olarak, EB'lerin boyutu, kök hücre kaderini ve farklı soylara doğru farklılaşma etkinliğini düzenlediği için kritik öneme sahiptir. EB boyutundaki değişiklikler g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C