Génération d’organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Résumé

Ce protocole présente une méthode de génération d’organoïdes vasculaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines.

Résumé

Les organoïdes vasculaires dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent la diversité des types cellulaires et l’architecture complexe des réseaux vasculaires humains. Ce modèle tridimensionnel (3D) présente un potentiel substantiel pour la modélisation de pathologies vasculaires et le criblage de médicaments in vitro . Malgré les progrès récents, un défi technique majeur reste à relever pour générer des organoïdes de manière reproductible avec une qualité constante, ce qui est crucial pour les tests et les applications en aval. Ici, un protocole modifié est présenté qui améliore à la fois l’homogénéité et la reproductibilité de la génération d’organoïdes vasculaires. Le protocole modifié intègre l’utilisation de micropuits et du cocktail CEPT (chromane 1, emricasan, polyamines et l’inhibiteur intégré de la réponse au stress, trans-ISRIB) pour améliorer la formation du corps embryoïde et la survie cellulaire. Les organoïdes vasculaires différenciés et matures générés à l’aide de ce protocole sont caractérisés par une microscopie d’immunofluorescence 3D à montage entier pour analyser leur morphologie et leur système vasculaire complexe. Ce protocole permet la production d’organoïdes vasculaires de haute qualité de manière évolutive, ce qui facilite potentiellement leur utilisation dans les applications de modélisation de maladies et de criblage de médicaments.

Introduction

Des modèles microphysiologiques in vitro, y compris des systèmes d’organoïdes et de tissus sur puce, ont émergé au cours de la dernière décennie ^1,2,3. Ces systèmes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules humaines répondent aux limites de la culture cellulaire bidimensionnelle conventionnelle (2D) et des modèles animaux, telles que l’absence de nombreux composants dans le microenvironnement physiologique et les différences génétiques entre les espèces, respectivement. Ils fournissent plus d’informations physiologiques et sont plus adaptés à la modélisation des maladies et au criblage de médicaments que les modèles conventionnels. Parmi les modèles microphysiologiques, il a été prouvé que les organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent efficacement les caractéristiques architecturales des tissus humains natifs et ont été développés pour imiter différents organes humains, notamment le cerveau ^4,5, les reins⁶, le foie ^7,8 et la rétine⁹. Ici, nous nous concentrons particulièrement sur la génération d’organoïdes vasculaires à partir d’hiPSC et décrivons un protocole rationalisé qui vise à minimiser les variations entre différents échantillons et lots d’organoïdes, améliorant ainsi la reproductibilité globale.

La vascularisation joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie physiologique dans tous les organes humains. La formation de la vascularisation implique les processus de vasculogenèse et d’angiogenèse, orchestrés par les interactions entre les cellules endothéliales et murales (par exemple, les péricytes et les cellules musculaires lisses vasculaires) et influencés par divers stimuli¹⁰. Penninger, Wimmer et leurs collègues ont mis au point la première méthode de génération d’organoïdes vasculaires^11,12 qui imite ces deux processus. Avec les organoïdes générés par cette méthode, leur groupe¹² et nous^13,14 avons démontré le potentiel des organoïdes vasculaires pour modéliser les dysfonctionnements vasculaires dans les maladies. Par exemple, dans nos travaux récents ^13,14, des phénotypes distincts ont été observés, tels que la germination des vaisseaux et les variations de la composition cellulaire murale, entre les organoïdes vasculaires imitant la maladie et leurs homologues de type sauvage. Ces exemples mettent en évidence que le modèle d’organoïde vasculaire pourrait servir de plate-forme pour le criblage de médicaments en imitant les dysfonctionnements vasculaires liés à la maladie.

S’appuyant sur les travaux initiaux de génération d’organoïdes vasculaires^11,12, un protocole révisé est présenté qui comprend l’utilisation de micropuits pour faciliter la formation homogène de corps embryoïdes (EB), un facteur critique pour minimiser les variations souvent observées au sein d’un même lot de génération d’organoïdes. De plus, le cocktail CEPT, une combinaison de chromane 1, d’emricasan, de polyamines et de l’inhibiteur intégré de la réponse au stress (trans-ISRIB)¹⁵, est utilisé pour améliorer la viabilité des hiPSC et des cellules différenciées au cours du processus de formation de l’EB. Cette modification vise principalement à réduire les variations entre les différents échantillons et lots d’organoïdes. Des organoïdes vasculaires uniformes peuvent être produits avec ce protocole d’environ deux semaines, où la vasculogenèse est induite pour aider l’endothélium à s’organiser en réseaux tubulaires primitifs le jour 1, suivie de l’induction de l’angiogenèse le jour 5 pour développer des réseaux vasculaires complexes dans les organoïdes. Du 12e au 15e jour, les organoïdes générés devraient montrer des réseaux vasculaires matures composés à la fois de cellules endothéliales et murales.

Protocole

La figure 1 présente un aperçu des étapes de ce protocole. Des informations détaillées concernant les réactifs et les matériaux utilisés dans ce protocole sont fournies dans la table des matériaux. Il est recommandé de préchauffer tous les fluides à 37 °C avant utilisation, sauf indication contraire. Tout le matériel et les fournitures de culture cellulaire doivent être autoclavés ou stériles, et la manipulation des cellules doit être effectuée dans une enceinte de biosécurité. De plus, la valeur du pH du mélange de collagène I doit être soigneusement ajustée à pH 7,3 pour éviter d’éventuels problèmes de solidification.

1. Maintenance humaine des iPSC

1. Décongelez l’extrait de matrice de la membrane basale sur de la glace, secouez doucement le flacon pour mélanger la solution et faites des aliquotes de 0,5 mL dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une pipette P1000 et d’embouts pré-réfrigérés. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à 1 an.
2. Décongeler une aliquote d’extrait matriciel (0,5 mL) sur de la glace. Mélanger avec 49,5 ml de milieu DMEM/F12 pré-refroidi dans un tube de 50 ml. Répartissez le mélange dans chaque puits (1,5 ml/puits) dans des plaques à 6 puits, puis secouez doucement la plaque pour vous assurer que la solution liquide recouvre tout le puits. Scellez les plaques avec un film de paraffine et conservez-les à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
3. Préparez le milieu d’expansion hiPSC comme décrit dans le Tableau 1. Faites des aliquotes du milieu complet (40 mL/tube) et conservez-le à -20 °C jusqu’à 1 an.
4. Placez une plaque pré-enduite dans l’incubateur à 37 °C pendant 1 h avant la culture hiPSC.
5. Préchauffer le milieu d’expansion hiPSC (40 mL) à 37 °C et préparer le milieu d’ensemencement hiPSC comme décrit dans le tableau 2.
6. Transférez la plaque revêtue de l’incubateur à 37 °C dans l’enceinte de biosécurité. Remplacer le milieu de la plaque revêtue par un milieu de semis hiPSC (1 mL/puits).
7. Décongeler un flacon cryoconservé de cellules hiPSC du réservoir cryogénique dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 min.
8. Transférez les cellules dans un tube de 15 ml, puis ajoutez 5 ml de milieu DMEM/F12, suivi d’une centrifugation à 100 x g pendant 3 minutes à température ambiante pour recueillir les cellules.
9. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 1,5 mL de milieu d’ensemencement hiPSC. Remettez doucement les cellules en suspension dans le tube de 15 ml.
10. Aliquote 10 μL de la suspension cellulaire et mélanger avec 10 μL de solution de bleu de trypan. Transvasez 10 μL de mélange sur la lame de l’hémacytomètre et couvrez-la d’une lamelle.
11. Montez la glissière sur le support et insérez-la dans le compteur de cellules automatisé. Attendez que l’instrument trouve la mise au point ou ajustez manuellement la mise au point en appuyant sur le bouton de mise au point +/- à l’écran. Ensuite, utilisez le paramètre par défaut et appuyez sur le bouton Capturer . Utilisez la lecture de la densité cellulaire LIVE comme concentration de la suspension hiPSC préparée à partir de l’étape 1.9.
12. Ensemencez 2 × 10⁵ cellules dans chaque puits et assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties dans le puits.
13. Cultivez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et remplacez le milieu par un milieu d’expansion hiPSC (1,5 mL/puits) après 24 h.
14. Changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 80%. Vérifiez régulièrement la morphologie cellulaire et la taille de la colonie pour vous assurer qu’il n’y a pas de différenciation spontanée. Jeter la culture et redémarrer avec un nouveau lot de hiPSC si une différenciation spontanée étendue (>5%) est observée.

2. Formation de l’EB (Jour 0)

1. Le jour 0, préparer et préchauffer le milieu DMEM/F12, le milieu d’ensemencement hiPSC et la solution de détachement cellulaire à 37 °C pendant 20 à 30 min.
2. Retirer le milieu de culture de la plaque à 6 puits et ajouter la solution de détachement cellulaire préchauffée (1,5 ml/puits). Incuber la plaque à 37 °C pendant 5 à 7 min.
3. Transférez la plaque dans l’enceinte de biosécurité, tapotez la plaque pour détacher les colonies de hiPSC et brisez les agrégats.
4. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml. Ajouter 4,5 ml de DMEM/F12 de milieu. Pipeter doucement le mélange de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL cinq fois pour dissocier les cellules en une suspension unicellulaire. Évitez de générer des bulles.
5. Centrifuger à 100 x g pendant 3 min à température ambiante pour recueillir les cellules.
6. Aspirer le surnageant et remettre doucement les cellules en suspension avec 1 mL de milieu d’ensemencement hiPSC à l’aide d’une pipette P1000.
7. Mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de solution de bleu de trypan pour le comptage cellulaire. Transférez 10 μL du mélange sur la lame de l’hémacytomètre et couvrez-la d’une lamelle. Montez la glissière sur le support et insérez-la dans le compteur de cellules automatisé. Une fois que l’instrument a trouvé la mise au point, appuyez sur le bouton Capture et utilisez la lecture de la densité cellulaire LIVE pour déterminer la concentration de la suspension hiPSC.
8. Ensemencez les cellules dans la plaque de micropuits à fond rond à très faible fixation d’une densité de 2,7 × 10⁵ cellules/puits pour obtenir un rendement de 500 à 1 000 cellules par EB.
9. Ajouter 2 mL de milieu d’ensemencement hiPSC dans chaque puits et mélanger doucement la solution pour répartir uniformément les cellules.
10. Cultivez les cellules à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 24 h.

3. Différenciation vasculaire (jours 1 à 5)

1. Le jour 1, préparer le milieu d’induction du mésoderme (MIM) comme décrit dans le tableau 3 et le tableau 4 et le préchauffer à 37 °C pendant 20 min. Le support MIM doit être fabriqué récemment.
2. À l’aide d’une pipette P200, aspirez soigneusement le fluide de la plaque de micropuits sans perturber les EB au fond.
3. Ajouter lentement 2,5 mL de MIM à l’aide d’une pipette P200. Cultiver les EB dans MIM à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 2 jours.
4. Le jour 3, remplacer délicatement le milieu par 2,5 mL du milieu de différenciation vasculaire 1 (VDM1, tableau 5) préchauffé et fraîchement préparé, sans perturber les EB au fond du micropuits. Cultivez les cellules à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant encore 2 jours.

4. Enrobage d’hydrogel (Jour 5)

1. Préparez le mélange de collagène I comme décrit dans le tableau 6. Placez un tube de 50 ml sur de la glace et ajoutez ensuite la solution de collagène I, le H₂O, le milieu 10× DMEM/F12, le bicarbonate de sodium et HEPES. Bien mélanger en secouant doucement le tube. Ajoutez 1 M de solution de NaOH goutte à goutte tout en secouant la solution mélangée pour ajuster la valeur du pH à 7,3 et vérifiez la valeur du pH du mélange avec un pH-mètre.
   REMARQUE : Toutes les solutions doivent être pré-refroidies sur de la glace avant utilisation. Effectuez la procédure sur de la glace dans l’enceinte de biosécurité en tout temps. L’ajout de la solution de NaOH est essentiel, et une dispersion rapide pour obtenir une solution homogène est nécessaire pour éviter le durcissement local du collagène I. Le volume de NaOH peut varier en fonction du numéro de lot de la solution de collagène I utilisée. Ne pipetez pas vigoureusement pour le mélange, car la contrainte de cisaillement pourrait provoquer un pré-durcissement indésirable.
2. Préparez le mélange de matrice de collagène I-membrane basale comme décrit dans le tableau 7. Ajouter 1,25 ml de matrice de membrane basale au mélange de collagène I de 5 ml préparé à partir de l’étape 4.1. Mélangez doucement la solution en secouant le tube.
3. Placer une assiette à 12 puits sur de la glace pendant 2 min.
4. Ajouter lentement le mélange de matrice de collagène I-membrane basale dans la plaque à 12 puits (1,5 ml/puits) à l’aide des pointes à large diamètre. Assurez-vous que le mélange est réparti uniformément.
5. Mettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 2 h pour solidifier la première couche d’hydrogel.
6. Conservez le reste du mélange de matrice de collagène I-membrane basale sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
7. Transférez ~60 agrégats de cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et refroidissez le tube sur de la glace pendant 5 min. Retirez délicatement le fluide à l’aide d’une pointe de pipette P200.
   REMARQUE : Commencez cette étape 1.5h après l’étape 4.5.
8. Dans le sens des gouttes, ajoutez 1,5 ml de mélange de membrane basale de collagène I aux agrégats et mélangez-les doucement à l’aide d’embouts de pipette P200 à large calibre.
9. Transférez la plaque avec la première couche d’hydrogel de l’incubateur (étape 4.5) dans l’enceinte de biosécurité.
10. Ajouter 1,5 mL de la suspension d’agrégats sur la couche durcie. Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les agrégats. Évitez de générer des bulles.
11. Incuber la plaque à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant encore 2 h.
12. Préparer le milieu de différenciation vasculaire 2 (VDM2 ; Tableau 8) et préchauffez le milieu dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 minutes avant de l’utiliser.
13. Ajouter 2 mL de VDM2 dans chaque puits et cultiver les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂.
14. Changez le milieu tous les 3 jours avec du VDM2 préchauffé et fraîchement préparé.
    REMARQUE : (Facultatif) Les organoïdes vasculaires peuvent être libérés du mélange de gel en retirant le gel avec une aiguille de seringue. Les organoïdes vasculaires extraits du gel peuvent être maintenus individuellement dans une plaque de 96 puits avec VDM2 (200 μL/puits). Changez de milieu tous les 2-3 jours.

5. 3D Dosage immunofluorescent

1. Les organoïdes vasculaires devraient devenir matures vers le 13e jour. Pour les organoïdes noyés dans l’hydrogel, aspirez soigneusement le milieu et lavez-le avec 2 mL de PBS trois fois (10 min à chaque fois). Pour les organoïdes prélevés du gel (après l’étape 4.14), prélever 6 à 10 organoïdes dans un tube de microcentrifugation de 2 ml, aspirer le milieu et laver avec 2 mL de PBS trois fois (10 min chacune).
2. Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à l’échantillon et incuber à 4 °C pendant la nuit avec une pellicule de paraffine.
3. Retirer la solution de PFA et laver l’échantillon avec 2 mL de PBS quatre fois (15 min à chaque fois).
4. Ajouter 2 mL de tampon de blocage (tableau 9) et incuber à température ambiante pendant 2 h.
5. Retirer le tampon bloquant et ajouter 1,5 mL d’anticorps primaires (voir la Table des matériaux pour plus d’informations sur les anticorps ; les anticorps doivent être dilués dans le tampon bloquant). Incuber l’échantillon avec des anticorps primaires à 4 °C pendant 2 jours en agitant doucement.
   REMARQUE : Il est recommandé de diluer l’anticorps primaire (CD31, PDGFRβ et ERG1) dans le tampon de blocage dans un rapport de 1:400 (voir le tableau des matériaux pour plus d’informations).
6. Retirer la solution d’anticorps primaires et laver avec 2 mL de PBST pendant 1 h six fois.
7. Ajouter 2 mL d’anticorps secondaires (voir la Table des matériaux pour l’information sur les anticorps ; les anticorps doivent être dilués dans du PBST) à l’échantillon. Enveloppez la plaque de papier d’aluminium et incubez à 4 °C pendant 2 jours en secouant doucement.
   REMARQUE : Il est recommandé de diluer l’anticorps secondaire dans du PBST dans un rapport de 1:1000 (voir le tableau des matériaux pour plus d’informations). Gardez l’assiette à l’abri de la lumière pendant l’incubation et lavez-la à partir de cette étape par la suite.
8. Retirer la solution d’anticorps secondaire et laver avec 2 mL de TBST six fois (1 h à chaque fois). Ajouter du DAPI (1 μg/mL) dans le tampon de lavage utilisé pour la dernière étape de lavage si une coloration des noyaux est nécessaire.
9. Pour ces organoïdes enrobés de gel, coupez le gel en 4 morceaux et transférez-les soigneusement dans des tubes de microcentrifugation de 2 ml à l’aide d’une spatule. Pour les organoïdes récupérés, retirez le tampon de lavage.
10. Utilisez des lingettes pour absorber la solution restante sans toucher le gel ou les organoïdes.
11. Ajouter 2 mL de réactif soluble dans l’eau (indice de réfraction = 1,49) dans chaque tube. Incuber les échantillons avec un réactif de clarification à température ambiante dans l’obscurité jusqu’à ce que les organoïdes deviennent clairs (généralement pendant la nuit). Ne secouez pas les échantillons.
12. Transférez soigneusement les organoïdes avec le réactif de clarification au centre du plat à fond de verre à l’aide d’une spatule.
13. Couvrez les organoïdes ou le morceau de gel avec une lamelle de 24 mm × 24 mm.
14. Poussez doucement la lamelle vers le bas jusqu’à ce qu’elle repose à plat, et prenez les échantillons en sandwich avec le fond en verre.
15. Retirez le réactif de clarification redondant dans le plat et scellez la lamelle avec du vernis à ongles.
16. Pour l’imagerie 3D, utilisez un microscope confocal avec un objectif de 10×. Utilisez le balayage de tuiles et le balayage Z-stack pour obtenir des images montées entières d’organoïdes.

Résultats

La figure 1A présente le schéma de ce protocole, y compris les composants clés utilisés dans chaque étape. La différenciation a commencé avec la formation de l’EB, suivie de l’induction du mésoderme et de la spécification de la lignée vasculaire (Figure 1B-D). Les agrégats sont devenus plus grands et moins sphériques au fil du temps. Les organoïdes ont commencé à montrer des b...

Discussion

Le protocole décrit comprend deux modifications clés pour la génération homogène et reproductible d’organoïdes vasculaires de haute qualité. La première modification est l’utilisation d’une plaque à micropuits pour permettre un meilleur contrôle de l’uniformité de l’EB. En tant que point de départ de la différenciation vasculaire, la taille des EB est essentielle car elle régule le destin des cellules souches et l’efficacité de la différenciation envers diffé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C