Génération d’organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Résumé

Ce protocole présente une méthode de génération d’organoïdes vasculaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines.

Résumé

Les organoïdes vasculaires dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) récapitulent la diversité des types cellulaires et l’architecture complexe des réseaux vasculaires humains. Ce modèle tridimensionnel (3D) présente un potentiel substantiel pour la modélisation de pathologies vasculaires et le criblage de médicaments in vitro . Malgré les progrès récents, un défi technique majeur reste à relever pour générer des organoïdes de manière reproductible avec une qualité constante, ce qui est crucial pour les tests et les applications en aval. Ici, un protocole modifié est présenté qui améliore à la fois l’homogénéité et la reproductibilité de la génération d’organoïdes vasculaires. Le protocole modifié intègre l’utilisation de micropuits et du cocktail CEPT (chromane 1, emricasan, polyamines et l’inhibiteur intégré de la réponse au stress, trans-ISRIB) pour améliorer la formation du corps embryoïde et la survie cellulaire. Les organoïdes vasculaires différenciés et matures générés à l’aide de ce protocole sont caractérisés par une microscopie d’immunofluorescence 3D à montage entier pour analyser leur morphologie et leur système vasculaire complexe. Ce protocole permet la production d’organoïdes vasculaires de haute qualité de manière évolutive, ce qui facilite potentiellement leur utilisation dans les applications de modélisation de maladies et de criblage de médicaments.

Introduction

Des modèles microphysiologiques in vitro, y compris des systèmes d’organoïdes et de tissus sur puce, ont émergé au cours de la dernière décennie ^1,2,3. Ces systèmes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules humaines répondent aux limites de la culture cellulaire bidimensionnelle conventionnelle (2D) et des modèles animaux, telles que l’absence de nombreux composants dans le microenvironnement physiologique et les différences génétiques entre les espèces, respectivement. Ils fournissent plus d’informations physiologiques et sont plus ....

Protocole

La figure 1 présente un aperçu des étapes de ce protocole. Des informations détaillées concernant les réactifs et les matériaux utilisés dans ce protocole sont fournies dans la table des matériaux. Il est recommandé de préchauffer tous les fluides à 37 °C avant utilisation, sauf indication contraire. Tout le matériel et les fournitures de culture cellulaire doivent être autoclavés ou stériles, et la manipulation des cellules doit être effectuée dans une enceinte de biosécurité. De plus, la valeur du pH du mélange de collagène I doit être soigneusement ajustée à pH 7,3 pour éviter d’éventu....

Discussion

Le protocole décrit comprend deux modifications clés pour la génération homogène et reproductible d’organoïdes vasculaires de haute qualité. La première modification est l’utilisation d’une plaque à micropuits pour permettre un meilleur contrôle de l’uniformité de l’EB. En tant que point de départ de la différenciation vasculaire, la taille des EB est essentielle car elle régule le destin des cellules souches et l’efficacité de la différenciation envers diffé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	711-546-152	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Labs	705-606-147	reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)	Gibco	12587010	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4	ProSpec	CYT-081	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody	abcam	ab28364	dilution ratio: 1:400
Centrifuge	Eppendorf	022626001
CHIR99021	Tocris Bioscience	4423/10	make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1	Tocris	7163/10	make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I	Corning	40236
Confocal Microscope	Nikon	AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates	Corning	4441
Countess II FL automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565018
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062	make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A	Cedars Sinai
Emricasan	Medchemexpress LLC	HY1039610MG	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody	Cell Singali Technology	97249	dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2	ProSpec	CYT557	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Forskolin	Tocris Bioscience	1099	reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15710064
GlutaMAX supplement (100x)	Gibco	35050061
Heparin, 100 kU	MilliporeSigma	375095100KU	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Incubator	Thermo Scientific	13998123
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828028	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix	Corning	356230	thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)	Gibco	11140050
Molecular Biology Grade Water	Corning	46000CV
mTeSR plus kit	STEMCELL Technologies	1001130	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x)	Gibco	17502048	thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M)	Cytiva HyClone	SH31088.01
NeuroBasal medium	Gibco	21103049
NIS-Elements, ver 5.42	Nikon
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research Labs	17000121	reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20%	Electron Microscopy Sciences	15713S	dilute with PBS
PBST, 20x	Thermofisher	28352
PDGFRβ antibody	R&D	AF385	dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x)	Sigma-Aldrich	P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49	SUNJIN LAB	RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%)	Gibco	25080094
Sodium deoxycholate monohydrate	Thermofisher	J6228822	dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x	Thermofisher	28360
trans-ISRIB	Tocris Bioscience	5284/10	make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
VEGF-A	ProSpec	CYT-116	reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C