JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تطبيق مجال التبديل الخيفي المنشط بالضوء الأزرق (LightR) هندسيا للتحكم الزماني المكاني القابل للانعكاس في نشاط البروتين. باستخدام Src التيروزين كيناز كنموذج ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتطوير وتوصيف Src المنظم بالضوء (LightR-Src). إنه يوضح تعدد استخدامات هذا النهج عبر فئات الإنزيمات.

Abstract

يوفر علم الوراثة البصرية إمكانية محاكاة التحكم الزماني المكاني المعقد لنشاط الإنزيم وصولا إلى دقة تحت الخلوية. ومع ذلك ، غالبا ما تواجه معظم الأساليب البصرية الوراثية تحديات كبيرة في دمج قدرات متعددة في أداة واحدة قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من البروتينات المستهدفة. يعد تحقيق التحكم الدقيق في حركية التشغيل / الإيقاف ، وضمان الحد الأدنى من التسرب في الظلام ، وإظهار الأداء الفعال في خلايا الثدييات بدقة تحت الخلايا من أكثر التحديات شيوعا التي تواجهها في هذا المجال. يكمن الحل الواعد في تطبيق المجالات الحساسة للضوء المصممة بشكل عقلاني للتحكم في نشاط البروتين بشكل خيفي. باستخدام هذه الإستراتيجية ، أنشأنا طريقة بصرية وراثية تجمع بين جميع الميزات المطلوبة. يتضمن النهج دمج وحدة التبديل الخيفي المنظمة بالضوء (LightR) في البروتين المستهدف لتنظيم نشاط الإنزيم باستخدام الضوء الأزرق (465 نانومتر). يتم إنشاء مجال LightR عن طريق ربط مجالين مستقبلين للضوء Vivid (VVD) ، مما يؤدي إلى إنشاء مشبك حساس للضوء يمكن دمجه في حلقة مرنة صغيرة داخل المجال التحفيزي للإنزيم. في حالته المظلمة ، يكون مشبك LightR مفتوحا ، وبالتالي يشوه المجال التحفيزي للإنزيم ويعطله. عند التعرض للضوء الأزرق ، يغلق مجال LightR ويستعيد بنية المجال التحفيزي ونشاط الإنزيم. في هذه المخطوطة ، نناقش استراتيجيات التصميم لتوليد بروتين كيناز منظم للضوء وإثبات سيطرته عن طريق الضوء الأزرق ، والانعكاس ، والحركية ، والتنظيم الدقيق على المستوى تحت الخلوي ، مما يتيح دقة زمانية مكانية محكمة. باستخدام Src tyrosine kinase كنموذج ، نعرض بروتوكولا لتنظيم نشاط كيناز LightR-Src بشكل فعال. نظهر أيضا قابلية تطبيق LightR عبر فئات الإنزيم المختلفة ، مما يوسع فائدة نظام الأداة في معالجة الأسئلة الميكانيكية لمسارات الإشارات في الأمراض المختلفة.

Introduction

يتم توجيه قدرة الخلية على تفسير الإشارات الخارجية وتحويلها إلى استجابات محددة في السياقات الفسيولوجية أو المرضية من قبل مجموعات مخصصة من البروتينات. غالبا ما يتم تحديد مساهمة أي بروتين في مثل هذه الاستجابات المعقدة من خلال موقعه تحت الخلوي ومستوى التعبير وتوقيت التنشيط العابر أو المستمر أو المتذبذب. يتطلب تشريح دور هذه المعلمات الفردية في تنظيم الإشارات طرقا قادرة على تكرار التحكم الزماني المكاني المعقد لنشاط البروتين على المستوى تحت الخلوي. التقنيات التقليدية مثل التلاعب الجيني ومثبطات الجزيئات الصغيرة تقصر في هذا الصدد. في المقابل ، تعد تقنيات البصريات الوراثية بإمكانية تشريح العمليات البيولوجية من خلال التلاعب أو محاكاة العمليات الفسيولوجية والمرضية. ومع ذلك ، غالبا ما تفتقر الأدوات الحالية إلى قابلية التطبيق الواسعة أو التحكم تحت الخلوي. تحقق العديد من الاستراتيجيات الحالية تنظيما صارما لتوطين البروتين والتفاعلات. لكنها تفتقر إلى السيطرة المباشرة على النشاط الأنزيمي1،2،3،4. يتيح البعض الآخر تنظيم النشاط الأنزيمي ولكنه قد يفتقر إلى التحكم تحت الخلوي أو يكون قابليته للتطبيق محدودا عبر فئات الإنزيمات المختلفة5،6،7،8،9. في ورقة البروتوكول هذه ، نصف طريقة جديدة لهندسة البروتين تجمع بين مزايا علم البصريات الوراثي في أداة واحدة: التنظيم الزمني الصارم ، والحركية القابلة للضبط ، والتحكم في الخلايا الفرعية ، وقابلية تطبيق الإنزيمالواسعة 10. لقد صممنا مجالا منظما بالضوء (LightR) يعمل كمفتاح خيفي عند إدخاله في البروتين المستهدف محل الاهتمام. تتيح هذه الإستراتيجية تحكما مكانيا زمانيا محكما لتنشيط وتعطيل البروتين ذي الأهمية في الخلايا الحية.

هنا ، تتم مناقشة استراتيجية التصميم والتطبيق لأداة الوراثة البصرية LightR عبر العديد من فئات الإنزيمات. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا خطوة بخطوة لتطوير وتوصيف وتطبيق التيروزين كيناز المنظم للضوء (LightR-Src). توضح الدراسة أيضا قابلية ضبط حركية تعطيل مفتاح LightR. يمكن لمفتاح LightR البطيء أن يحافظ على نشاط الإنزيم مع انخفاض تردد الإضاءة ، في حين أن إصدار الدوران السريع ، FastLightR ، يتطلب إضاءة أكثر تواترا للتنشيط ولكنه يظهر تعطيلا سريعا عند إيقاف تشغيل الإضاءة. يؤدي تنشيط / تعطيل FastLightR-Src في الخلايا الحية إلى تحفيز دورات انتشار الخلايا وانكشافها. يتفق انتشار الخلايا الناجم عن FastLightR-SRC مع الدور الفسيولوجي ل Src kinase11،12. نظرا لحركية التعطيل السريع ، يمكن أيضا تنظيم FastLightR-Src على المستوى الخلوي ، مما يؤدي إلى تحفيز النتوءات المحلية واستقطاب الخلايا. لإثبات قابلية تطبيق أداة LightR على أنواع أخرى من الإنزيمات ، نسير القراء بإيجاز من خلال نجاح مماثل مع كيناز bRaf المنظم للضوء (LightR-bRaf ، FastLightR-bRaf) وإعادة تركيب الحمض النووي الخاص بالموقع Cre (LightR-Cre). بشكل عام ، يتمتع هذا النهج بالقدرة على تعزيز فهمنا لمسارات الإشارات المعقدة التي تشكل الفيزيولوجيا المرضية للأمراض المتنوعة.

Protocol

1. تصميم وتطوير LightR (الشكل 1)

  1. التخطيط الاستراتيجي
    ملاحظة: يتكون مجال LightR من مجالين مستقبلات ضوئية متصلين جنبا إلى جنب (VVD) من Neurospora crassa13,14,15,16. تتجانس VVDs في وجود الضوء ، ويتضمن هذا التعتيم تغييرا توافقيا يجلب الطرف N لمونومر VVD بجوار الطرف C لمونومر VVD آخر (الشكل 1 أ). يؤدي توصيل مجالي VVD برابط مرن إلى إنشاء مجال يشبه المشبك سيكون مفتوحا في الظلام ويغلق عند الإضاءة بالضوء الأزرق. يتيح دمج هذا المشبك في المجال التحفيزي للإنزيم تنظيم النشاط بوساطة الضوء. في الظلام ، يشوه المشبك المفتوح المجال ، مما يؤدي إلى تعطيل الإنزيم. تؤدي الإضاءة بالضوء الأزرق إلى إغلاق المشبك ، واستعادة نشاط الإنزيم (الشكل 1 ب). يمكن تطبيق هذا المفهوم على الإنزيمات من عائلات مختلفة ، بما في ذلك كينازات البروتين وإعادة تركيب الحمض النووي10 (الشكل 1 ج).
    1. تصميم LightR
      1. لتوصيل جزيئين من VVD ، استخدم رابطا مرنا من الأحماض الأمينية 22 (GGS) 4G (GGS) 3 بين كل مونومر.
        ملاحظة: يوفر الرابط مرونة وطولا كافيين لاستيعاب اقتران وتفكك مونومرات VVD.
      2. أضف روابط GPGGSGG و GSGGPG إلى الطرفين N و C لمجال LightR ، على التوالي.
        ملاحظة: قد يلزم تعديل طول وتكوين الروابط لبروتين معين. يتم استخدام روابط GSG الأقصر و Gly المفردة بشكل روتيني عند الحاجة إلى تنظيم أكثر صرامة. سيؤثر حجم حلقة الإدخال وقربها من المخلفات الحفازة أيضا على النطاق الديناميكي للتنظيم. من المرجح أن توفر الحلقات الأقصر تنظيما أكثر إحكاما للنشاط التحفيزي ولكنها قد تؤدي إلى نشاط أقل بعد الإضاءة. يتم توفير تسلسل مجال LightR في الجدول التكميلي 1.
    2. إدخال LightR
      ملاحظة: سيمكن موقع إدخال LightR المناسب من التنظيم الصارم لوظيفة المجال المستهدف دون منع تفاعلاتها بشكل جسمي أو التسبب في تغييرات هيكلية لا رجعة فيها ستؤثر على دورها البيولوجي. يعد التركيب البلوري للبروتين المستهدف دليلا مثاليا في تحديد مناطق الحلقة المرنة لإدخال LightR. إذا لزم الأمر ، يمكن أن يكون التركيب البلوري للمتماثل القريب كافيا. وترد أدناه بعض المعايير العامة التي يجب مراعاتها.
      1. تأكد من أن حلقة الإدخال مقترنة هيكليا بالعناصر التحفيزية الحرجة للإنزيم. تأكد من أن حلقة الإدراج المحددة ليست موقع ربط موجود للبروتين وأن إدخال LightR لا يعطل أي تفاعلات وظيفية بسبب التأثيرات الفراغية.
      2. كاستراتيجية أولية ، استبدل حمض أميني واحد في حلقة الإدراج عند إدخال LightR. استهدف منتصف حلقة الإدراج التي تحتوي على حمض أميني قطبي أو صغير (على سبيل المثال ، Glu ، Arg ، Lys ، Gly) المعرضة للمذيب ولا يشارك في التفاعلات داخل الجزيئات.
        ملاحظة: عندما لا ينتج عن استبدال واحد للأحماض الأمينية بروتين وظيفي ، فإن تحسين بنية LightR سيتطلب استبدال أحماض أمينية متعددة أو حلقة الإدراج بأكملها. قم بتقييم وظائف مواقع الإدراج المتعددة ل LightR داخل الحلقة المحددة.
      3. تأكد من أن الإنزيم المستهدف يعمل بشكل مستقل عن التنظيم الداخلي. حقق ذلك باستخدام نسخة متحولة نشطة بشكل أساسي من الإنزيم لقالب الإدراج.
        ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الإنزيمات من النوع البري لتوليد تركيبات LightR ، ولكن هذا قد يؤدي إلى نظام AND مسور سيتم تنظيمه بواسطة آليات داخلية وضوء.
      4. تعتبر الضوابط الإيجابية والسلبية أمرا حيويا لتحليل نشاط إنزيم LightR. استخدم الطفرات النشطة بشكل أساسي للبروتينات الداخلية كعناصر تحكم إيجابية وإصدارات متحولة غير نشطة تحفيزيا من إنزيم LightR المستهدف كعناصر تحكم سلبية.
        ملاحظة: عند اختيار الطفرات المعطلة ، من الأهمية بمكان التأكد من أن الطفرة متباعدة بدرجة كافية عن موقع إدخال LightR لتجنب تعطيل عدم الرجوع عن طي إنزيم LightR. بناء على المعايير المذكورة أعلاه ، يتم تحديد موقع إدخال LightR في Src kinase في منطقة حلقة مرنة مقترنة هيكليا بعزر GXGXXG المحفوظ للغاية في منطقة الحلقة G / الغنية بالجليسين المرتبطة ب ATP عبر حبلا بيتا. الأهم من ذلك ، أنه يتم وضعه بعيدا عن جيب ربط ATP ومنطقة ربط الركيزة10،17 (الشكل 1C (i)).
        ملاحظة: نظرا للتماثل الهيكلي بين الكينازات ، يتم تحديد موقع إدخال LightR في bRaf في نفس الحلقة الهيكلية مثل موقع الإدراج في Src (الشكل 1C (ii)).
        ملاحظة: بناء على المبادئ المنصوص عليها في القسم 1.1.2 ، يتم اختيار موقع إدخال LightR في Cre recombinase ، وهو غير كيناز ، في إحدى الحلقات المرنة البعيدة عن النواة التحفيزية ، أي موقع ربط الحمض النووي. ومع ذلك ، لا تزال حلقة الإدراج مقترنة هيكليا بالمخلفات التحفيزية الحرجة داخل مجال ربط الحمض النووي من خلال حلزون α لضمان نجاح وظيفة LightR-Cre (الشكل 1 ج (ثالثا)). تم تفصيل جميع مواقع الإدراج ذات الضوابط الإيجابية والسلبية للإنزيمات المختلفة الموضحة في البروتوكول الحالي في الجدول التكميلي 2.
    3. تطوير FastLightR.
      ملاحظة: يتيح إدخال طفرة I85V لكل من VVDs في LightR ديناميكية تنشيط وتعطيل أسرع ، تعزى إلى التحويل السريع للمتحور إلى الحالة المظلمة18،19. يتيح جيل FastLightR-Src و FastLightR-bRaf مع حركية التعطيل السريع تحكما زمنيا صارما في التنشيط وتعطيل. يسمح بتحقيق التنظيم الخلوي ل LightR-Src في الخلايا الحية.
      ملاحظة: ينتج عن نشاط إعادة تركيب Cre إعادة تركيب الحمض النووي التي لا رجعة فيها. وبالتالي ، فإن خصائص الانعكاس ل LightR غير قابلة للتطبيق.
      ملاحظة: لتبسيط اكتشاف بنية LightR ، يمكن إرفاق بروتين فلوري أو أي علامة أخرى مناسبة بالطرف N أو C للبروتين المستهدف. استخدمت هذه الدراسة mCherry-myc ل LightR-SRC ، و Venus ل LightR-bRaf ، و miRFP670 ل LightR-Cre recombinase.
  2. استراتيجية الاستنساخ
    ملاحظة: يعتمد نهج الاستنساخ، على عكس الأساليب التقليدية، على الطفرات الموجهة نحو الموقع والتي لا تعتمد على مواقع تقييد محددة10,20.
    1. جيل "Megaprimer"
      1. تحسين جينات LightR لضمان التعبير المستقر عن تسلسلي الحمض النووي الترادفي VVD من أصل فطري في خلايا الثدييات ولجعل التسلسلات مختلفة قدر الإمكان للاستنساخ الخالي من الأخطاء باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لإجراء تحسين الكودون، اتبع الخطوات 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. قم بمحاذاة تسلسل الأحماض الأمينية ل VVDs والروابط المحددة جنبا إلى جنب لإنشاء خريطة التسلسل النظرية ل LightR.
      3. الصق التسلسل في أي نظام أساسي لتحسين الكودون عبر الإنترنت يستخدم خوارزمية متقدمة لتحسين الكودون لتحديد أفضل خيار تسلسل بأقل قدر من التعقيد. تأكد من تحديد الكائن الحي المستهدف ، والحفاظ على إطار القراءة ، وتحديد تسلسلات VVD للتحسين.
      4. احصل على LightR DNA كجزء مركب مخصص (انظر الجدول التكميلي 1) أو من بنية LightR10 المنشورة مسبقا.
      5. تضخيم الجين LightR لتوليد "Megaprimer" باستخدام استراتيجية20 الموضحة سابقا الموضحة في الشكل 1D. قم بتصنيع LightR "Megaprimer" عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل باتباع توصيات الشركة المصنعة لبوليميراز الحمض النووي المحدد واستخدام خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل التالي:
        5x مخزن مؤقت متوافق مع بوليميراز الحمض النووي: 10 ميكرولتر
        100 ميكرومتر ميجا برايمر أمامي: 0.5 ميكرولتر
        100 ميكرومتر ميجا برايمر عكسي: 0.5 ميكرولتر
        10 نانومتر dNTP خلط: 2 ميكرولتر
        بوليميراز الحمض النووي (2000 وحدة / مل): 1 ميكرولتر (0.02 وحدة / ميكرولتر)
        50 نانوغرام قالب الحمض النووي: 1 ميكرولتر
        ماء من الدرجة PCR: 35 ميكرولتر
        ملاحظة: هنا ، يتم استخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة والبدء الساخن مع درجات حرارة تلدين أولية عالمية.
      6. افصل الميجابرايمر الناتج عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. سيكون طول المنتج حوالي 1000 نيوكليوتيد. استئصال الميغبرايمر من هلام الاغاروز ونقاهة باستخدام مجموعة استخراج الجل ، باتباع توصيات الشركة المصنعة أو باستخدام تقنية مماثلة.
    2. إدخال جين LightR باستخدام الطفرات الموجهة للموقع: أدخل LightR ، ليحل محل الحمض الأميني المطلوب أو طول الأحماض الأمينية. سيكون البلازميد القالب هو الذي يتم فيه إدراج مجال LightR. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح سابقا20 باستخدام الخليط التالي.
      5x مخزن مؤقت متوافق مع بوليميراز الحمض النووي: 5 ميكرولتر
      10 نانومتر dNTP خلط: 1 ميكرولتر
      بوليميراز الحمض النووي (2000 وحدة / مل): 1 ميكرولتر (0.02 وحدة / ميكرولتر)
      50 نانوغرام الحمض النووي للقالب المستهدف: 1 ميكرولتر
      Megaprimer المستخرج (الكتلة المحسوبة): 10 ميكرولتر
      DMSO: 2.5 ميكرولتر
      ماء من الدرجة PCR: 2.5 ميكرولتر
      ملاحظة: كتلة Megaprimer (ng) = نسبة الإدخال / المتجه المطلوبة × كتلة المتجه × نسبة الإدخال إلى أطوال المتجه. نسبة المولار المطلوبة للإدخال / المتجه المستخدمة هي 3/1.
    3. بعد الانتهاء من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف 1 ميكرولتر من إنزيم DpnI (2000 وحدة / مل) لهضم الحمض النووي الزائد والميثيلي بشكل انتقائي فقط واحتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1-1.5 ساعة. سيؤدي ذلك إلى زيادة كبيرة في عائد البناء المعدل.
    4. قم بتحويل 1-2 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى خلايا مختصة DH5α باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة.
    5. صفيحة البكتيريا المحولة على لوريا مرق (LB)-لوحة أجار مع المضاد الحيوي المناسب للاختيار. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ 25-30 درجة مئوية) لمدة 72 ساعة.
      ملاحظة: يمكن تخزين ألواح LB ذات المستعمرات المزروعة عليها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد ، ويمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا.
    6. مستعمرة الشاشة PCR
      1. لفحص المستعمرة المستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل ، صمم بادئات تلدين في إدراج LightR وتستهدف الحمض النووي لتوليد ما يقرب من 400-700 نقطة أساس.
      2. أضف كمية صغيرة من مستعمرة من لوحة LB إلى مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضح أدناه وانتقل إلى التدوير الحراري باتباع توصيات الشركة المصنعة لبوليميراز الحمض النووي المحدد.
        2x Taq RED Master Mix: 5 ميكرولتر
        ماء من الدرجة PCR: 5 ميكرولتر
        100 ميكرومتر برايمر أمامي: 0.5 ميكرولتر
        100 ميكرومتر برايمر عكسي: 0.5 ميكرولتر
      3. تحقق من وجود مستعمرات إيجابية عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
      4. اختر المستعمرات التي ولدت حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوب وقم بتلقيحها بشكل فردي في 3 مل من مرق LB بالمضاد الحيوي ، بما يتوافق مع مقاومة المضادات الحيوية في العمود الفقري للبلازميد. ثم احتضنها ورجيها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      5. استخراج الحمض النووي البلازميد من المزرعة السائلة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة تنقية البلازميد لاستخراج الحمض النووي البلازميد والتحقق من وجود الإدخال عن طريق التسلسل.
        ملاحظة: يتم تلخيص بادئات الاستنساخ في الجدول التكميلي 3.

2. طلاء الخلية والتحليل الكيميائي الحيوي لنشاط إنزيم LightR (الشكل 2 أ)

  1. للتحليل الكيميائي الحيوي ل LightR-kinases (LightR Src ، FastLightR Src ، LightR bRaf) ، لوحة 1 × 106 خلايا LinXE لكل طبق ثقافة خلية 3.5 سم لكل مجموعة تجريبية. انظر الجدول التكميلي 4.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 16-18 ساعة.
  3. في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا ببنية الحمض النووي المحددة ، باستخدام كاشف تعداء مناسب باتباع توصيات الشركة المصنعة (الجدول التكميلي 4).
    ملاحظة: يعتمد كاشف التعداء الأمثل على بنية الخلايا المستخدمة ومتجه ونوعها. استخدمت هذه الدراسة 2 ميكروغرام من الحمض النووي في طبق 3.5 سم باستخدام كاشف التعداد. يجب إجراء الاختبارات التجريبية لتحديد كاشف التعداء الأمثل. نظرا لأن التركيبات المنقولة ستعبر عن البروتينات التي ينظمها الضوء الأزرق ، يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة التي تتعامل مع الخلايا المنقولة تحت الضوء الأحمر. لف الألواح بخلايا منقولة بورق الألمنيوم قبل وضعها في الحاضنة لمنع الإضاءة العرضية.
  4. بعد 16-18 ساعة من التعدي ، تعرض الخلايا للضوء الأزرق10. للقيام بذلك ، ضع نظام مصباح لوحة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) 465 نانومتر في حاضنة زراعة الأنسجة. ضع لوحا زجاجيا شبكيا مثقوبا على ارتفاع 10 سم فوق المصباح للحصول على الإضاءة المطلوبة البالغة 3 ميجاوات / سم2 (الملف التكميلي 1). هناك حاجة إلى لوحة مثقبة للحفاظ على دوران الهواء دون انقطاع في الحاضنة. تضيء الخلايا للفترة المطلوبة.
  5. لتنشيط LightR-Src و LightR-bRaf ، استخدم الإضاءة المستمرة. للإضاءة المستمرة، قم بتشغيل لوحة LED وإيقاف تشغيلها يدويا.
  6. للحفاظ على دورة التنشيط/إلغاء تنشيط FastLightR Src، استخدم دورات التشغيل/الإيقاف التي يتم التحكم فيها يدويا أو بواسطة متحكم دقيق.
    ملاحظة: يمكن استخدام العديد من مجموعات أدوات البرامج التي توفر بيئة تطوير متكاملة (IDE) لكتابة التعليمات البرمجية المطلوبة وتحميلها. تدعم مجموعات الأدوات هذه برمجة C / C ++ وتوفر وصولا للأغراض العامة للإدخال / الإخراج (GPIO) ، وهو أمر ضروري للتحكم في الإضاءة النبضية. وصف مفصل للبروتوكولات والتعليمات البرمجية المستخدمة لهذه الأغراض موصوف في الملف التكميلي 1.
  7. في نهاية النقاط الزمنية المعنية للتجربة (الجدول التكميلي 4) ، حصاد الخلايا تحت أضواء حمراء آمنة. استنشق الوسائط واغسل الخلايا باستخدام PBS البارد.
  8. لعزل البروتين ، خلايا التحلل التي تحتوي على 500 ميكرولتر من 2x Laemmli العينة المؤقتة مع 5٪ v / v 2-Mercaptoethanol. احتضان المحللة عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحليل تحلل الخلايا عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام البروتين والنشاف الغربي21.
    ملاحظة: تكوين 2x Laemmli المؤقت هو كما يلي: ل 500 مل: 5.18 جم من Tris-HCL ، 131.5 مل من الجلسرين ، 52.5 مل من 20٪ SDS ، 0.5 جم من البروموفينول الأزرق ، الرقم الهيدروجيني النهائي 6.8.
  9. قم بتقييم نشاط LightR-Src من خلال تقييم مستوى الفسفرة ل p130cas الداخلي على Tyr249 و paxillin على TyrY11822،23 (الشكل 2). قم بتقييم نشاط LightR-bRaf من خلال تقييم مستوى الفسفرة ل MEK1 على Ser217 / 221 و ERK1 / 2 على TyrY202 / 20424،25.

3. التحليل الوظيفي لنشاط LightR-Cre

  1. للتحليل الوظيفي لنشاط LightR-Cre ، لوحة 1 × 106 خلايا LinXE لكل طبق ثقافة خلية 3.5 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 16-18 ساعة.
  2. قم بنقل الخلايا باتباع البروتوكول الموضح في القسم 2 ، الشكل 2 أ ، والجدول التكميلي 5. شارك في نقل ما مجموعه 2 ميكروغرام من الحمض النووي ، بنسبة 1: 9 من LightR-Cre-iRFP670 وبلازميد مراسل Floxed-STOP-mCherry2.
  3. بعد 16-18 ساعة بعد التعدي ، قم بإضاءة الخلايا. يحتاج تنشيط LightR-Cre الفعال إلى إضاءة طويلة. لذلك ، لتجنب السمية الضوئية ، استخدم الإضاءة النبضية لمدة 8 ساعات مع دورتين 2 ثانية ON و 20 ثانية OFF باستخدام نظام مصباح لوحة LED 465 نانومتر يتم التحكم فيه بواسطة متحكم دقيق كما هو مفصل في القسم 2 والملف التكميلي 1.
  4. قم بإجراء التصوير باستخدام الفحص المجهري اللامع مع هدف هوائي 20x. لتصور LightR-Cre-iRFP670 ، استخدم مجموعة مرشحات Cy5 ، ولتصور mCherry من تعبير Floxed-mCherry ، استخدم مجموعة مرشح RFP.
    ملاحظة: للتصوير ، يتم استخدام مجهر epifluorescence المجهز بمكعبات ضوء Cy5 / RFP.

4. تحضير عينات لتصوير الخلايا الحية

  1. لوحة 2 × 105 خلايا هيلا لكل طبق زراعة أنسجة 35 مم في وسط زراعة الخلايا وتحتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. بمجرد أن تلتصق الخلايا ويكون التقاء حوالي 60٪ -70٪ ، قم بنقل خلايا HeLa بأحد الخلطات التالية: (أنا) 0.85 ميكروغرام من FastLightR-Src-mCherry-myc / 0.15 ميكروغرام من Stargazin-iRFP ، أو (ii) 0.75 ميكروغرام من FastLightR-bRaf-Venus / 0.25 ميكروغرام من mCherry-ERK2
    ملاحظة: في تجارب FastLightR-Src ، يتم استخدام Stargazin-iRFP لتسمية غشاء البلازما لتحليل انتشار الخلايا. إذا كان تعبير FastLightR-Src أعلى مطلوبا ، فيمكن حذف stargazin-iRFP ، ويمكن استخدام 1 ميكروغرام من FastLightR-Src بدلا من ذلك. في هذه الحالات ، يجب استخدام صبغة غشائية لتصور الخلايا. تستخدم بقع غشاء البلازما بشكل روتيني لوضع العلامات على أغشية الخلايا.
  3. قم بتغطية الطبق بورق الألمنيوم لتجنب الإضاءة العرضية للخلايا واحتضانه لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  4. أكمل جميع الخطوات التالية تحت إضاءة الضوء الأحمر لتجنب التنشيط غير المقصود للبنيات. سيؤدي التعرض للضوء الأبيض إلى تنشيط LightR-kinases ويمكن أن يؤثر على النتائج اللاحقة.
  5. في نفس اليوم ، قم بتغطية 3 أغطية زجاجية مستديرة (قطر 25 مم ، سمك 0.17 مم) طوال الليل مع 5 مجم / لتر من الفيبرونيكتين في PBS عند 37 درجة مئوية.
  6. اشطف الغطاء باستخدام PBS 16-18 ساعة بعد التعدي واللوحة ~ 1 × 105 خلايا HeLa المنقولة على كل غطاء. احتضان في وسط زراعة الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: كثافة البذر المنخفضة ضرورية لضمان عدم ملامسة الخلايا في مجال الرؤية لبعضها البعض.
  7. قم بإعداد وسائط التصوير عن طريق إضافة FBS إلى وسائط التصوير L-15 من Levobitz إلى تركيز نهائي قدره 5٪. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
  8. يسخن الزيت المعدني إلى 37 درجة مئوية.
  9. اغسل الغطاء الذي يحتوي على الخلايا باستخدام PBS مرتين. في حالة استخدام صبغة غشائية ، قم بتلطيخ الخلايا باتباع تعليمات الشركة المصنعة قبل غسل الغطاء.
  10. ضع الغطاء بعناية في غرفة تصوير الخلايا الحية. أضف 1 مل من وسائط التصوير L-15 إلى الغرفة.
  11. أضف 1 مل من الزيت المعدني فوق الوسائط لمنع التبخر أثناء عملية التصوير.
  12. حافظ على الغرفة محمية من الضوء عند 37 درجة مئوية حتى يتم إعدادها للتصوير.

5. التنشيط العالمي والتصوير ل FastLightR-Src (الشكل 3)

  1. قم بتوصيل مصباح حلقة مجهر LED أزرق بمكثف المجهر، ووضعه على ارتفاع 1.5 سم تقريبا فوق حامل العينة. قم بتوصيل مرحل التحكم في التيار المتردد / التيار المستمر للضوء الدائري بكمبيوتر المجهر.
    ملاحظة: بالنسبة للتجارب في هذه الدراسة ، تم التحكم في الإضاءة من خلال واجهة منطق الترانزستور والترانزستور (TTL) عبر برنامج التصوير. يمكن أيضا استخدام إضاءة Epifluorescent لتنشيط تركيبات LightR عالميا في حالة عدم توفر مصدر إضاءة خارجي. تعتبر الأطوال الموجية للإثارة GFP ، مثل مرشح الإثارة 490/20 نانومتر ، فعالة في تنشيط LightR.
  2. ضع الغرفة على مرحلة مجهرية مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية وحدد الخلايا التي تعبر عن FastLightR-Src-mCherry و Stargazin-iRFP (الشكل 3 ب) أو FastLightR-bRaf-Venus و mCherry ERK-2 (الشكل 5 ب).
  3. لدراسة تجارب الإضاءة والتصوير العالمية ، استخدم أهدافا عالية الأداء متوافقة مع المجهر (40x) مع تصحيح شبه لوني ، وتصحيح المجال المسطح ، وفتحة عددية عالية.
    1. بالنسبة للدراسات العالمية القائمة على الإضاءة ل Src kinase ، استخدم مرشحات الإثارة 561/10 نانومتر ومرشحات انبعاث 595/40 نانومتر لتصور FastLightR-Src-mCherry واستخدم الإثارة 640/20 نانومتر ومرشح انبعاث 655LP لتصور stargazin-iRFP.
    2. بالنسبة للدراسات العالمية القائمة على الإضاءة ل bRaf kinase ، استخدم مرشحات الإثارة 514/10 نانومتر و 540/21 نانومتر لتصور FastLightR-bRaf-Venus واستخدم مرشحات الإثارة 561/10 نانومتر و 595/40 نانومتر لتصور mCherry-ERK-2.
    3. استخدم مرآة متعددة النطاقات متعددة النطاقات في جميع قنوات التصوير الفلورية.
  4. اعتمادا على الظروف التجريبية ، ضع في اعتبارك التوصيات التالية.
    1. قم بتصوير الخلايا لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الإضاءة لإنشاء نشاط أساسي للخلايا.
      ملاحظة: هذا الخط الأساسي مطلوب لتحديد ما إذا كان تنشيط كيناز FastLightR عن طريق الإضاءة يؤدي إلى أي تغييرات في سلوك الخلية أو توطين البروتين. يمكن للمرء أيضا إجراء فترات أطول من التصوير القاعدي لتوفير أهمية إحصائية أكبر.
    2. نظرا لحركية التعطيل السريع ل FastLightRs ، فإن تضمين العديد من الخلايا للتصوير قد يتسبب في تعطيل Src / bRaf بين مواضع المرحلة ويمكن أن يخفف من استجابته. لتجنب مثل هذا الخطأ ، قم بتصوير 4 خلايا / دقيقة أثناء تحليل نشاط FastLightR-Kinase في البروتوكول الموصوف وقم بتصوير كل خلية محددة كل دقيقة لمدة 110 دقيقة (الملف التكميلي 2).
    3. استخدم الإضاءة النبضية على الإضاءة المستمرة لتقليل التأثيرات السامة الضوئية المحتملة للضوء الأزرق. الإضاءة لمدة 12 ثانية لكل من الخلايا الأربع / دقيقة فعالة (الملف التكميلي 2 ، الشكل 3 أ).
      ملاحظة: يجب تحديد دورات الإضاءة تجريبيا لأنواع مختلفة من التركيبات ومصادر الإضاءة.
    4. قم بإيقاف تشغيل الإضاءة أثناء تصوير الخلية لتجنب النزيف في قنوات الفلورسنت.
      ملاحظة: سيؤدي تصوير عدد كبير جدا من الخلايا في وقت واحد إلى تقليل إجمالي وقت الإضاءة المتاح للعينة، مما يؤدي إلى استجابة ضعيفة من التنشيط غير الكافي.
  5. بعد التصوير ، احفظ الأفلام كملف . تنسيق ملف مكدس TIF للتحليل.
    ملاحظة: نظرا للإضاءة الأقل اتساقا مع التألق الفائ-فلوري GFP مقارنة بالضوء الحلقي ، فإن التجارب التي تستخدم تألق GFP ستتطلب إضاءة أكثر تكرارا. ينتج عن هذا تصوير عدد أقل من الخلايا في كل تجربة.

6. التنشيط والتصوير تحت الخلوي ل FastLightR-Src (الشكل 4)

  1. ضع الغرفة على مرحلة مجهرية مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية وحدد خلية واحدة تعبر عن كل من FastLightR-Src-mCherry و Stargazin-iRFP.
  2. حدد المناطق المحددة (ROI) داخل الخلية المراد إضاءتها. تختار هذه الدراسة مساحة صغيرة على محيط الخلية المختارة.
    ملاحظة: بالنسبة للإضاءة المحلية ، يتم استخدام ليزر 445 نانومتر يتم تركيزه بواسطة وحدة TIRF في وضع FRAP أو جهاز مرآة دقيقة يتم التحكم فيه من خلال واجهة TTL عبر برنامج التصوير. سيعمل أي نظام إضاءة منقوش مع هذه التجارب. إذا تم استخدام نظام قائم على المسح ، فحدد شدة الليزر وتجانسه للتنشيط الكافي دون الإضرار بالخلية.
  3. قم بتصوير الخلية المحددة كل دقيقة لمدة 20 دقيقة في الحالة القاعدية قبل الإضاءة ، و 50 دقيقة أثناء الإضاءة محليا ، ثم 20 دقيقة بعد التنشيط لمدة 90 دقيقة (الملف التكميلي 2).
  4. للتنشيط والإلغاء ، وفر قدرا مناسبا من الوقت المناسب للبروتين المستهدف للسماح بالتعطيل الكامل لبروتين LightR. بالنسبة إلى FastLightR-Src ، اسمح بإلغاء التنشيط لمدة 10 دقائق على الأقل للنشاط المتبقي للاستئصال والسماح بإلغاء التنشيط لمدة 20 دقيقة في الإعداد التجريبي الواضح للإضاءة المحلية.
  5. بعد التصوير ، احفظ الأفلام ك . تنسيق ملف مكدس TIF للتحليل.

7. تحليل انتشار الخلايا

  1. إعداد الصور لمعالجة البيانات وتحليلها. تأكد من أن الصور في ملف . تنسيق مكدس TIF. احفظها مباشرة من برنامج التصوير أو قم بتحويلها باستخدام برنامج مفتوح المصدر.
  2. قم بتنزيل حزمة البرنامج النصي CellGeo من الملفات المضغوطة للبيانات التكميلية26.
    ملاحظة: تحتوي حزمة CellGeo على عدة برامج نصية مختلفة. اختر الحزمة المطلوبة من القائمة بناء على نوع التحليل كما هو مغطى في أقسام البروتوكول 7-9.
  3. افتح وقم بتشغيل البرنامج النصي بعنوان MovThresh لإنشاء قناع للخلية.
    1. حدد استيراد > الملف (.tif) وحدد صور Stargazin-iRFP للخلايا.
    2. امسح الإطارات ضوئيا باستخدام شريط التمرير في الزاوية اليسرى السفلية. إذا كان الحد المقترح مناسبا، فانتقل إلى الخطوة 7.4.
    3. إذا لم يتوافق الحد المقترح مع سلوك الخلية، فاختر منحنيات سلسة أو مخصصة أسفل تحديد المنحنى. قم بإنشاء المنحنى المخصص عن طريق التمرير عبر الإطارات ثم ضبط العتبة على الجانب الأيمن من النافذة.
    4. انقر فوق إعادة الحد.
    5. انقر فوق ملف > حفظ كأقنعة، وقم بتغيير اسم الملف، واحفظه باستخدام خيار حفظ باسم .
  4. افتح ملف المكدس الذي تم إنشاؤه حديثا في برنامج تحليل صور مفتوح المصدر.
  5. حدد الصورة > ضبط الحد > > تطبيق.
  6. حدد تحليل > تحليل الجسيمات > التحقق من نتائج العرض -> موافق.
  7. احسب التغير في مساحة كل خلية بقسمة المساحة في أي وقت على متوسط مساحة نفس الخلية قبل تشعيع الضوء الأزرق.
  8. ارسم تغيير المنطقة كرسم بياني خطي أو شريطي.
  9. احسب متوسط القيمة وفترات الثقة بنسبة 90٪ لكل نقطة زمنية لجميع الخلايا التي تمت معالجتها في نفس الظروف.

8. تحليل ديناميكيات حافة الخلية

  1. قم بإعداد ملفات المكدس باستخدام الخطوات الموضحة في قسم البروتوكول 7.
  2. افتح البرنامج النصي بعنوان ProActive وقم بتشغيله.
    1. حدد File > Import > Masks (.tif) وحدد القناع الذي تم إنشاؤه من خلال البرنامج النصي MovThresh .
    2. حدد النشاط الذي يثير اهتمامه في التحليل في الزاوية اليمنى السفلية (بارز أو انتزاع أو إجمالي).
    3. حدد نوع التطبيع. عادة ، يتم استخدام تطبيع المنطقة لهذه التحليلات.
    4. حدد الإطار المرجعي الأولي باستخدام شريط التمرير الموجود على اليسار. سيحدد شريط تمرير التأخر الموجود على اليمين الفاصل الزمني بين نقطتين تستخدمان لقياس المساحة المكتسبة والمفقودة من قبل الخلية.
    5. إذا كان الإطار المحدد ورقم التأخر أكبر بشكل إضافي من عدد الإطارات في الفيلم، فلن يتم عرض صورة المعاينة. أعد تعيين هذه القيم لتساوي أقل من إجمالي عدد الإطارات.
  3. قم بتعديل العتبة للنتوء أو التراجع عن طريق تحديد مربع المنحنى السلس ضمن قسم النتائج . يؤدي هذا إلى متوسط الحدود عبر نافذة معينة، والتي يمكن أن تحل المشكلات التي يتم فيها اكتشاف التقلبات الطفيفة كنشاط.
  4. حدد تشغيل النطاق لحساب النشاط خلال الوقت المحدد بواسطة منزلقات الإطار والتأخير.
  5. احفظ البيانات الرقمية عن طريق تحديد ملف > حفظ باسم نتائج > (.mat) واستخدمها لتحديد متوسط النشاط البارز أو التراجعي.
  6. حدد فواصل الثقة 90٪ لكل نقطة زمنية.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى حفظ مصفوفة من عدة قيم مختلفة. يوفر الملف النصي "كيفية استخدام ProActive" المضمن في البرنامج النصي وصفا تفصيليا لما تمثله كل قيمة وكيف تم تحديدها26.
  7. احفظ التمثيل المرئي للنشاط عن طريق تحديد ملف > حفظ > الصور (.tif).

9. تحليل التحول المركزي

  1. لتحليل التحول المركزي ، استخدم أي برنامج يمكنه تحديد إحداثيات النقطة الوسطى.
  2. في برنامج التحليل ، افتح مكدس الصور المقنع للخلية محل الاهتمام كما هو موضح في القسم 7 من البروتوكول.
  3. حدد قياس > تحليل قياس التباين المتكامل ثم انقر فوق تفضيلات > رسم علامة الوسط > التحقق ، ثم حدد قياس.
    1. سجل إحداثيات المركزي قبل الحركة (A).
    2. سجل إحداثيات النقطة الوسطى في نهاية التجربة (ب).
    3. سجل إحداثيات مركز نمط الإضاءة (C).
  4. الآن بعد أن تم جمع النقاط الثلاث ، حدد الزاوية figure-protocol-25916BAC8. θ1 يتوافق مع الزاوية figure-protocol-26075ABC و θ2 يتوافق مع الزاوية figure-protocol-26210CBA (الشكل 4Cii). افعل ذلك باستخدام المعادلة التالية:
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    ملاحظة: يمكن استخدام الآلة الحاسبة لتحديد الزوايا والمسافات مباشرة من الإحداثيات لسهولة الاستخدام.
  5. حدد إزاحة النقطة الوسطى بضرب المسافة التي قطعها النقطة الوسطى للخلية بالبكسل في عامل التحويل حيث 1 بكسل يساوي 0.4 ميكرومتر. سيعتمد التحويل المحدد لوحدات البكسل إلى المسافة على التكبير وإعداد الكاميرا على النظام.
  6. بمجرد تحديد زاوية التحول المركزي والمسافة ، افتح برنامجا بيانيا قادرا على إنتاج صور للإحداثيات القطبية.
  7. أدخل زاوية إزاحة النقطة الوسطى كقياس θ والمسافة المقطوعة كنصف قطر. استخدم ANOVA لاختبار فترات الثقة بنسبة 95٪.
  8. ارسم النتائج واحفظ الصورة.

النتائج

تم تصميم LightR-Src وإنشائه باتباع الإستراتيجية الموضحة في الشكل 1 أ ، ب. يصل التحليل الكيميائي الحيوي ل LightR-Src إلى فسفرة ركائز Src الداخلية المعروفة ، p130Cas (Y249) 22 و paxillin (Y118) 23 استجابة للضوء الأزرق عند 60 دقيقة من الإضاءة المستمرة...

Discussion

تقدم دراستنا نهجا بصريا وراثيا للتحقيق في مسارات الإشارات المتنوعة وتوضح قابليته للتطبيق الواسع في معالجة الأسئلة البيولوجية المختلفة. يوفر نظام أداة LightR العديد من المزايا الأساسية: (1) التنظيم الخيفي لنشاط البروتين ، (2) التحكم الزمني الصارم في النشاط الذي يمكن ضبطه لتح...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن تقديرهم للدكتور مارك شايع لمساهمته في تطوير إنزيمات LightR والبروتوكولات المرتبطة بها. كان pCAG-iCre هدية من ويلسون وونغ (Addgene plasmid # 89573) ، pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry كانت هدية من Mositoshi Sato (Addgene plasmid # 122963) ، كان بناء bRaf-Venus الذي يحمل طفرة V600E هدية من الدكتور جون أوبريان (MUSC) ؛ تم استنساخ جين ERK2 من pCEFL-ERK2 (هدية من مختبر الدكتور تشانينج دير ، UNC) في العمود الفقري mCherry-C1 للحصول على بلازميد mCherry-ERK2. و pmiRFP670-N1 كانت هدية من فلاديسلاف فيرخوشا (بلازميد Addgene # 79987). تم دعم العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R33CA258012 و R35GM145318 و P01HL151327 إلى AK. تم دعم هذا العمل أيضا من خلال زمالة التدريب T32 VBST T32HL144459 إلى NL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm RoundWarner Instruments 64-0715 
1.5 mL Tubes USA Scientific cc7682-3394
2x Laemmli BufferFor 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBiorad4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
60 LED Microscope Ring LightBoli OpticsML46241324Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose GoldBiotechA-201
Anti-Erk 1/2 AntibodyCell Signaling9102
Anti-GAPDH AntibodyinvitrogenAM4300
Anti-GFPClontech632380
Anti-mCherry AntibodyinvitrogenM11217
Anti-MEKCell Signaling9122
Anti-p130CasBD Biosciences610271
Anti-paxillinCell Signaling2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 AntibodyCell Signaling9101
Anti-phospho-pY249 p130CasCell Signaling4014
Anti-phospho-Y118 PaxillinCell Signaling2541
Anto-phospho-S217/221 MEKCell Signaling9121
Arduino Compatable Power SupplyCorporate ComputerLJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎A000066
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered 
bRaf-V600E-VenusGift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA GoldBiotechA-420 
Carbenicillin (Disodium)Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dyeinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMix Genesee42-138
DH5a competent cells NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEBN04475
Dpn1 Enzyme NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents 
EGTAAcros 409910250
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent PromegaE2692Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain GoldBioG-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x NEBB7024A
GeneJET Gel extraction Kit Thermo Scientific K0692Gel Extraction Kit 
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Scientific K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL 
HEK 293T Cells ATCC CRL-11268
HeLa Cells ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Iot RelayDigital LoggersDLI 705020645490AC/DC control relay for illumination
Kanamycin MonosulfateGold BiotechnologyK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1xCorning 10-045-CV 
LB Agar FisherBP1425-2
LED Grow Light SystemHQRP884667106091218LED panel lamp system 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024aSoftware for running CellGEO Scripts
MetamorphMolecular DevicesImaging Analysis Software
MgCl2 Fisher ChemicalM33-500
Mineral OilSigma M5310
MiniPrep Kit Gene Choice 96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 wellBio-Rad4561085
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CV 
Multiband Polychroic Mirror89903BSChroma
NaCl Fisher ChemicalS271-3 
PBS w/o Ca and Mg Corning 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ERK2Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes labForce1149Z650.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps 
Phusion Plus DNA PolymeraseThermo Scientific F630S
pmiRFP670-N1Addgene#79987
Polygon 400 Patterned IlluminatorMightexDSI-G-00C
Primers IDT
PVDF MembranesBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches 
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodiumCorning 25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Fischer BP1332-1 For electrophoresis 
UPlanSApo 40x Microscope ObjectiveOlympus1-U2B828
USB TTL BoxNational Instruments6501For TTL interface
β-MercaptoethanolFisher Chemical O3446I-100

References

  1. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
  2. Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat Chem Biol. 12 (12), 1059-1064 (2016).
  3. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  4. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  5. Diaz, J. E., et al. A split-Abl kinase for direct activation in cells. Cell Chem Biol. 24 (10), 1250-1258.e4 (2017).
  6. Hongdusit, A., Zwart, P. H., Sankaran, B., Fox, J. M. Minimally disruptive optical control of protein tyrosine phosphatase 1B. Nat Commun. 11 (1), 788 (2020).
  7. Wang, J., et al. Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature. 569 (7757), 509-513 (2019).
  8. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  9. Zhou, X. X., Fan, L. Z., Li, P., Shen, K., Lin, M. Z. Optical control of cell signaling by single-chain photoswitchable kinases. Science. 355 (6327), 836-842 (2017).
  10. Shaaya, M., et al. Light-regulated allosteric switch enables temporal and subcellular control of enzyme activity. Elife. 9, e60647 (2020).
  11. Chu, P. H., et al. Engineered kinase activation reveals unique morphodynamic phenotypes and associated trafficking for Src family isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12420-12425 (2014).
  12. Kaplan, K. B., Swedlow, J. R., Morgan, D. O., Varmus, H. E. c-Src enhances the spreading of src-/- fibroblasts on fibronectin by a kinase-independent mechanism. Genes Dev. 9 (12), 1505-1517 (1995).
  13. Nihongaki, Y., Suzuki, H., Kawano, F., Sato, M. Genetically engineered photoinducible homodimerization system with improved dimer-forming efficiency. ACS Chem Biol. 9 (3), 617-621 (2014).
  14. Vaidya, A. T., Chen, C. H., Dunlap, J. C., Loros, J. J., Crane, B. R. Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci Signal. 4 (184), ra50 (2011).
  15. Zoltowski, B. D., Crane, B. R. Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry. 47 (27), 7012-7019 (2008).
  16. Zoltowski, B. D., et al. Conformational switching in the fungal light sensor vivid. Science. 316 (5827), 1054-1057 (2007).
  17. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  18. Zoltowski, B. D., Vaccaro, B., Crane, B. R. Mechanism-based tuning of a LOV domain photoreceptor. Nat Chem Biol. 5 (11), 827-834 (2009).
  19. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: Design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. 53 (1), 14.13.1-14.13.16 (2011).
  20. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6 (1), 6256 (2015).
  21. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Cunningham-Edmondson, A. C., Hanks, S. K. p130Cas substrate domain signaling promotes migration, invasion, and survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 1, 39-52 (2009).
  23. Sachdev, S., Bu, Y., Gelman, I. H. Paxillin-Y118 phosphorylation contributes to the control of Src-induced anchorage-independent growth by FAK and adhesion. BMC Cancer. 9, 12 (2009).
  24. Cope, N., et al. Mechanism of BRAF activation through biochemical characterization of the recombinant full-length protein. ChemBioChem. 19 (18), 1988-1997 (2018).
  25. Singhal, A., Li, B. T., O'Reilly, E. M. Targeting KRAS in cancer. Nat Med. 30 (4), 969-983 (2024).
  26. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  27. Kaimachnikov, N. P., Kholodenko, B. N. Toggle switches, pulses and oscillations are intrinsic properties of the Src activation/deactivation cycle. FEBS J. 276 (15), 4102-4118 (2009).
  28. Burack, W. R., Shaw, A. S. Live cell imaging of ERK and MEK. J Biol Chem. 280 (5), 3832-3837 (2005).
  29. Baaske, J., et al. Dual-controlled optogenetic system for the rapid down-regulation of protein levels in mammalian cells. Sci Rep. 8 (1), 15024 (2018).
  30. Dagliyan, O., et al. Computational design of chemogenetic and optogenetic split proteins. Nat Commun. 9 (1), 4042 (2018).
  31. Harmer, Z. P., et al. Dynamic multiplexed control and modeling of optogenetic systems using the high-throughput optogenetic platform, Lustro. ACS Synth Biol. 13 (5), 1424-1433 (2024).
  32. Liu, Q., Tucker, C. L. Engineering genetically-encoded tools for optogenetic control of protein activity. Curr Opin Chem Biol. 40, 17-23 (2017).
  33. Morikawa, K., et al. Photoactivatable Cre recombinase 3.0 for in vivo mouse applications. Nat Commun. 11 (1), 2141 (2020).
  34. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr Opin Chem Biol. 15 (6), 789-797 (2011).
  35. Wu, J., et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 11 (1), 3708 (2020).
  36. Conlon, P., Gelin-Licht, R., Ganesan, A., Zhang, J., Levchenko, A. Single-cell dynamics and variability of MAPK activity in a yeast differentiation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), E5896-E5905 (2016).
  37. Jacquel, A., et al. Colony-stimulating factor-1-induced oscillations in phosphatidylinositol-3 kinase/AKT are required for caspase activation in monocytes undergoing differentiation into macrophages. Blood. 114 (17), 3633-3641 (2009).
  38. Kholodenko, B. N. Negative feedback and ultrasensitivity can bring about oscillations in the mitogen-activated protein kinase cascades. Eur J Biochem. 267 (6), 1583-1588 (2000).
  39. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 165-176 (2006).
  40. Li, Y., Roberts, J., Aghdam, Z. A., Hao, N. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) dynamics determine cell fate in the yeast mating response. J Biol Chem. 292 (50), 20354 (2017).
  41. Maeda, M., et al. Periodic signaling controlled by an oscillatory circuit that includes protein kinases ERK2 and PKA. Science. 304 (5672), 875-878 (2004).
  42. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  43. Roche, S., Fumagalli, S., Courtneidge, S. A. Requirement for Src family protein tyrosine kinases in G2 for fibroblast cell division. Science. 269 (5230), 1567-1569 (1995).
  44. Klomp, J. E., et al. Mimicking transient activation of protein kinases in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 14976-14981 (2016).
  45. Karginov, A. V., et al. Dissecting motility signaling through activation of specific Src-effector complexes. Nat Chem Biol. 10 (4), 286-290 (2014).
  46. Cary, L. A., Klinghoffer, R. A., Sachsenmaier, C., Cooper, J. A. Src catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol. 22 (8), 2427-2440 (2002).
  47. Fu, P., et al. Sphingolipids signaling in lamellipodia formation and enhancement of endothelial barrier function. Curr Top Membr. 82, 1-31 (2018).
  48. Tian, X., Zhou, B. Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. J Biol Chem. 296, 100509 (2021).
  49. Abremski, K., Hoess, R., Sternberg, N. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: Evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32 (4), 1301-1311 (1983).
  50. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259 (3), 1509-1514 (1984).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LightR SRC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved