Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'applicazione di un dominio di commutazione allosterica attivato dalla luce blu (LightR) ingegnerizzato per il controllo spaziotemporale reversibile dell'attività proteica. Utilizzando la tirosin-chinasi Src come modello, questo studio offre un protocollo elaborato per lo sviluppo e la caratterizzazione di Src regolata dalla luce (LightR-Src). Dimostra la versatilità di questo approccio in tutte le classi di enzimi.

Abstract

L'optogenetica offre il potenziale per imitare il complesso controllo spazio-temporale dell'attività enzimatica fino a una risoluzione subcellulare. Tuttavia, la maggior parte degli approcci optogenetici spesso affronta sfide significative nell'integrazione di più capacità in un unico strumento applicabile a un'ampia gamma di proteine bersaglio. Ottenere un controllo preciso sulla cinetica ON/OFF, garantire la minima perdita al buio e dimostrare prestazioni efficienti nelle cellule di mammifero con precisione subcellulare sono alcune delle sfide più comuni affrontate in questo campo. Una soluzione promettente risiede nell'applicazione di domini sensibili alla luce progettati razionalmente per controllare allostericamente l'attività proteica. Utilizzando questa strategia, abbiamo generato un metodo optogenetico che combina tutte le caratteristiche desiderate. L'approccio prevede l'incorporazione del modulo di commutazione allosterica regolato dalla luce (LightR) nella proteina bersaglio per regolare l'attività enzimatica utilizzando la luce blu (465 nm). Il dominio LightR viene generato collegando due domini fotorecettori Vivid (VVD), creando un morsetto sensibile alla luce che può essere incorporato in un piccolo anello flessibile all'interno del dominio catalitico di un enzima. Nel suo stato di oscurità, il morsetto LightR è aperto, distorcendo così il dominio catalitico dell'enzima e inattivandolo. Dopo l'esposizione alla luce blu, il dominio LightR si chiude e ripristina la struttura del dominio catalitico e l'attività enzimatica. In questo manoscritto, discutiamo le strategie di progettazione per generare una proteina chinasi regolata dalla luce e dimostriamo il suo controllo attraverso la luce blu, la reversibilità, la cinetica e la regolazione precisa a livello subcellulare, consentendo una stretta precisione spaziotemporale. Utilizzando la tirosina chinasi Src come modello, mostriamo un protocollo per regolare efficacemente l'attività chinasica LightR-Src. Dimostriamo anche l'applicabilità di LightR in diverse classi di enzimi, ampliando l'utilità del sistema di strumenti nell'affrontare questioni meccanicistiche delle vie di segnalazione in diverse malattie.

Introduzione

La capacità della cellula di interpretare i segnali esterni e convertirli in risposte specifiche in contesti fisiologici o patologici è diretta da gruppi dedicati di proteine. Il contributo di qualsiasi proteina a tali risposte complesse è spesso definito dalla sua posizione subcellulare, dal livello di espressione e dalla tempistica dell'attivazione transitoria, sostenuta o oscillatoria. L'analisi del ruolo di questi singoli parametri nella regolazione del segnale richiede metodi in grado di replicare l'intricato controllo spazio-temporale dell'attività proteica a livello subcellulare. Le tecniche tradizionali come la manipolazione g....

Protocollo

1. Progettazione e sviluppo di LightR ( Figura 1)

1. Pianificazione strategica
   NOTA: Il dominio LightR è composto da due domini fotorecettori Vivid (VVD) collegati in tandem da Neurospora crassa^13,14,15,16. I VVD omodimerizzano in presenza di luce, e tale dimerizzazione comporta un cambiamento conformazionale che porta l'N-terminale di un monomero VVD accanto al C-terminale di un altro monomero VVD (Figura 1A

Discussione

Il nostro studio presenta un approccio optogenetico per lo studio di diverse vie di segnalazione e dimostra la sua ampia applicabilità nell'affrontare diverse questioni biologiche. Il sistema di strumenti LightR offre diversi vantaggi essenziali: (1) Regolazione allosterica dell'attività proteica, (2) Stretto controllo temporale dell'attività che può essere regolato per ottenere diverse cinetiche di attivazione e inattivazione, (3) Risoluzione spaziale dell'attività a livello subcel.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100