Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

요약

이 프로토콜은 단백질 활성의 가역적 시공간 제어를 위해 엔지니어링된 청색광 활성화 알로스테릭 스위치(LightR) 도메인의 적용을 설명합니다. 이 연구는 Src 티로신 키나아제를 모델로 활용하여 광 조절 Src(LightR-Src)를 개발하고 특성화하기 위한 정교한 프로토콜을 제공합니다. 이는 효소 종류 전반에 걸쳐 이 접근법의 다양성을 보여줍니다.

초록

Optogenetics는 효소 활성의 복잡한 시공간 제어를 세포 내 해상도까지 모방할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 그러나 대부분의 광유전학 접근법은 광범위한 표적 단백질에 적용할 수 있는 단일 도구에 여러 기능을 통합하는 데 상당한 문제에 직면하는 경우가 많습니다. ON/OFF 동역학을 정밀하게 제어하고, 어둠 속에서 누출을 최소화하고, 세포 내 정밀도로 포유류 세포에서 효율적인 성능을 입증하는 것은 이 분야에서 직면한 가장 일반적인 과제 중 일부입니다. 유망한 해결책은 단백질 활성을 알로스테릭하게 제어하기 위해 합리적으로 설계된 빛에 민감한 도메인을 적용하는 데 있습니다. 이 전략을 사용하여 원하는 모든 기능을 결합한 광유전학적 방법을 생성했습니다. 이 접근법은 청색(465nm) 광을 사용하여 효소 활성을 조절하기 위해 표적 단백질에 Light-regulated allosteric switch module(LightR)을 통합하는 것을 포함합니다. LightR 도메인은 두 개의 Vivid(VVD) 광수용체 도메인을 연결하여 생성되며, 효소의 촉매 도메인 내에서 작고 유연한 루프에 통합할 수 있는 빛에 민감한 클램프를 생성합니다. 어두운 상태에서 LightR 클램프는 열려 있어 효소의 촉매 영역을 왜곡하고 비활성화합니다. 청색광에 노출되면 LightR 도메인이 닫히고 촉매 도메인의 구조와 효소 활성이 복원됩니다. 이 원고에서는 광 조절 단백질 키나아제를 생성하고 청색광, 가역성, 역학 및 세포 내 수준에서의 정밀한 조절에 의한 제어를 시연하여 엄격한 시공간 정밀도를 가능하게 하는 설계 전략에 대해 논의합니다. Src 티로신 키나아제를 모델로 활용하여 LightR-Src 키나아제 활성을 효과적으로 조절하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 또한 다양한 효소 종류에 걸쳐 LightR의 적용 가능성을 입증하여 다양한 질병에서 신호 전달 경로의 기계론적 문제를 해결하는 데 있어 도구 시스템의 유용성을 확장합니다.

서문

외부 신호를 해석하고 생리학적 또는 병리학적 맥락에서 특정 반응으로 변환하는 세포의 능력은 전용 단백질 그룹에 의해 지시됩니다. 이러한 복잡한 반응에 대한 단백질의 기여도는 종종 세포 내 위치, 발현 수준 및 일시적, 지속적 또는 진동 활성화 타이밍에 의해 정의됩니다. 신호 전달 조절에서 이러한 개별 매개변수의 역할을 해부하려면 세포 내 수준에서 단백질 활성의 복잡한 시공간 제어를 복제할 수 있는 방법이 필요합니다. 유전자 조작 및 저분자 억제제와 같은 전통적인 기술은 이와 관련하여 부족합니다. 대조적으로, 광유전학 기술은 생리학적 및 병리학적 과정을 조작하거나 모방함으로써 생물학적 과정을 해부할 수 있는 잠재력을 약속합니다. 그러나 현재의 도구는 광범위한 적용 가능성이나 세포 내 제어가 부족한 경우가 많습니다. 기존의 여러 전략은 단백질 국소화 및 상호 작용에 대한 엄격한 조절을 달성합니다. 그러나 효소 활성에 대한 직접적인 제어는 부족합니다 1,2,3,4. 다른 것들은 효소 활성의 조절을 가능하게 하지만 세포 내 제어가 부족하거나 다른 효소 클래스 ^5,6,7,8,9에 걸친 적용성이 제한적일 수 있습니다. 이 프로토콜 논문에서는 광유전학의 장점을 하나의 도구, 즉 엄격한 시간 조절, 조정 가능한 역학, 세포 내 제어 및 광범위한 효소 적용성¹⁰에 결합한 새로운 단백질 엔지니어링 방법에 대해 설명합니다. 우리는 관심 표적 단백질에 삽입될 때 알로스테릭 스위치로 기능하는 Light-regulated(LightR) 도메인을 엔지니어링했습니다. 이 전략은 살아있는 세포에서 관심 단백질의 활성화 및 비활성화에 대한 엄격한 시공간 제어를 가능하게 합니다.

여기에서는 여러 효소 클래스에 걸친 LightR 광유전학 도구의 설계 및 응용 전략에 대해 설명합니다. 이 연구는 광 조절 티로신 키나아제 Src(LightR-Src)의 개발, 특성화 및 적용을 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 연구는 LightR 스위치 비활성화 동역학의 조정 가능성을 추가로 보여줍니다. 천천히 비활성화되는 LightR 스위치는 조명 주파수를 줄이면서 효소 활성을 유지할 수 있는 반면, 고속 순환 버전인 FastLightR은 활성화를 위해 더 빈번한 조명이 필요하지만 조명이 꺼지면 빠른 비활성화를 보여줍니다. 살아있는 세포에서 FastLightR-Src의 활성화/불활성화는 세포 확산 및 수축 주기를 유도합니다. FastLightR-Src 유도 세포 확산은 Src 키나아제^11,12의 생리학적 역할과 일치합니다. 빠른 불활성화 역학으로 인해 FastLightR-Src는 세포 내 수준에서도 조절될 수 있으며, 그 결과 국소 돌출부 및 세포 분극을 자극할 수 있습니다. 다른 유형의 효소에 대한 LightR 도구의 적용 가능성을 입증하기 위해 엔지니어링된 광 조절 키나아제 bRaf(LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) 및 부위 특이적 DNA 재조합 효소 Cre(LightR-Cre)를 사용한 유사한 성공을 간략하게 안내합니다. 전반적으로 이 접근법은 다양한 질병의 병태생리학을 형성하는 복잡한 신호 전달 경로에 대한 이해를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

1. LightR의 설계 및 개발(그림 1)

1. 전략적 계획 수립
   참고: LightR 도메인은 Neurospora crassa의 두 개의 직렬로 연결된 Vivid(VVD) 광수용체 도메인으로 구성됩니다^13,14,15,16. VVD는 빛의 존재 하에서 균질화되며, 이러한 이합체화는 한 VVD 단량체의 N-말단을 다른 VVD 단량체의 C-말단 다음으로 가져오는 구조적 변화를 수반한다(그림 1A). 유연한 링커로 두 개의 VVD 도메인을 연결하면 어두운 곳에서는 열리고 청색광으로 조명되면 닫히는 클램프 모양의 도메인이 생성됩니다. 이 클램프를 효소의 촉매 영역에 통합하면 빛에 의해 매개된 활성 조절이 가능합니다. 어둠 속에서, 열린 클램프는 도메인을 왜곡하여 효소를 비활성화시킵니다. 청색광으로 조명하면 클램프가 닫히고 효소의 활성(그림 1B). 이 개념은 단백질 키나아제(protein kinase) 및 DNA 재조합 효소(DNA recombinase)를 포함한 다양한 계열의 효소에 적용될 수 있습니다¹⁰ (그림 1C).
   1. LightR의 디자인
      1. 두 개의 VVD 분자를 연결하려면 각 단량체 사이에 유연한 22-아미노산 링커(GGS)4G(GGS)3를 사용합니다.
         참고: 링커는 VVD 단량체의 결합 및 해리를 수용할 수 있는 충분한 유연성과 길이를 제공합니다.
      2. GPGGSGG 및 GSGGPG 링커를 LightR 도메인의 N-말단과 C-말단에 각각 추가합니다.
         참고: 링커의 길이와 조성은 특정 단백질에 맞게 조정해야 할 수 있습니다. 더 짧은 GSG 및 단일 Gly 링커는 더 엄격한 조절이 필요할 때 일상적으로 사용됩니다. 삽입 루프의 크기와 촉매 잔류물에 대한 근접성도 조절의 동적 범위에 영향을 미칩니다. 루프가 짧을수록 촉매 활성을 더 엄격하게 조절할 수 있지만 조명 후 활성이 낮아질 수 있습니다. LightR 도메인의 시퀀스는 보충 표 1에 나와 있습니다.
   2. LightR 삽입
      참고: 적절한 LightR 삽입 부위는 상호 작용을 입체적으로 차단하거나 생물학적 역할에 영향을 미치는 돌이킬 수 없는 구조적 변화를 일으키지 않고 표적 도메인 기능을 엄격하게 조절할 수 있습니다. 표적 단백질의 결정 구조는 LightR 삽입을 위한 이러한 유연한 루프 영역을 식별하는 데 이상적인 가이드입니다. 필요한 경우 close homolog의 결정 구조로 충분할 수 있습니다. 고려해야 할 몇 가지 일반적인 기준은 다음과 같습니다.
      1. 삽입 루프가 효소의 중요한 촉매 요소에 구조적으로 결합되어 있는지 확인하십시오. 선택한 삽입 루프가 단백질에 대한 기존 결합 부위가 아닌지, LightR의 삽입이 입체 효과로 인한 기능적 상호 작용을 잠재적으로 방해하지 않는지 확인하십시오.
      2. 초기 전략으로, LightR을 삽입할 때 삽입 루프에서 하나의 아미노산을 교체합니다. 용매에 노출되고 분자 내 상호 작용에 관여하지 않는 극성 또는 작은 아미노산(예: Glu, Arg, Lys, Gly)을 포함하는 삽입 루프의 중간을 표적으로 합니다.
         참고: 하나의 아미노산 치환으로 기능성 단백질이 생성되지 않는 경우, LightR 구조를 최적화하려면 여러 아미노산을 교체하거나 전체 삽입 루프를 수행해야 합니다. 정의된 루프 내에서 LightR에 대한 여러 삽입 부위의 기능을 평가합니다.
      3. 표적 효소가 내인성 조절과 독립적으로 작동하는지 확인합니다. 삽입 템플릿에 대한 효소의 구성적으로 활성화된 돌연변이 버전을 사용하여 이를 달성합니다.
         참고: 야생형 효소는 LightR 구조를 생성하는 데에도 사용할 수 있지만, 이로 인해 내인성 메커니즘과 빛에 의해 조절되는 AND 게이트 시스템이 생성될 수 있습니다.
      4. 양성 및 음성 대조군은 LightR 효소 활성 분석에 매우 중요합니다. 내인성 단백질의 구성적 활성 돌연변이를 양성 대조군으로 사용하고 표적 LightR 효소의 촉매 비활성 돌연변이 버전을 음성 대조군으로 사용합니다.
         참고: 불활성화 돌연변이를 선택할 때는 LightR 효소 접힘의 비가역성을 방해하지 않도록 돌연변이가 LightR 삽입 부위에서 충분히 떨어져 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 위의 기준에 따라 Src kinase의 LightR 삽입 부위는 베타 가닥을 통해 ATP 결합 G-루프/글리신이 풍부한 루프 영역에서 고도로 보존된 GXGXXG 모티프와 구조적으로 결합된 유연한 루프 영역에서 선택됩니다. 중요한 것은, ATP 결합 포켓 및 기판 결합 영역(^10,17)으로부터 멀리 위치한다는 점이다(도 1C(i)).
         참고: kinase 간의 구조적 상동성으로 인해 bRaf의 LightR 삽입 부위는 Src의 삽입 부위와 동일한 구조적 루프에서 선택됩니다(그림 1C (ii)).
         참고: 섹션 1.1.2.에 명시된 원칙에 따라 비키나아제인 Cre recombinase의 LightR 삽입 부위는 촉매 코어에서 멀리 떨어진 유연한 루프 중 하나, 즉 DNA 결합 부위에서 선택됩니다. 그러나 삽입 루프는 여전히 α-나선을 통해 DNA 결합 도메인 내의 중요한 촉매 잔기에 구조적으로 결합되어 LightR-Cre 기능의 성공을 보장합니다(그림 1C (iii)). 현재 프로토콜에 기술된 상이한 효소에 대한 positive 및 negative control이 있는 모든 삽입 부위는 보충 표 2에 상세히 설명되어 있습니다.
   3. FastLightR 개발.
      참고: LightR에서 두 VVD에 I85V 돌연변이를 도입하면 돌연변이가 어두운 상태(^18,19)로 빠르게 변환되기 때문에 더 빠른 활성화-불활성화 역학이 가능해집니다. 빠른 불활성화 역학을 가진 FastLightR-Src 및 FastLightR-bRaf의 생성은 활성화 및 불활성화의 시간적 제어를 엄격하게 가능하게 합니다. 이를 통해 살아있는 세포에서 LightR-Src의 세포 내 조절을 달성할 수 있습니다.
      참고: Cre 재조합효소 활성은 비가역적 DNA 재조합을 초래합니다. 따라서 LightR의 가역성 속성은 적용할 수 없습니다.
      참고: LightR 구조체의 검출을 단순화하기 위해, 형광 단백질 또는 기타 적절한 태그를 타겟 단백질의 N- 또는 C- 말단에 부착할 수 있습니다. 이 연구는 LightR-Src에 대해 mCherry-myc, LightR-bRaf에 대해 Venus, LightR-Cre 재조합효소에 대해 miRFP670을 사용했습니다.
2. 클로닝 전략
   참고: 클로닝 접근법은 기존 접근법과 달리 특정 제한 부위에 의존하지 않는 부위 지정 돌연변이 유발을 기반으로 합니다^10,20.
   1. "메가 프라이머"의 생성
      1. 포유류 세포에서 진균 기원의 두 tandem VVD DNA 염기서열의 안정적인 발현을 보장하고 PCR을 사용한 오류 없는 클로닝을 위해 염기서열을 가능한 한 다르게 만들기 위해 LightR 유전자를 Codon-optimize합니다. 코돈 최적화를 수행하려면 1.2.1.2-1.2.1.3단계를 수행합니다.
      2. VVD의 아미노산 서열과 선택된 링커를 나란히 정렬하여 LightR의 이론적 서열 맵을 생성합니다.
      3. 코돈 최적화를 위한 고급 알고리즘을 활용하는 온라인 코돈 최적화 플랫폼에 염기서열을 붙여넣어 복잡성을 최소화하면서 최상의 염기서열 옵션을 결정할 수 있습니다. 표적 유기체가 선택되고, 판독 프레임이 유지되고, 최적화를 위해 VVD 염기서열이 선택되었는지 확인합니다.
      4. 맞춤형 합성 단편( 보충 표 1 참조) 또는 이전에 발표된 LightR 구조체¹⁰에서 LightR DNA를 수득합니다.
      5. LightR 유전자를 증폭하여 그림 1D에 요약된 앞서 설명한²⁰가지 전략을 사용하여 "메가프라이머"를 생성합니다. 특정 DNA 중합효소에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 PCR을 통해 LightR "Megaprimer"를 합성하고 다음 PCR 반응 혼합물을 사용합니다.
         5x DNA 중합효소 호환 완충액: 10 μL
         100 μM 포워드 메가프라이머: 0.5 μL
         100 μM 리버스 메가프라이머: 0.5 μL
         10nM dNTP 혼합물: 2μL
         DNA 중합효소(2000 units/mL): 1 μl (0.02 U/μL)
         50 ng 템플릿 DNA: 1 μL
         PCR 등급 물: 35 μL
         참고: 여기에서는 범용 프라이머 어닐링 온도의 고충실도, 핫스타트 DNA 중합효소가 사용됩니다.
      6. 생성된 메가프라이머를 아가로스 겔 전기영동으로 분리합니다. 제품의 길이는 약 1000개의 뉴클레오티드입니다. 아가로스 겔에서 메가프라이머를 절제하고 겔 추출 키트를 사용하여 정제하거나 제조업체의 권장 사항을 따르거나 유사한 기술을 사용합니다.
   2. 부위 지정 돌연변이 유발을 이용한 LightR 유전자 삽입: LightR을 삽입하여 원하는 아미노산 또는 아미노산의 길이를 대체합니다. 템플릿 플라스미드는 LightR 도메인이 삽입되는 플라스미드입니다. 하기의 혼합물을 사용하여 앞서 설명한^{바와 같이 20} PCR 반응을 수행한다.
      5x DNA 중합효소 호환 완충액: 5 μL
      10nM dNTP 혼합물: 1μL
      DNA 중합효소 (2000 units/mL): 1 μL (0.02 U/μL)
      50 ng 타겟 템플릿 DNA: 1 μL
      추출된 메가프라이머(계산 질량): 10μL
      DMSO: 2.5 μL
      PCR 등급 물: 2.5 μL
      참고: 메가프라이머 질량(ng) = 원하는 인서트/벡터 몰비 x 벡터 질량 x 벡터 길이에 대한 인서트의 비율. 사용되는 원하는 인서트/벡터 몰비는 3/1입니다.
   3. PCR 반응 완료 후 1μL의 DpnI(2000 단위/mL) 효소를 첨가하여 과잉 및 메틸화된 DNA만 선택적으로 절단하고 혼합물을 37°C에서 1-1.5시간 동안 배양합니다. 이렇게 하면 수정된 구조체의 수율이 크게 증가합니다.
   4. 제조업체 프로토콜에 따라 PCR 반응의 1-2 μL를 DH5α 유능한 세포로 변환합니다.
   5. 선택을 위해 적절한 항생제를 사용하여 Luria Broth(LB)-한천 플레이트에 플레이트 변형 박테리아를 만듭니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 또는 실온(RT; 25-30°C)에서 72시간 동안 배양합니다.
      알림: 콜로니가 자란 LB 플레이트는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있으며 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   6. 콜로니 스크린 PCR
      1. PCR 기반 콜로니 스크리닝의 경우, LightR 삽입체와 표적 DNA에서 어닐링하여 약 400-700bp 단편을 생성하는 프라이머를 설계합니다.
      2. LB 플레이트의 소량의 콜로니를 아래 제공된 PCR 혼합물에 추가하고 특정 DNA 중합효소에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 열순환을 진행합니다.
         2x Taq RED 마스터 믹스: 5 μL
         PCR 등급 물 : 5 μL
         100 μM 전방 프라이머 : 0.5 μL
         100 μM 역방향 프라이머: 0.5 μL
      3. 아가로스 겔 전기영동으로 양성 콜로니를 확인합니다.
      4. 원하는 PCR 산물 크기를 생성한 콜로니를 선택하고 플라스미드 백본의 항생제 내성과 일치하도록 항생제와 함께 LB 브로트 3mL에 개별적으로 접종합니다. 그런 다음 배양하고 37°C에서 하룻밤 동안 흔듭니다.
      5. 플라스미드 DNA 추출을 위한 플라스미드 정제 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 액체 배양에서 플라스미드 DNA를 추출하고 염기서열분석을 통해 삽입물의 존재를 확인합니다.
         참고: 클로닝 프라이머는 Supplementary Table 3에 요약되어 있습니다.

2. LightR 효소 활성의 세포 도금 및 생화학적 분석(그림 2A)

1. LightR-kinase(LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf)의 생화학적 분석을 위해 각 실험 그룹에 대해 3.5cm 세포 배양 접시당 1 x 10⁶ 개의 LinXE 세포를 플레이트합니다. 보충 표 4를 참조하십시오.
2. 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 16-18 시간 동안 세포를 배양합니다.
3. 다음 날, 제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 transfection 시약을 사용하여 선택된 DNA 구조체로 세포를 transfection합니다(보충 표 4).
   참고: 최적의 transfection 시약은 사용되는 세포의 구조, 벡터 및 유형에 따라 달라집니다. 이 연구는 transfection 시약을 사용하여 3.5cm 접시에 2μg의 DNA를 사용했습니다. 최적의 transfection 시약을 결정하기 위해 경험적 테스트를 수행해야 합니다. 형질주입된 구조체는 청색광에 의해 조절되는 단백질을 발현하기 때문에, 형질주입된 세포를 처리하는 모든 후속 단계는 적색광 하에서 수행되어야 합니다. 인큐베이터에 넣기 전에 알루미늄 호일로 transfection된 세포로 플레이트를 감싸서 우발적인 조명을 방지합니다.
4. transfection의 16-18 시간 후에 세포를 청색광에 노출시킨다¹⁰. 이를 수행하려면 465nm 발광 다이오드(LED) 패널 램프 시스템을 조직 배양 인큐베이터에 배치합니다. 구멍이 뚫린 플렉시 유리 패널을 l에서 10cm 위에 놓습니다.amp 원하는 조명인 3mW/cm²를 얻습니다(보충 파일 1). 인큐베이터에서 중단 없는 공기 순환을 유지하기 위해 구멍이 뚫린 패널이 필요합니다. 원하는 기간 동안 세포를 비춥니다.
5. LightR-Src 및 LightR-bRaf를 활성화하려면 연속 조명을 사용하십시오. 연속 조명을 위해 LED 패널을 수동으로 켜고 끄십시오.
6. FastLightR Src의 활성화/비활성화 주기를 유지하려면 수동으로 또는 마이크로 컨트롤러에 의해 제어되는 ON/OFF 주기를 사용하십시오.
   참고: 필요한 코드를 작성하고 업로드하기 위한 IDE(통합 개발 환경)를 제공하는 여러 소프트웨어 툴킷을 사용할 수 있습니다. 이 툴킷은 C/C++ 프로그래밍을 지원하며 펄스 조명을 제어하는 데 필수적인 범용 입력/출력(GPIO) 액세스를 제공합니다. 이러한 목적으로 사용되는 프로토콜 및 코드에 대한 자세한 설명은 보충 파일 1에 설명되어 있습니다.
7. 실험의 각 시점(보충 표 4)이 끝나면 안전한 적색광 아래에서 세포를 수확합니다. 매체를 흡인하고 차가운 PBS로 세포를 세척합니다.
8. 단백질을 분리하기 위해 5% v/v 2-메르캅토에탄올이 보충된 500μL의 2x Laemmli 시료 완충액으로 세포를 용해합니다. 용해물을 100°C에서 5분 동안 배양합니다. 단백질 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅에 의한 세포 용해물 분석²¹.
   참고 : 2x Laemmli 완충액의 조성은 다음과 같습니다 : 500mL의 경우 : Tris-HCL 5.18g, 글리세롤 131.5mL, 20 % SDS 52.5mL, 브로 모 페놀 블루 0.5g, 최종 pH 6.8.
9. Tyr249에서 내인성 p130cas의 인산화 수준과 TyrY118^22,23에서 팍실린의 인산화 수준을 평가하여 LightR-Src 활성을 평가합니다(그림 2). Ser217/221에서 MEK1의 인산화 수준과 TyrY202/204^24,25에서 ERK1/2의 인산화 수준을 평가하여 LightR-bRaf 활성을 평가합니다.

3. LightR-Cre 활성의 기능 분석

1. LightR-Cre 활성의 기능 분석을 위해 3.5cm 세포 배양 접시당 1 x 10⁶ 개의 LinXE 세포를 플레이트합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 16-18 시간 동안 세포를 배양합니다.
2. 섹션 2, 그림 2A 및 보충 표 5에 설명된 프로토콜에 따라 세포를 Transfection합니다. LightR-Cre-iRFP670과 Reporter plasmid Floxed-STOP-mCherry²를 1:9 비율로 총 2μg DNA를 동시 transfection합니다.
3. 형질주입 후 16-18시간 후에 세포에 조명을 비춥니다. 효율적인 LightR-Cre 활성화를 위해서는 장시간 조명이 필요합니다. 따라서 광독성을 피하려면 섹션 2 및 보충 파일 1에 자세히 설명된 대로 마이크로 컨트롤러에 의해 제어되는 465nm LED 패널 램프 시스템을 사용하여 2초 ON 및 20초 OFF 주기로 8시간 동안 펄스 조명을 사용하십시오.
4. 20x 공기 대물렌즈와 함께 epifluorescence microscopy를 사용하여 이미징을 수행합니다. LightR-Cre-iRFP670의 시각화에는 Cy5 필터 세트를 사용하고, Floxed-mCherry 표현식에서 mCherry를 시각화하려면 RFP 필터 세트를 사용합니다.
   참고: 이미징의 경우 Cy5/RFP 라이트 큐브가 장착된 형광 현미경이 사용됩니다.

4. 살아있는 세포 이미징을 위한 샘플 준비

1. 세포 배양 배지에서 35mm 조직 배양 접시당 플레이트 2 x 10⁵ HeLa 세포를 만들고 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 2 시간 동안 배양합니다.
2. 세포가 부착되고 밀도가 약 60%-70%가 되면 (i) FastLightR-Src-mCherry-myc 0.85μg/Stargazin-iRFP 0.15μg 또는 (ii) FastLightR-bRaf-Venus 0.75μg/mCherry-ERK2 0.25μg 혼합물 중 하나로 HeLa 세포를 공동 transfection합니다.
   참고: FastLightR-Src 실험에서 Stargazin-iRFP는 세포 확산 분석을 위해 원형질막을 라벨링하는 데 사용됩니다. 더 높은 FastLightR-Src 발현이 필요한 경우 stargazin-iRFP를 생략하고 대신 1μg의 FastLightR-Src를 사용할 수 있습니다. 이러한 경우 멤브레인 염료를 사용하여 세포를 시각화해야 합니다. 원형질막 염색은 세포막을 라벨링하는 데 일상적으로 사용됩니다.
3. 세포의 우발적인 조명을 방지하기 위해 접시를 알루미늄 호일로 덮고 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 16-18 시간 동안 배양합니다.
4. 구조물이 실수로 활성화되는 것을 방지하기 위해 빨간색 조명 아래에서 다음 단계를 모두 완료하십시오. 백색광에 노출되면 LightR-kinase의 활성화가 유도되고 후속 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.
5. 같은 날, 3개의 원형 유리 커버슬립(직경 25mm, 두께 0.17mm)을 37°C의 PBS에서 5mg/L 피브로넥틴으로 밤새 코팅합니다.
6. transfection 후 PBS 16-18 h로 커버슬립을 헹구고 각 커버슬립에 ~1 x 10⁵ 개의 transfection된 HeLa 세포를 플레이트로 만듭니다. 세포 배양 배지에서 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 2 시간 동안 배양합니다.
   참고: 낮은 시딩 밀도는 시야의 셀이 서로 닿지 않도록 하는 데 필요합니다.
7. Levobitz의 L-15 이미징 미디어에 FBS를 최종 농도 5%까지 첨가하여 이미징 미디어를 준비합니다. 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과하고 37°C로 데웁니다.
8. 미네랄 오일을 37°C로 예열합니다.
9. 세포가 들어있는 커버슬립을 PBS로 두 번 세척합니다. 멤브레인 염료를 사용하는 경우 커버슬립을 세척하기 전에 제조업체의 지침에 따라 세포를 염색하십시오.
10. 커버슬립을 살아있는 세포 이미징 챔버에 조심스럽게 넣습니다. 챔버에 L-15 이미징 매체 1mL를 추가합니다.
11. 이미징 과정에서 증발을 방지하기 위해 미디어 위에 미네랄 오일 1mL를 추가합니다.
12. 이미징할 준비가 될 때까지 챔버를 37°C에서 빛으로부터 보호하십시오.

5. FastLightR-Src의 글로벌 활성화 및 이미징(그림 3)

1. 파란색 LED 현미경 링 라이트를 현미경 콘덴서에 부착하고 샘플 홀더에서 약 1.5cm 위에 위치시킵니다. 링 라이트용 AC/DC 제어 릴레이를 현미경 컴퓨터에 연결합니다.
   참고: 이 연구의 실험에서 조명은 이미징 소프트웨어를 통해 TTL(Transistor-Transistor Logic) 인터페이스를 통해 제어되었습니다. Epifluorescent illumination은 또한 외부 조명 소스가 이용 가능하지 않은 경우 LightR 구조체를 전체적으로 활성화하는 데 사용될 수 있습니다. 490/20nm 여기 필터와 같은 GFP 여기 파장은 LightR을 활성화하는 데 효과적입니다.
2. 챔버를 37°C로 예열된 현미경 스테이지에 놓고 FastLightR-Src-mCherry 및 Stargazin-iRFP(그림 3B) 또는 FastLightR-bRaf-Venus 및 mCherry ERK-2(그림 5B)를 발현하는 세포를 선택합니다.
3. 글로벌 일루미네이션 및 이미징 실험 연구에는 아포크로매틱 보정, 플랫 필드 보정 및 높은 개구수를 갖춘 현미경 호환 고성능 대물렌즈(40x)를 사용하십시오.
   1. Src kinase의 글로벌 조명 기반 연구의 경우 561/10nm 여기 및 595/40nm 방출 필터를 사용하여 FastLightR-Src-mCherry를 시각화하고 640/20nm 여기 및 655LP 방출 필터를 사용하여 stargazin-iRFP를 시각화합니다.
   2. bRaf kinase의 글로벌 조명 기반 연구의 경우 514/10nm 여기 및 540/21nm 방출 필터를 사용하여 FastLightR-bRaf-Venus를 시각화하고 561/10nm 여기 및 595/40nm 방출 필터를 사용하여 mCherry-ERK-2를 시각화합니다.
   3. multiband polychroic mirror를 모든 fluorescent imaging channel에서 사용하십시오.
4. 실험 조건에 따라 다음 권장 사항을 고려하십시오.
   1. 세포의 기준선 활동을 확립하기 위해 조명 전에 최소 10분 동안 세포를 이미지화합니다.
      참고: 이 기준선은 조명에 의한 FastLightR 키나아제의 활성화가 세포 거동 또는 단백질 국소화의 변화를 유도하는지 여부를 결정하는 데 필요합니다. 또한 통계적 유의성을 높이기 위해 더 긴 기간의 기초 이미징을 수행할 수 있습니다.
   2. FastLightRs의 빠른 불활성화 역학으로 인해 이미징을 위한 많은 셀을 포함하면 스테이지 위치 간에 Src/bRaf가 비활성화되고 응답이 감쇠될 수 있습니다. 이러한 오류를 피하기 위해, 기술된 프로토콜에서 FastLightR-Kinase 활성을 분석하는 동안 4개의 세포/분을 이미지화하고 총 110분 동안 매분 동안 선택된 각 세포를 이미지화한다(보충 파일 2).
   3. 청색광의 잠재적인 광독성 효과를 줄이기 위해 연속 조명보다 펄스 조명을 사용하십시오. 4개의 cells/min 각각에 대해 12초 동안 조명하는 것이 효과적입니다(보충 파일 2, 그림 3A).
      참고: 조명 주기는 다양한 구성 및 조명 소스 유형에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다.
   4. 형광 채널에서 블리드 스루(bleed through)를 방지하기 위해 cell imaging 중에는 조명을 끄십시오.
      참고: 한 번에 너무 많은 세포를 이미징하면 샘플에 사용할 수 있는 총 조명 시간이 줄어들어 불충분한 활성화로 인해 반응이 약화됩니다.
5. 이미징 후 동영상을 . 분석을 위한 TIF 스택 파일 형식입니다.
   참고: 링 라이트에 비해 GFP 에피형광을 사용한 조명이 덜 균일하기 때문에 GFP 에피형광을 사용한 실험에는 더 빈번한 조명이 필요합니다. 그 결과 실험당 더 적은 수의 세포가 이미징됩니다.

6. FastLightR-Src의 세포내 활성화 및 이미징(그림 4)

1. 챔버를 37°C로 예열된 현미경 스테이지에 놓고 FastLightR-Src-mCherry 및 Stargazin-iRFP를 모두 발현하는 단일 셀을 선택합니다.
2. 셀 내에서 비출 특정 영역(ROI)을 선택합니다. 이 연구는 선택된 세포의 주변부에서 작은 영역을 선택합니다.
   참고: 로컬 조명의 경우 FRAP 모드의 TIRF 모듈 또는 이미징 소프트웨어를 통해 TTL 인터페이스를 통해 제어되는 마이크로 미러 장치에 의해 초점이 맞춰진 445nm 레이저가 사용됩니다. 모든 패턴 조명 시스템이 이러한 실험에 적합합니다. 스캐닝 기반 시스템을 사용하는 경우 셀을 손상시키지 않고 충분한 활성화를 위해 레이저 강도와 균질성을 측정하십시오.
3. 조명 전 기저 상태에서 20분 동안, 국부적으로 조명하는 동안 50분 동안, 활성화 후 20분 동안 총 90분 동안 선택한 셀을 매분 이미지화합니다(보충 파일 2).
4. 활성화 및 비활성화를 위해 LightR 단백질이 완전히 비활성화될 수 있도록 타겟 단백질에 적합한 적절한 시간을 제공하십시오. FastLightR-Src의 경우 잔류 활성이 제거되도록 최소 10분의 비활성화를 허용하고 로컬 조명에 대한 시연된 실험 설정에서 20분의 비활성화를 허용합니다.
5. 이미징 후 동영상을 로 저장합니다. 분석을 위한 TIF 스택 파일 형식입니다.

7. 세포 확산 분석

1. 데이터 처리 및 분석을 위해 이미지를 준비합니다. 이미지가 . TIF 스택 형식. 이미징 소프트웨어에서 직접 저장하거나 오픈 소스 프로그램을 사용하여 변환할 수 있습니다.
2. 보충 데이터 압축 파일²⁶에서 CellGeo 스크립트 패키지를 다운로드합니다.
   참고: CellGeo 패키지에는 여러 가지 스크립트가 포함되어 있습니다. 프로토콜 섹션 7-9에서 다루는 분석 유형에 따라 목록에서 원하는 패키지를 선택합니다.
3. MovThresh라는 스크립트를 열고 실행하여 셀의 마스크를 만듭니다.
   1. 파일 > 가져오기(.tif)를 선택하고 셀의 Stargazin-iRFP 이미지를 선택합니다.
   2. 왼쪽 하단 모서리에 있는 스크롤 막대를 사용하여 프레임을 스캔합니다. 제안된 임계값이 적절한 경우 7.4단계로 이동합니다.
   3. 제안된 임계값이 셀의 동작과 일치하지 않는 경우 [곡선 선택]에서 [매끄럽게] 또는 [사용자 정의 곡선]을 선택합니다. 프레임을 스크롤한 다음 창 오른쪽에 있는 임계값을 조정하여 사용자 지정 곡선을 만듭니다.
   4. Re-Threshold(임계값 재지정)를 클릭합니다.
   5. 파일 > 마스크로 저장을 클릭하고 파일 이름을 변경한 다음 다른 이름으로 저장 옵션을 사용하여 저장합니다.
4. 새로 생성된 스택 파일을 오픈 소스 이미지 분석 프로그램에서 엽니다.
5. [이미지]> [Adjust] > 임계값 조정(Adjust Threshold)>을 선택합니다.
6. 분석 > 입자 분석 > 디스플레이 결과 확인 -> 확인을 선택합니다.
7. 주어진 시간의 면적을 청색광 조사 전 동일한 세포의 평균 면적로 나누어 각 세포의 면적 변화를 계산합니다.
8. 면적 변화를 선 그래프나 막대 그래프로 플로팅합니다.
9. 동일한 조건에서 처리된 모든 셀의 각 시점에 대한 평균값과 90% 신뢰 구간을 계산합니다.

8. 세포 가장자리 역학 분석

1. 프로토콜 섹션 7에 설명된 단계를 사용하여 스택 파일을 준비합니다.
2. ProActive라는 스크립트를 열고 실행합니다.
   1. 파일 > > 마스크 가져오기(.tif)를 선택하고 MovThresh 스크립트를 통해 생성된 마스크를 선택합니다.
   2. 오른쪽 하단 모서리에서 분석에 관심 있는 활동(돌출, 후퇴 또는 전체)을 선택합니다.
   3. 정규화 유형을 선택합니다. 일반적으로 영역 정규화는 이러한 분석에 사용됩니다.
   4. 왼쪽의 슬라이더를 사용하여 참조의 시작 프레임을 선택합니다. 오른쪽의 지연 슬라이더는 셀에 의해 얻은 영역과 손실된 영역을 측정하는 데 사용되는 두 시간 지점 사이의 시간 지연을 결정합니다.
   5. 선택한 프레임과 지연 수가 동영상의 프레임 수보다 더하게 크면 미리보기 이미지가 표시되지 않습니다. 이 값을 총 프레임 수보다 작게 재설정합니다.
3. 돌출 또는 후퇴에 대한 임계값을 수정하려면 결과(Results) 섹션에서 부드러운 곡선(Smooth Curve) 상자를 선택합니다. 이는 특정 기간에 대한 임계값의 평균을 구하며, 사소한 변동이 활동으로 감지되는 문제를 해결할 수 있습니다.
4. Run the Range(범위 실행)를 선택하여 frame 및 lag 슬라이더로 지정된 시간 동안의 활동을 계산합니다.
5. 파일(File) > 다른 이름으로 저장(Save As) > 결과(.mat)를 선택하여 수치 데이터를 저장하고 이를 사용하여 평균 돌출 또는 후퇴 활동을 확인합니다.
6. 각 시점에 대한 90% 신뢰 구간을 결정합니다.
   참고: 이렇게 하면 여러 다른 값의 배열이 저장됩니다. 스크립트에 포함된 "ProActive 사용 방법" 텍스트 파일은 각 값이 나타내는 내용과 결정 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다²⁶.
7. File > Save As > Images (.tif)를 선택하여 활동의 시각적 표현을 저장합니다.

9. 중심 이동 분석

1. 중심 이동 분석의 경우 중심 좌표를 결정할 수 있는 소프트웨어를 사용합니다.
2. 분석 소프트웨어에서 프로토콜 섹션 7에 설명된 대로 관심 셀의 마스킹된 이미지 스택을 엽니다.
3. Measure > Integrated Morphometry Analysis를 선택한 다음 Preferences(기본 설정)> Draw Centroid Mark > Check(중심 마크 그리기)를 클릭한 다음 Measure(측정)를 선택합니다.
   1. 이동하기 전에 중심 좌표를 기록합니다(A).
   2. 실험(B)의 끝에서 중심 좌표를 기록합니다.
   3. 조명 패턴(C)의 중심에 대한 좌표를 기록합니다.
4. 이제 세 점이 수집되었으므로 각도 BAC⁸을 결정합니다. θ₁ 은 각도 ABC에 해당하고 θ₂ 는 각도 CBA 에 해당합니다(그림 4Cii). 다음 방정식을 사용하여 이 작업을 수행합니다.
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   알림: 계산기를 사용하여 좌표에서 직접 각도와 거리를 결정하여 쉽게 사용할 수 있습니다.
5. 셀 중심이 이동한 거리(픽셀)에 변환 계수를 곱하여 중심 변위를 결정합니다(1픽셀은 0.4μm와 같음). 픽셀을 거리로 변환하는 구체적인 방법은 시스템의 배율 및 카메라 설정에 따라 다릅니다.
6. 중심 이동 각도와 거리가 결정되면 극좌표의 이미지를 생성할 수 있는 그래프 소프트웨어를 엽니다.
7. 중심 이동 각도를 θ 측정값으로 삽입하고 이동 거리를 반지름으로 삽입합니다. 분산 분석을 활용하여 95% 신뢰 구간을 검정합니다.
8. 결과를 플로팅하고 영상을 저장합니다.

결과

LightR-Src는 그림 1A,B에 설명된 전략에 따라 설계 및 생성되었습니다. LightR-Src의 생화학적 분석은 60분의 연속 조명에서 청색광에 반응하여 알려진 내인성 Src 기질, p130Cas(Y249)²² 및 paxillin(Y118)²³의 인산화에 액세스합니다(그림 2B). 특히, LightR-Src가 형질주입 후 16-18시간 동안 어둠 속?...

토론

우리의 연구는 다양한 신호 전달 경로의 연구를 위한 광유전학적 접근 방식을 제시하고 다양한 생물학적 질문을 해결하는 데 광범위한 적용 가능성을 보여줍니다. LightR 도구 시스템은 (1) 단백질 활성의 알로스테릭 조절, (2) 활성화 및 불활성화의 다양한 역학을 달성하기 위해 조정할 수 있는 활성의 엄격한 시간적 제어, (3) 세포 내 수준에서의 활성의 공간적 해상도, (4) ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100