光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

要約

このプロトコルは、タンパク質活性の可逆的な時空間制御のための設計された青色光活性化アロステリックスイッチ(LightR)ドメインの適用について説明しています。この研究では、Srcチロシンキナーゼをモデルとして利用し、光制御Src(LightR-Src)を開発および特性評価するための精巧なプロトコルを提供します。これは、酵素クラス間でのこのアプローチの多様性を示しています。

要約

オプトジェネティクスは、酵素活性の複雑な時空間制御を細胞内分解能まで模倣する可能性を提供します。しかし、ほとんどのオプトジェネティクスアプローチは、さまざまな標的タンパク質に適用可能な単一のツールに複数の機能を統合するという大きな課題に直面することがよくあります。ON/OFFキネティクスの正確な制御、暗闇での漏れの最小化、細胞内精度での哺乳類細胞の効率的な性能の実証は、この分野で直面する最も一般的な課題の一部です。有望な解決策は、合理的に設計された光感受性ドメインを適用して、タンパク質活性をアロステリックに制御することにあります。その戦略を使用して、必要なすべての機能を組み合わせた光遺伝学的方法を生成しました。このアプローチでは、光制御アロステリックスイッチモジュール(LightR)を標的タンパク質に組み込み、青色(465 nm)光を使用して酵素活性を調節します。LightRドメインは、2つのVivid(VVD)光受容体ドメインをリンクすることによって生成され、酵素の触媒ドメイン内の小さな柔軟なループに組み込むことができる光感受性クランプを作成します。暗い状態では、LightRクランプは開いているため、酵素の触媒ドメインが歪んで不活性化されます。青色光にさらされると、LightRドメインは閉じて触媒ドメインの構造と酵素活性を回復します。この論文では、光制御プロテインキナーゼを作製するための設計戦略について議論し、ブルーライトによるその制御、可逆性、速度論、および細胞内レベルでの精密な制御を実証し、厳密な時空間精度を可能にします。Srcチロシンキナーゼをモデルとして、LightR-Srcキナーゼ活性を効果的に制御するためのプロトコールを展示します。また、さまざまな酵素クラス間でのLightRの適用性を実証し、さまざまな疾患におけるシグナル伝達経路のメカニズムの問題に対処するツールシステムの有用性を拡大します。

概要

細胞が外部シグナルを解釈し、生理学的または病理学的状況でそれらを特定の応答に変換する能力は、タンパク質の専用グループによって指示されます。このような複雑な応答に対するタンパク質の寄与は、多くの場合、その細胞内位置、発現レベル、および一過性、持続性、または振動性の活性化のタイミングによって定義されます。シグナル伝達の制御におけるこれらの個々のパラメータの役割を解剖するには、細胞内レベルでのタンパク質活性の複雑な時空間制御を再現できる方法が必要です。遺伝子操作や低分子阻害剤などの従来の技術は、この点で不十分です。対照的に、光遺伝学的手法は、生理学的および病理学的プロセスを操作または模倣することにより、生物学的プロセスの解剖の可能性を約束します。しかし、現在のツールは、広範な適用性や細胞内制御に欠けていることがよくあります。いくつかの既存の戦略は、タンパク質の局在と相互作用の厳密な制御を達成します。しかし、酵素活性に対する直接的な制御は欠^{如しています}1,2,3,4。他のものは酵素活性の調節を可能にするが、細胞内制御を欠いているか、または異なる酵素クラス間での適用性が限られている可能性がある

プロトコル

1. LightRの設計・開発(図1)

1. 戦略計画
   注:LightRドメインは、Neurospora crassaの2つのタンデム接続されたVivid(VVD)光受容体ドメインで構成されています^13,14,15,16.VVDは光の存在下でホモ二量体化し、このような二量体化には、あるVVDモノマーのN末端を別のVVDモノマーのC末端(図1A).2つのVVDドメインをフレキシブルリンカーで接続すると、暗闇では開き、青色光で照らされると閉じるクランプ状のドメインが作成されます。このクランプを酵素の触媒ドメインに組み込むことで、光を介した活性制御が可能になります。暗闇では、オープンクランプがドメインを歪め、酵素を不活性化します。ブルーライトで照らすとクランプが閉じ、酵素の活性が回復します(図1B).この概念は、プロテインキナーゼやDNAリコンビナー....

ディスカッション

私たちの研究は、多様なシグナル伝達経路の調査のための光遺伝学的アプローチを提示し、さまざまな生物学的問題に取り組む上でのその広範な適用性を示しています。LightRツールシステムは、(1)タンパク質活性のアロステリック制御、(2)活性化と不活性化の異なる動態を達成するために調整できる活性の厳密な時間制御、(3)細胞内レベルでの活性の空間分解能、(4).......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100