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要約

このプロトコルは、タンパク質活性の可逆的な時空間制御のための設計された青色光活性化アロステリックスイッチ(LightR)ドメインの適用について説明しています。この研究では、Srcチロシンキナーゼをモデルとして利用し、光制御Src(LightR-Src)を開発および特性評価するための精巧なプロトコルを提供します。これは、酵素クラス間でのこのアプローチの多様性を示しています。

要約

オプトジェネティクスは、酵素活性の複雑な時空間制御を細胞内分解能まで模倣する可能性を提供します。しかし、ほとんどのオプトジェネティクスアプローチは、さまざまな標的タンパク質に適用可能な単一のツールに複数の機能を統合するという大きな課題に直面することがよくあります。ON/OFFキネティクスの正確な制御、暗闇での漏れの最小化、細胞内精度での哺乳類細胞の効率的な性能の実証は、この分野で直面する最も一般的な課題の一部です。有望な解決策は、合理的に設計された光感受性ドメインを適用して、タンパク質活性をアロステリックに制御することにあります。その戦略を使用して、必要なすべての機能を組み合わせた光遺伝学的方法を生成しました。このアプローチでは、光制御アロステリックスイッチモジュール(LightR)を標的タンパク質に組み込み、青色(465 nm)光を使用して酵素活性を調節します。LightRドメインは、2つのVivid(VVD)光受容体ドメインをリンクすることによって生成され、酵素の触媒ドメイン内の小さな柔軟なループに組み込むことができる光感受性クランプを作成します。暗い状態では、LightRクランプは開いているため、酵素の触媒ドメインが歪んで不活性化されます。青色光にさらされると、LightRドメインは閉じて触媒ドメインの構造と酵素活性を回復します。この論文では、光制御プロテインキナーゼを作製するための設計戦略について議論し、ブルーライトによるその制御、可逆性、速度論、および細胞内レベルでの精密な制御を実証し、厳密な時空間精度を可能にします。Srcチロシンキナーゼをモデルとして、LightR-Srcキナーゼ活性を効果的に制御するためのプロトコールを展示します。また、さまざまな酵素クラス間でのLightRの適用性を実証し、さまざまな疾患におけるシグナル伝達経路のメカニズムの問題に対処するツールシステムの有用性を拡大します。

概要

細胞が外部シグナルを解釈し、生理学的または病理学的状況でそれらを特定の応答に変換する能力は、タンパク質の専用グループによって指示されます。このような複雑な応答に対するタンパク質の寄与は、多くの場合、その細胞内位置、発現レベル、および一過性、持続性、または振動性の活性化のタイミングによって定義されます。シグナル伝達の制御におけるこれらの個々のパラメータの役割を解剖するには、細胞内レベルでのタンパク質活性の複雑な時空間制御を再現できる方法が必要です。遺伝子操作や低分子阻害剤などの従来の技術は、この点で不十分です。対照的に、光遺伝学的手法は、生理学的および病理学的プロセスを操作または模倣することにより、生物学的プロセスの解剖の可能性を約束します。しかし、現在のツールは、広範な適用性や細胞内制御に欠けていることがよくあります。いくつかの既存の戦略は、タンパク質の局在と相互作用の厳密な制御を達成します。しかし、酵素活性に対する直接的な制御は欠如しています1,2,3,4。他のものは酵素活性の調節を可能にするが、細胞内制御を欠いているか、または異なる酵素クラス間での適用性が限られている可能性がある5,6,7,8,9。このプロトコール論文では、オプトジェネティクスの利点を1つのツールに組み合わせた新しいタンパク質工学法、すなわち、厳密な時間調節、調整可能な速度論、細胞内制御、および広範な酵素の適用性10について説明します。私たちは、目的の標的タンパク質に挿入されるとアロステリックスイッチとして機能する光制御(LightR)ドメインを設計しました。この戦略により、生細胞における目的のタンパク質の活性化と不活性化を厳密に時空間的に制御することができます。

ここでは、いくつかの酵素クラスにわたるLightR光遺伝学ツールの設計と応用戦略について説明します。この研究では、光制御型チロシンキナーゼSrc(LightR-Src)の開発、特性評価、および応用のための段階的なプロトコールを提供します。この研究は、LightRスイッチの不活性化速度論の調整可能な可能性をさらに実証しています。低速不活性化LightRスイッチは、照明の頻度を減らしても酵素活性を維持できますが、高速サイクリングバージョンのFastLightRは、活性化のためにより頻繁な照明を必要としますが、照明をオフにすると急速に不活性化を示します。生細胞におけるFastLightR-Srcの活性化/不活性化は、細胞の拡散と収縮のサイクルを誘導します。FastLightR-Src誘導性細胞拡散は、Srcキナーゼ11,12の生理学的役割と一致しています。FastLightR-Srcは、不活性化速度が速いため、細胞内レベルでも制御でき、局所的な突起の刺激と細胞分極をもたらします。LightRツールが他の種類の酵素に適用可能であることを実証するために、遺伝子操作された光制御キナーゼbRaf(LightR-bRaf、FastLightR-bRaf)と部位特異的DNAリコンビナーゼCre(LightR-Cre)による同様の成功について簡単に説明します。全体として、このアプローチは、多様な疾患の病態生理学を形成する複雑なシグナル伝達経路の理解を前進させる可能性を秘めています。

プロトコル

1. LightRの設計・開発(図1)

  1. 戦略計画
    注:LightRドメインは、Neurospora crassaの2つのタンデム接続されたVivid(VVD)光受容体ドメインで構成されています13,14,15,16.VVDは光の存在下でホモ二量体化し、このような二量体化には、あるVVDモノマーのN末端を別のVVDモノマーのC末端(図1A).2つのVVDドメインをフレキシブルリンカーで接続すると、暗闇では開き、青色光で照らされると閉じるクランプ状のドメインが作成されます。このクランプを酵素の触媒ドメインに組み込むことで、光を介した活性制御が可能になります。暗闇では、オープンクランプがドメインを歪め、酵素を不活性化します。ブルーライトで照らすとクランプが閉じ、酵素の活性が回復します(図1B).この概念は、プロテインキナーゼやDNAリコンビナーゼなど、さまざまなファミリーの酵素に適用できます10 (図1C).
    1. LightRのデザイン
      1. 2つのVVD分子を結合するには、各モノマー間に柔軟な22アミノ酸リンカー(GGS)4G(GGS)3を使用します。
        注:リンカーは、VVDモノマーの会合と解離に対応するのに十分な柔軟性と長さを提供します。
      2. GPGGSGGリンカとGSGGPGリンカをLightRドメインのN末端とC末端にそれぞれ追加します。
        注:リンカーの長さと組成は、特定のタンパク質に合わせて調整する必要がある場合があります。より厳しい規制が必要な場合には、より短いGSGリンカーとシングルGlyリンカーが日常的に使用されます。挿入ループのサイズと触媒残基への近接性も、制御のダイナミックレンジに影響を与えます。ループが短いほど、触媒活性の調節が厳しくなる可能性が高くなりますが、照明後の活性が低下する可能性があります。LightRドメインの配列は 、補足表1に示されています。
    2. LightRの挿入
      注:適切なLightR挿入部位は、その相互作用を立体的にブロックしたり、その生物学的役割に影響を与える不可逆的な構造変化を引き起こしたりすることなく、標的ドメイン機能の厳密な制御を可能にします。標的タンパク質の結晶構造は、LightRの挿入のためのこのような柔軟なループ領域の同定における理想的なガイドです。必要に応じて、近い同族体の結晶構造で十分です。考慮すべき一般的な基準を以下に示します。
      1. 挿入ループが酵素の重要な触媒要素に構造的に結合していることを確認します。選択した挿入ループがタンパク質の既存の結合部位ではなく、LightRの挿入が立体効果による機能的相互作用を潜在的に中断しないことを確認してください。
      2. 最初の戦略として、LightRを挿入するときに挿入ループ内の1つのアミノ酸を置き換えます。溶媒に曝露され、分子内相互作用に関与していない極性または低分子のアミノ酸(Glu、Arg、Lys、Glyなど)を含む挿入ループの中央を標的にします。
        注:1つのアミノ酸置換が機能タンパク質をもたらさない場合、LightRコンストラクトの最適化には、複数のアミノ酸または挿入ループ全体の置換が必要になります。定義されたループ内の LightR の複数の挿入サイトの機能を評価します。
      3. 標的酵素が内因性調節とは無関係に動作することを確認します。これを達成するには、挿入テンプレートに酵素の構成的に活性な変異体バージョンを使用します。
        注:野生型酵素はLightRコンストラクトの生成にも使用できますが、これにより、内因性メカニズムと光によって制御されるAND依存性システムが生じる可能性があります。
      4. ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、LightR酵素活性解析に不可欠です。内因性タンパク質の構成的に活性な変異体をポジティブコントロールとして使用し、標的LightR酵素の触媒的に不活性な変異体バージョンをネガティブコントロールとして使用します。
        注:不活性化変異を選択する際には、LightR酵素フォールディングの不可逆性を乱さないように、変異がLightR挿入部位から十分に離れていることを確認することが重要です。以上の基準に基づき、SrcキナーゼのLightR挿入部位は、ATP結合Gループ/グリシンリッチループ領域の高度に保存されたGXGXXGモチーフとβ鎖を介して構造的に結合したフレキシブルループ領域で選択されます。重要なことに、それはATP結合ポケットおよび基質結合領域10,17から離れた位置に配置されている(図1C(i))。
        注:キナーゼ間の構造的相同性により、bRafのLightR挿入部位は、Srcの挿入部位と同じ構造ループで選択されます(図1C(ii))。
        注:セクション1.1.2に記載されている原理に基づいて、非キナーゼであるCreリコンビナーゼのLightR挿入部位は、触媒コア、すなわちDNA結合部位から離れたフレキシブルループの1つで選択されます。しかし、挿入ループは依然としてαヘリックスを介してDNA結合ドメイン内の重要な触媒残基に構造的に結合しており、LightR-Creの機能を確実に成功させています(図1C(iii))。現在のプロトコルに記載されているさまざまな酵素のポジティブコントロールとネガティブコントロールを持つすべての挿入部位は、補足表2に詳述されています。
    3. FastLightRの開発。
      注:LightRの両方のVVDにI85V変異を導入すると、変異体のダーク状態への急速な変換に起因する、より高速な活性化-不活性化のダイナミクスが可能になります18,19。FastLightR-SrcおよびFastLightR-bRafを高速不活化速度で生成することで、活性化と不活性化の厳密な時間的制御が可能になります。これにより、生細胞におけるLightR-Srcの細胞内制御が可能になります。
      注:Creリコンビナーゼ活性は不可逆的なDNA組換えをもたらします。したがって、LightR の可逆性特性は適用されません。
      注:LightRコンストラクトの検出を容易にするために、蛍光タンパク質または任意の他の適切なタグを標的タンパク質のN末端またはC末端に付加することができる。本研究では、LightR-SrcにmCherry-mycを、LightR-bRafにVenusを、LightR-CreリコンビナーゼにmiRFP670を使用しました。
  2. クローニング戦略
    注:クローニングアプローチは、従来のアプローチとは異なり、特定の制限部位に依存しない部位特異的突然変異誘発に基づいています10,20.
    1. 「メガプライマー」の生成
      1. LightR遺伝子をコドン最適化して、哺乳類細胞における真菌起源の2つのタンデムVVD DNA配列の安定した発現を確保し、PCRを使用したエラーのないクローニングのために配列を可能な限り異なるものにします。コドン最適化を実行するには、手順1.2.1.2-1.2.1.3に従います。
      2. VVDのアミノ酸配列と選択したリンカーを並べて、LightRの理論配列マップを作成します。
      3. コドン最適化のための高度なアルゴリズムを利用するオンラインコドン最適化プラットフォームに配列を貼り付けて、複雑さを最小限に抑えて最適な配列オプションを決定します。ターゲット生物が選択されていること、読み取りフレームが維持されていること、および最適化のためにVVD配列が選択されていることを確認します。
      4. カスタム合成フラグメント( 補足表1参照)として、または以前に公開されたLightRコンストラクト10からLightR DNAを取得する。
      5. LightR遺伝子を増幅して、図1Dに概説した前述の20戦略を使用して「メガプライマー」を生成します。LightR「Megaprimer」を、特定のDNAポリメラーゼに関するメーカーの推奨に従い、以下のPCR反応混合物を使用してPCRで合成します。
        5x DNAポリメラーゼ適合バッファー:10 μL
        100 μM フォワードメガプライマー: 0.5 μL
        100 μM リバースメガプライマー:0.5 μL
        10 nM dNTPミックス:2 μL
        DNAポリメラーゼ(2000ユニット/mL):1μl(0.02U/μL)
        50 ng テンプレート DNA: 1 μL
        PCRグレードの水:35 μL
        注:ここでは、ユニバーサルプライマーアニーリング温度を備えた高忠実度のホットスタートDNAポリメラーゼが使用されます。
      6. 得られたメガプライマーをアガロースゲル電気泳動で分離します。生成物の長さは約1000ヌクレオチドです。アガロースゲルからメガプライマーを取り出し、ゲル抽出キットを使用して、メーカーの推奨に従うか、または類似の技術を使用して精製します。
    2. 部位特異的突然変異導入によるLightR遺伝子の挿入:LightRを挿入し、目的のアミノ酸またはアミノ酸の長さを置き換えます。テンプレートプラスミドは、LightRドメインが挿入されるものになります。以下の混合物を用いて、前述した20 と同様にPCR反応を行う。
      5x DNA ポリメラーゼ適合バッファー:5 μL
      10 nM dNTPミックス:1 μL
      DNAポリメラーゼ(2000ユニット/mL):1μL(0.02U/μL)
      50 ng ターゲットテンプレート DNA: 1 μL
      抽出されたメガプライマー(計算質量):10 μL
      DMSO:2.5μL
      PCRグレードの水:2.5μL
      注:メガプライマーの質量(ng)=目的のインサート/ベクターモル比xベクトルの質量xインサートとベクトルの長さの比率。使用される目的のインサート/ベクターモル比は3/1です。
    3. PCR反応終了後、1 μLのDpnI(2000ユニット/ mL)酵素を加えて、過剰なメチル化DNAのみを選択的に消化し、混合物を37°Cで1〜1.5時間インキュベートします。これにより、変更されたコンストラクトの歩留まりが大幅に向上します。
    4. 1-2 μLのPCR反応液を、メーカーのプロトコールに従ってDH5αコンピテントセルに形質転換します。
    5. Luria Broth(LB)-寒天プレートで細菌をプレート化し、適切な抗生物質を選択して選択します。プレートを37°Cで一晩または室温(RT;25-30°C)で72時間インキュベートします。
      注:コロニーが成長したLBプレートは、4°Cで最大1ヶ月間保存でき、プロトコールを一時停止することができます。
    6. コロニースクリーニングPCR
      1. PCRベースのコロニースクリーニングでは、LightRインサートでアニーリングし、約400〜700 bpのフラグメントを生成するようにDNAを標的とするプライマーを設計します。
      2. LBプレートから少量のコロニーを以下に示すPCRミックスに添加し、特定のDNAポリメラーゼに関するメーカーの推奨に従ってサーモサイクリングに進みます。
        2x Taq RED Master Mix:5 μL
        PCRグレードの水:5μL
        100 μM フォワードプライマー : 0.5 μL
        100 μM リバースプライマー:0.5 μL
      3. アガロースゲル電気泳動により陽性コロニーを確認します。
      4. 目的のPCR産物サイズを生成したコロニーを選択し、プラスミド骨格の抗生物質耐性に一致するように、抗生物質を含む3 mLのLBブロスに個別に接種します。その後、インキュベートし、37°Cで一晩振とうします。
      5. プラスミドDNA抽出用のプラスミド精製キットの製造元の指示に従って、液体培養物からプラスミドDNAを抽出し、シーケンシングによりインサートの存在を確認します。
        注:クローニングプライマーは 、補足表3にまとめられています。

2. 細胞プレーティングとLightR酵素活性の生化学的解析(図2A)

  1. LightR-キナーゼ(LightR Src、FastLightR Src、LightR bRaf)の生化学的解析には、各実験グループごとに3.5 cm細胞培養皿あたり1 x 106 LinXE細胞をプレートします。 補足表4を参照してください。
  2. 細胞を37°Cおよび5%CO2 で16〜18時間インキュベートします。
  3. 翌日、製造元の推奨に従って適切なトランスフェクション試薬を使用して、選択したDNAコンストラクトで細胞をトランスフェクションします(補足表4)。
    注:最適なトランスフェクション試薬は、使用する細胞の構成物、ベクター、およびタイプによって異なります。この研究では、トランスフェクション試薬を使用して、3.5 cmのディッシュに2 μgのDNAを使用しました。最適なトランスフェクション試薬を決定するために、経験的試験を実施する必要があります。トランスフェクションされたコンストラクトは、青色光によって制御されるタンパク質を発現するため、トランスフェクションされた細胞を取り扱う後続のすべてのステップは、赤色光の下で実行する必要があります。トランスフェクションした細胞でプレートをアルミホイルで包んでからインキュベーターに入れ、偶発的な照明を防ぎます。
  4. トランスフェクションの16〜18時間後、細胞を青色光10にさらす。これを行うには、465 nmの発光ダイオード(LED)パネルランプシステムを組織培養インキュベーターに配置します。穴あきプレキシガラスパネルをランプの10cm上に置いて、3 mW / cm2の所望の照明を取得します(補足ファイル1)。インキュベーター内の空気循環を中断なく維持するためには、穴あきパネルが必要です。所望の期間、細胞を照らします。
  5. LightR-SrcおよびLightR-bRafの活性化には、連続照明を使用してください。連続照明の場合は、LEDパネルを手動でオン/オフします。
  6. FastLightR Srcのアクティブ化/非アクティブ化サイクルを維持するには、手動またはマイクロコントローラーによって制御されるオン/オフサイクルを使用してください。
    注: 必要なコードを記述およびアップロードするための統合開発環境 (IDE) を提供するいくつかのソフトウェア ツールキットを利用できます。これらのツールキットは、C/C++プログラミングをサポートし、パルス照明の制御に不可欠な汎用入出力(GPIO)アクセスを提供します。これらの目的で使用されるプロトコルとコードの詳細な説明は、 補足ファイル1に記載されています。
  7. 実験のそれぞれの時点(補足表4)の終了時に、安全な赤色灯の下で細胞を採取します。培地を吸引し、細胞を冷たいPBSで洗浄します。
  8. タンパク質を単離するには、500 μLの2x Laemmliサンプルバッファーに5% v/v 2-メルカプトエタノールを添加して細胞を溶解します。ライセートを100°Cで5分間インキュベートします。タンパク質ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング21による細胞溶解物の分析。
    注:2x Laemmli バッファーの組成は次のとおりです: 500 mL の場合: 5.18 g の Tris-HCL、131.5 mL のグリセロール、52.5 mL の 20% SDS、0.5 g のブロモフェノール ブルー、最終 pH 6.8。
  9. Tyr249上の内因性p130casおよびTyrY118上のパキシリンのリン酸化レベルを評価することにより、LightR-Src活性を評価します22,23(図2)。Ser217/221 の MEK1 と TyrY202/204 の ERK1/2 のリン酸化レベルを評価することにより、LightR-bRaf 活性を評価します24,25。

3. LightR-Cre活性の機能解析

  1. LightR-Cre活性の機能解析には、3.5 cm細胞培養皿あたり1 x 106 LinXE細胞をプレート化します。細胞を37°Cおよび5%CO2 で16〜18時間インキュベートします。
  2. セクション2、 図2A、および 補足表5に概説されているプロトコルに従って細胞をトランスフェクションします。LightR-Cre-iRFP670とレポータープラスミドFloxed-STOP-mCherry2の比率1:9で、合計2 μgのDNAを共トランスフェクションします。
  3. トランスフェクション後16-18時間後、細胞を照らします。LightR-Creを効率的に作動させるには、長時間の照明が必要です。したがって、光毒性を避けるために、セクション2および 補足ファイル1で詳述されているように、マイクロコントローラによって制御される465nm LEDパネルランプシステムを利用して、2秒のONサイクルと20秒のOFFサイクルで8時間のパルス照明を使用してください。
  4. 落射蛍光顕微鏡と20倍エア対物レンズを使用してイメージングを行います。LightR-Cre-iRFP670の可視化にはCy5フィルタセットを、Floxed-mCherry発現からのmCherryの可視化にはRFPフィルタセットを使用します。
    注:イメージングには、Cy5 / RFPライトキューブを備えた落射蛍光顕微鏡が使用されます。

4. ライブセルイメージング用サンプルの調製

  1. 細胞培養培地中の35 mm組織培養ディッシュあたり2 x 105 HeLa細胞をプレートし、37°Cおよび5%CO2で2時間インキュベートします。
  2. 細胞が結合し、コンフルエンシーが約60%〜70%になったら、HeLa細胞を次のいずれかの混合物で共トランスフェクションします:(i)0.85 μgのFastLightR-Src-mCherry-myc/0.15 μgのStargazin-iRFP、または(ii)0.75 μgのFastLightR-bRaf-Venus/0.25 μgのmCherry-ERK2
    注:FastLightR-Src実験では、Stargazin-iRFPを使用して細胞拡散分析用の原形質膜を標識します。より高いFastLightR-Src発現が必要な場合は、stargazin-iRFPを省略し、代わりに1μgのFastLightR-Srcを使用することができます。このような場合、メンブレン色素を使用して細胞を視覚化する必要があります。原形質膜染色は、細胞膜の標識に日常的に使用されています。
  3. 細胞の偶発的な照明を避けるために、皿をアルミホイルで覆い、37°Cおよび5%CO2で16〜18時間インキュベートします。
  4. 赤色光照明の下で次の手順をすべて完了して、コンストラクトが誤って活性化しないようにします。白色光への曝露は、LightR-キナーゼの活性化を誘導し、その後の結果に影響を与える可能性があります。
  5. 同日、丸いガラスカバースリップ3枚(直径25mm、厚さ0.17mm)に5mg/LフィブロネクチンをPBS溶液で37°Cで一晩コーティングします。
  6. トランスフェクション後16-18時間でカバースリップをPBSですすぎ、トランスフェクションしたHeLa細胞を~1 x 105 個ずつ各カバースリップにプレート化します。細胞培養培地で37°Cおよび5%CO2で2時間インキュベートします。
    注:視野内のセルが互いに接触しないようにするには、低い播種密度が必要です。
  7. LevobitzのL-15イメージングメディアにFBSを添加して、イメージングメディアを調製し、最終濃度を5%にします。溶液を0.22μmのフィルターでろ過し、37°Cに温めます。
  8. 鉱油を37°Cに予温します。
  9. 細胞を含むカバースリップをPBSで2回洗浄します。メンブレン色素を使用する場合は、カバーガラスを洗う前に、製造元の指示に従って細胞を染色してください。
  10. カバーガラスを生細胞イメージングチャンバーに慎重に入れます。1 mLのL-15イメージングメディアをチャンバーに加えます。
  11. 培地の上に1 mLの鉱油を加えて、イメージングプロセス中の蒸発を防ぎます。
  12. イメージングの準備が整うまで、チャンバーを37°Cの光から保護してください。

5. FastLightR-Srcの全球活性化とイメージング(図3)

  1. 青色LED顕微鏡リングライトを顕微鏡コンデンサーに取り付け、サンプルホルダーから約1.5cm上に配置します。リングライトのAC / DC制御リレーを顕微鏡コンピューターに接続します。
    注:この研究の実験では、照明はイメージングソフトウェアを介してトランジスタ-トランジスタロジック(TTL)インターフェースを介して制御されました。エピ蛍光照明は、外部照明源が利用できない場合にLightRコンストラクトを全球的に活性化するためにも使用できます。490/20 nm励起フィルターなどのGFP励起波長は、LightRの活性化に効果的です。
  2. チャンバーを37°Cに予熱した顕微鏡ステージに置き、FastLightR-Src-mCherryおよびStargazin-iRFP(図3B)またはFastLightR-bRaf-VenusおよびmCherry ERK-2(図5B)を発現する細胞を選択します。
  3. 全地球照明およびイメージング実験の研究には、アポクロマート補正、フラットフィールド補正、および高開口数を備えた顕微鏡互換の高性能対物レンズ(40倍)を使用します。
    1. Srcキナーゼの全球照明ベースの研究では、561/10 nm励起フィルターと595/40 nm発光フィルターを使用してFastLightR-Src-mCherryを可視化し、640/20 nm励起フィルターと655LP発光フィルターを使用してスターガジン-iRFPを可視化します。
    2. bRafキナーゼの全地球照明ベースの研究では、514/10 nm励起フィルターと540/21 nm発光フィルターを使用してFastLightR-bRaf-Venusを可視化し、561/10 nm励起フィルターと595/40 nm発光フィルターを使用してmCherry-ERK-2を可視化します。
    3. すべての蛍光イメージングチャンネルでマルチバンドポリグラフミラーを使用します。
  4. 実験条件に応じて、次の推奨事項を検討してください。
    1. 照明の少なくとも10分前に細胞を画像化して、細胞のベースライン活性を確立します。
      注:このベースラインは、照明によるFastLightRキナーゼの活性化が細胞の挙動またはタンパク質の局在化に何らかの変化を誘発するかどうかを判断するために必要です。また、より長い期間の基礎イメージングを実行して、より大きな統計的有意性を提供することもできます。
    2. FastLightRsの急速な不活性化速度により、イメージング用の多くの細胞を含めると、ステージ位置間でSrc/bRafが不活性化され、その応答が弱まる可能性があります。このようなエラーを回避するには、記載されたプロトコルでFastLightR-Kinase活性を解析しながら4細胞/分を画像化し、選択した各細胞を毎分合計110分間画像化します(補足ファイル2)。
    3. 連続照明よりもパルス照明を使用して、青色光の潜在的な光毒性の影響を減らします。4つのセル/分ごとに12秒間の照明が効果的です(補足ファイル2、 図3A)。
      注:照明サイクルは、さまざまな構成物と照明源タイプについて経験的に決定する必要があります。
    4. 細胞イメージング中は、蛍光チャンネルのブリードスルーを避けるために、照明をオフにしてください。
      注:一度にイメージングする細胞が多すぎると、サンプルで利用可能な合計照明時間が短くなり、活性化が不十分なため反応が減衰します。
  5. イメージング後、ムービーを.分析用のTIFスタックファイル形式。
    注:GFP落射蛍光法による照明はリング光に比べて均一性が低いため、GFP落射蛍光法を用いた実験では、より頻繁な照明が必要になります。これにより、実験ごとにイメージングされる細胞が少なくなります。

6. FastLightR-Srcの細胞内活性化とイメージング(図4)

  1. チャンバーを37°Cに予熱した顕微鏡ステージに置き、FastLightR-Src-mCherryとStargazin-iRFPの両方を発現する単一の細胞を選択します。
  2. 照らすセル内の特定の領域(ROI)を選択します。この研究では、選択した細胞の周辺にある小さな領域を選択します。
    注:局所照明には、FRAPモードのTIRFモジュールによって集光された445nmレーザー、またはイメージングソフトウェアを介してTTLインターフェースを介して制御されるマイクロミラーデバイスが使用されます。これらの実験には、パターン化された照明システムであれば、どのようなものでも機能します。スキャニングベースのシステムを使用する場合は、細胞に損傷を与えることなく十分な活性化を得るために、レーザー強度と均質性を決定します。
  3. 選択した細胞を、照射前の基礎状態で20分間、局所的に照射しながら50分間、活性化後20分間、合計90分間、選択した細胞を画像化します(補足ファイル2)。
  4. 活性化および不活性化については、LightRタンパク質を完全に不活性化できるように、標的タンパク質に適した適切な時間を与えてください。FastLightR-Srcの場合、残留活性をアブレーションするために少なくとも10分間の不活性化を許容し、局所照明の実証実験セットアップで20分間の不活性化を許可します。
  5. イメージング後、ムービーを.分析用のTIFスタックファイル形式。

7. 細胞拡散解析

  1. データ処理と分析のための画像を準備します。イメージが .TIF スタック形式。これらをイメージングソフトウェアから直接保存するか、オープンソースプログラムを使用して変換します。
  2. 補足データ圧縮ファイル26からCellGeoスクリプトパッケージをダウンロードします。
    注: CellGeo パッケージには、いくつかの異なるスクリプトが含まれています。プロトコルセクション7〜9で説明されている分析のタイプに基づいて、リストから目的のパッケージを選択します。
  3. MovThresh というタイトルのスクリプトを開いて実行し、セルのマスクを作成します。
    1. [ファイル] > [インポート] (.tif) を選択し、セルの Stargazin-iRFP イメージを選択します。
    2. 左下隅のスクロールバーを使用してフレームをスキャンします。推奨されるしきい値が適切である場合は、ステップ 7.4 に進みます。
    3. 提案されたしきい値がセルの動作と一致しない場合は、[ カーブ選択]の下にあるスムージングカーブまたはカスタムカーブを選択します。カスタムカーブを作成するには、フレームをスクロールし、ウィンドウの右側でしきい値を調整します。
    4. [Re-Threshold] をクリックします。
    5. [ファイル] > [マスクとして保存] をクリックし、ファイルの名前を変更して、[名前を付けて保存] オプションを使用して保存します。
  4. 新しく作成したスタックファイルをオープンソースの画像解析プログラムで開きます。
  5. [画像] > [しきい値の調整] > [適用] > を選択します。
  6. [解析]>[パーティクルを解析]>[表示結果を確認]->OKを選択します。
  7. 各セルの面積の変化は、任意の時点での面積を青色光を照射する前の同じセルの平均面積で割ることにより計算します。
  8. 面積の変化を折れ線グラフまたは棒グラフでプロットします。
  9. 同じ条件下で処理されたすべての細胞の各時点の平均値と90%信頼区間を計算します。

8. 細胞エッジダイナミクス解析

  1. プロトコルセクション7で説明されている手順を使用して、スタックファイルを準備します。
  2. ProActiveというタイトルのスクリプトを開いて実行します。
    1. [ファイル] > [インポート マスク] > [マスク] (.tif) を選択し、MovThresh スクリプトを使用して作成したマスクを選択します。
    2. 右下隅で解析対象のアクティビティ(Protrusive、Retractive、 または Total)を選択します。
    3. 正規化のタイプを選択します。通常、これらの解析には面積正規化が使用されます。
    4. 左側のスライダーを使用して、参照の開始フレームを選択します。右側のラグ スライダーは、セルによって得られる面積と失われる面積を計測するために使用される 2 つの時間ポイント間のタイム ラグを決定します。
    5. 選択したフレームとラグ番号がムービーのフレーム数よりも加算が大きい場合、プレビュー画像は表示されません。これらの値をリセットして、フレームの合計数より小さくなります。
  3. 突起または収縮のしきい値を変更するには、ResultsセクションのSmooth Curveのチェックボックスをオンにします。これにより、特定のウィンドウのしきい値が平均化されるため、小さな変動がアクティビティとして検出される問題を解決できます。
  4. [範囲を実行] を選択して、フレーム スライダーとラグ スライダーで指定された時間にわたるアクティビティを計算します。
  5. [ファイル] > [名前を付けて保存] >結果 (.mat)) を選択して数値データを保存し、それを使用して平均突出または収縮アクティビティを決定します。
  6. 各時点の90%信頼区間を求めます。
    注:これにより、いくつかの異なる値の配列が保存されます。スクリプトに含まれている「ProActiveの使用方法」テキストファイルには、各値が何を表し、どのように決定されたかについての詳細な説明が提供されています26。
  7. アクティビティの視覚的表現を保存するには 、[ファイル] > [> イメージとして保存] (.tif) を選択します。

9. 重心シフト解析

  1. 重心シフト解析には、重心座標を決定できるソフトウェアを使用します。
  2. 解析ソフトウェアで、プロトコールセクション7に記載されているように、目的のセルのマスクされた画像スタックを開きます。
  3. 「測定」>「統合形態測定解析」を選択し、「 プリファレンス」>「重心マークの描画」>「チェック」をクリックし、「 測定」を選択します。
    1. 移動前の重心座標を記録します (A)。
    2. 実験の終了時に重心座標を記録します (B)。
    3. 照明パターン(C)の中心の座標を記録します。
  4. 3 つの点が収集されたので、角度 figure-protocol-16348BAC8) を求めます。θ1 は角度 figure-protocol-16495ABC、θ2 は角度 figure-protocol-16614CBA に対応します (図 4Cii)。これは、次の式を使用して行います。
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    注:計算機を使用して、使いやすいように座標から直接角度と距離を決定できます。
  5. 重心の変位を求めるには、セルの重心がピクセル単位で移動した距離に、1 ピクセルが 0.4 μm に等しい変換係数を掛けます。ピクセルから距離への具体的な変換は、システムの倍率とカメラの設定によって異なります。
  6. 重心シフトの角度と距離を決定したら、極座標の画像を生成できるグラフ作成ソフトウェアを開きます。
  7. 重心シフト角度をθ測定値として挿入し、移動距離を半径として挿入します。分散分析を使用して、95%信頼区間を検定します。
  8. 結果をプロットし、画像を保存します。

結果

LightR-Srcは、 図1A、Bで説明されている戦略に従って設計および生成されます。LightR-Srcの生化学的分析では、60分間の連続照明で青色光に応答する既知の内因性Src基質p130Cas(Y249)22 およびパキシリン(Y118)23 のリン酸化にアクセスします(図2B)。特に、トランスフェクション後16-18?...

ディスカッション

私たちの研究は、多様なシグナル伝達経路の調査のための光遺伝学的アプローチを提示し、さまざまな生物学的問題に取り組む上でのその広範な適用性を示しています。LightRツールシステムは、(1)タンパク質活性のアロステリック制御、(2)活性化と不活性化の異なる動態を達成するために調整できる活性の厳密な時間制御、(3)細胞内レベルでの活性の空間分解能、(4)...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、Mark Shaaya博士がLightR酵素および関連プロトコルの開発に貢献したことを称えています。pCAG-iCreはWilson Wong氏(Addgeneプラスミド#89573)から、pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherryは佐藤 Mositoshi氏(Addgene プラスミド#122963)から、V600E変異を持つbRaf-VenusコンストラクトはJohn O'Bryan博士(MUSC)からの贈り物です。pCEFL-ERK2由来のERK2遺伝子(Channing Der博士の研究室、UNCからの寄贈品)をmCherry-C1バックボーンにクローニングして、mCherry-ERK2プラスミドを得ました。 pmiRFP670-N1は、Vladislav Verkhusha(Addgeneプラスミド#79987)からの贈り物でした。この作業は、NIHの助成金R33CA258012、R35GM145318、およびAKへのP01HL151327によって支援されました。この作業は、NLへのT32VBSTトレーニングフェローシップT32HL144459によってさらに支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm RoundWarner Instruments 64-0715 
1.5 mL Tubes USA Scientific cc7682-3394
2x Laemmli BufferFor 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBiorad4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
60 LED Microscope Ring LightBoli OpticsML46241324Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose GoldBiotechA-201
Anti-Erk 1/2 AntibodyCell Signaling9102
Anti-GAPDH AntibodyinvitrogenAM4300
Anti-GFPClontech632380
Anti-mCherry AntibodyinvitrogenM11217
Anti-MEKCell Signaling9122
Anti-p130CasBD Biosciences610271
Anti-paxillinCell Signaling2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 AntibodyCell Signaling9101
Anti-phospho-pY249 p130CasCell Signaling4014
Anti-phospho-Y118 PaxillinCell Signaling2541
Anto-phospho-S217/221 MEKCell Signaling9121
Arduino Compatable Power SupplyCorporate ComputerLJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎A000066
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered 
bRaf-V600E-VenusGift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA GoldBiotechA-420 
Carbenicillin (Disodium)Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dyeinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMix Genesee42-138
DH5a competent cells NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEBN04475
Dpn1 Enzyme NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents 
EGTAAcros 409910250
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent PromegaE2692Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain GoldBioG-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x NEBB7024A
GeneJET Gel extraction Kit Thermo Scientific K0692Gel Extraction Kit 
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Scientific K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL 
HEK 293T Cells ATCC CRL-11268
HeLa Cells ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Iot RelayDigital LoggersDLI 705020645490AC/DC control relay for illumination
Kanamycin MonosulfateGold BiotechnologyK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1xCorning 10-045-CV 
LB Agar FisherBP1425-2
LED Grow Light SystemHQRP884667106091218LED panel lamp system 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024aSoftware for running CellGEO Scripts
MetamorphMolecular DevicesImaging Analysis Software
MgCl2 Fisher ChemicalM33-500
Mineral OilSigma M5310
MiniPrep Kit Gene Choice 96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 wellBio-Rad4561085
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CV 
Multiband Polychroic Mirror89903BSChroma
NaCl Fisher ChemicalS271-3 
PBS w/o Ca and Mg Corning 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ERK2Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes labForce1149Z650.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps 
Phusion Plus DNA PolymeraseThermo Scientific F630S
pmiRFP670-N1Addgene#79987
Polygon 400 Patterned IlluminatorMightexDSI-G-00C
Primers IDT
PVDF MembranesBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches 
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodiumCorning 25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Fischer BP1332-1 For electrophoresis 
UPlanSApo 40x Microscope ObjectiveOlympus1-U2B828
USB TTL BoxNational Instruments6501For TTL interface
β-MercaptoethanolFisher Chemical O3446I-100

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