通过光遗传变构调控对蛋白质活性进行时空调控

摘要

该协议描述了工程蓝光激活变构开关 （LightR） 结构域的应用，用于蛋白质活性的可逆时空控制。利用 Src 酪氨酸激酶作为模型，本研究为开发和表征光调节 Src （LightR-Src） 提供了一种详细的方案。它证明了这种方法跨酶类别的多功能性。

摘要

光遗传学提供了模拟酶活性的复杂时空控制直至亚细胞分辨率的潜力。然而，大多数光遗传学方法在将多种功能集成到适用于各种靶蛋白的单个工具中时通常面临重大挑战。实现对 ON/OFF 动力学的精确控制，确保在黑暗中将泄漏降至最低，并以亚细胞精度在哺乳动物细胞中展示高效性能，是该领域面临的一些最常见挑战。一个有前途的解决方案在于应用合理设计的光敏结构域来变构控制蛋白质活性。使用该策略，我们生成了一种结合了所有所需特征的光遗传学方法。该方法涉及将光调节变构开关模块 （LightR） 掺入靶蛋白中，以使用蓝光 （465 nm） 光调节酶活性。LightR 结构域是通过连接两个 Vivid （VVD） 感光结构域产生的，从而形成一个光敏夹，该夹可以掺入酶催化结构域内的一个小柔性环中。在黑暗状态下，LightR 夹是打开的，从而扭曲了酶的催化结构域并将其灭活。暴露在蓝光下时，LightR 结构域关闭并恢复催化结构域的结构和酶活性。在这份手稿中，我们讨论了产生光调节蛋白激酶的设计策略，并证明了其通过蓝光、可逆性、动力学和亚细胞水平的精确调节来控制，从而实现严格的时空精度。利用 Src 酪氨酸激酶作为模型，我们展示了一种有效调节 LightR-Src 激酶活性的方案。我们还证明了 LightR 在不同酶类别中的适用性，扩展了该工具系统在解决不同疾病中信号通路的机制问题方面的效用。

引言

细胞解释外部信号并将其转化为生理或病理环境中特定反应的能力由专门的蛋白质组指导。任何蛋白质对此类复杂反应的贡献通常由其亚细胞位置、表达水平以及瞬时、持续或振荡激活的时间定义。剖析这些单个参数在信号调控中的作用需要能够在亚细胞水平上复制蛋白质活性的复杂时空控制的方法。基因作和小分子抑制剂等传统技术在这方面存在不足。相比之下，光遗传学技术有望通过纵或模拟生理和病理过程来解剖生物过程。然而，当前的工具通常缺乏广泛的适用性或亚细胞控制。几种现有的策略实现了对蛋白质定位和相互作用的严格调节;但缺乏对酶活性的直接控制 1,2,3,4。其他酶能够调节酶活性，但可能缺乏亚细胞控制或对不同酶类别的适用性有限 ^5,6,7,8,9。在这篇协议论文中，我们描述了一种新的蛋白质工程方法，该方法将光遗传学的优势结合到一个工具中:严格的时间调节、可调动力学、亚细胞控制和广泛的酶适用性¹⁰。我们设计了一个光调节 （LightR） 结构域，当插入目标靶蛋白时，该结构域起变构开关的作用。该策略能够对活细胞中目标蛋白质的激活和失活进行严格的时空控制。

本文讨论了跨多种酶类别的 LightR 光遗传学工具的设计和应用策略。本研究为光调节酪氨酸激酶 Src （LightR-Src） 的开发、表征和应用提供了分步方案。该研究进一步证明了 LightR 开关失活动力学的可调性。慢速灭活 LightR 开关可以在降低照明频率的情况下保持酶活性，而快速循环版本 FastLightR 需要更频繁的照明才能激活，但在关闭照明时会显示快速灭活。FastLightR-Src 在活细胞中的激活/失活会诱导细胞扩散和回缩的循环。FastLightR-Src 诱导的细胞扩散与 Src 激酶的生理作用一致^11,12。由于快速灭活动力学，FastLightR-Src 还可以在亚细胞水平上进行调节，从而刺激局部突起和细胞极化。为了证明 LightR 工具对其他类型酶的适用性，我们简要地向读者介绍了工程光调节激酶 bRaf （LightR-bRaf， FastLightR-bRaf） 和位点特异性 DNA 重组酶 Cre （LightR-Cre） 的类似成功。总体而言，这种方法有可能促进我们对塑造各种疾病病理生理学的复杂信号通路的理解。

研究方案

1. LightR 的设计与开发（图 1）

1. 战略规划
   注意:LightR 结构域由来自 Neurospora crassa 的两个串联连接的 Vivid （VVD） 光感受器结构域组成^13,14,15,16.VVD 在光存在下同源二聚化，这种二聚化涉及构象变化，使一个 VVD 单体的 N 端紧挨着另一个 VVD 单体的 C 端 （图 1A).用柔性接头连接两个 VVD 结构域可创建一个钳状结构域，该结构域在黑暗中打开，在蓝光照射时关闭。将这种夹子整合到酶的催化结构域中可实现光介导的活性调节。在黑暗中，开放的夹子会扭曲结构域，使酶失活;蓝光照射会导致夹具闭合，恢复酶的活性 （图 1B).这个概念可以应用于各种家族的酶，包括蛋白激酶和 DNA 重组酶¹⁰ (图 1C).
   1. LightR 的设计
      1. 要连接两个 VVD 分子，请在每个单体之间使用灵活的 22 个氨基酸接头 （GGS）4G（GGS）3。
         注:接头提供了足够的柔韧性和长度，以适应 VVD 单体的结合和解离。
      2. 将 GPGGSGG 和 GSGGPG 连接子分别添加到 LightR 结构域的 N 端和 C 端。
         注:连接子的长度和组成可能需要针对特定蛋白质进行调整。当需要更严格的监管时，通常使用较短的 GSG 和单 Gly 接头。插入环的大小及其与催化残基的接近程度也会影响调节的动态范围。较短的回路更有可能提供更严格的催化活性调节，但可能导致照明后活性降低。LightR 结构域的序列在 补充表 1 中提供。
   2. 插入 LightR
      注意:合适的 LightR 插入位点将能够对目标结构域功能进行严格调节，而不会空间阻断其相互作用或导致影响其生物学作用的不可逆结构变化。靶蛋白的晶体结构是识别用于插入 LightR 的柔性环区域的理想指南。如有必要，紧密同源物的晶体结构就足够了。下面提供了一些需要考虑的一般标准。
      1. 确保插入环在结构上与酶的关键催化元件偶联。确保所选插入环不是蛋白质的现有结合位点，并且 LightR 的插入不会因空间效应而潜在地破坏任何功能相互作用。
      2. 作为初始策略，在插入 LightR 时更换插入环中的一个氨基酸。靶向插入环的中间，该插入环含有暴露于溶剂且不参与分子内相互作用的极性或小氨基酸（例如，Glu、Arg、Lys、Gly）。
         注:当一种氨基酸替换不产生功能性蛋白时，优化 LightR 构建体将需要替换多个氨基酸或整个插入环。评估定义循环中 LightR 的多个插入位点的功能。
      3. 确保目标酶独立于内源性调节运行。通过使用酶的组成型活性突变版本作为插入模板来实现这一点。
         注:野生型酶也可用于生成 LightR 构建体，但这可能会导致 AND 门控系统受内源性机制和光的调节。
      4. 阳性和阴性对照对于 LightR 酶活性分析至关重要。使用内源性蛋白的组成型活性突变体作为阳性对照，使用靶向 LightR 酶的催化失活突变体版本作为阴性对照。
         注意:选择失活突变时，确保突变与 LightR 插入位点有足够的间隔至关重要，以避免破坏 LightR 酶折叠的不可逆性。基于上述标准，Src 激酶中的 LightR 插入位点被选择在一个灵活的环区域中，该区域在结构上通过 β 链与 ATP 结合 G 环/富含甘氨酸的环区域中高度保守的 GXGXXG 基序偶联。重要的是，它位于 ATP 结合口袋和底物结合区 ^10,17 的位置（图 1C （i））。
         注意:由于激酶之间的结构同源性，bRaf 中的 LightR 插入位点被选择在与 Src 中的插入位点相同的结构环中（图 1C （ii））。
         注:根据第 1.1.2 节中所述的原理，Cre 重组酶（一种非激酶）中的 LightR 插入位点在远离催化核心的柔性环之一中被挑选，即 DNA 结合位点。然而，插入环仍然通过 α 螺旋结构与 DNA 结合域内的关键催化残基偶联，以确保 LightR-Cre 功能的成功（图 1C （iii））。 补充表 2 中详细说明了当前方案中描述的不同酶的阳性和阴性对照的所有插入位点。
   3. FastLightR 的开发。
      注意:在 LightR 中将 I85V 突变引入两个 VVD 可实现更快的激活 - 失活动态，这归因于突变体快速转化为暗态^18,19。具有快速灭活动力学的 FastLightR-Src 和 FastLightR-bRaf 的产生能够对活化和失活进行严格的时间控制。它允许在活细胞中实现 LightR-Src 的亚细胞调节。
      注:Cre 重组酶活性导致不可逆的 DNA 重组;因此，LightR 的可逆性属性不适用。
      注:为了简化 LightR 构建体的检测，可以将荧光蛋白或任何其他合适的标签连接到靶蛋白的 N 端或 C 端。本研究使用 mCherry-myc 进行 LightR-Src，使用 Venus 进行 LightR-bRaf，使用 miRFP670 进行 LightR-Cre 重组酶。
2. 克隆策略
   注意:与传统方法不同，克隆方法基于定点诱变，不依赖于特定的限制性位点^10,20.
   1. 生成"Megaprimer"
      1. 密码子优化 LightR 基因，以确保真菌来源的两个串联 VVD DNA 序列在哺乳动物细胞中的稳定表达，并使序列尽可能不同，以便使用 PCR 进行无错误克隆。要执行密码子优化，请按照以下步骤作 1.2.1.2-1.2.1.3。
      2. 将 VVD 的氨基酸序列和选定的接头并排排列，以创建 LightR 的理论序列图。
      3. 将序列粘贴到任何在线密码子优化平台中，该平台利用先进的密码子优化算法来确定复杂度最低的最佳序列选项。确保选择目标生物体，保持阅读框，并选择 VVD 序列进行优化。
      4. 以定制合成片段（参见 补充表 1）或先前发表的 LightR 构建体¹⁰ 的形式获取 LightR DNA。
      5. 使用图 1D 中概述的先前描述的²⁰ 策略扩增 LightR 基因以生成"Megaprimer"。按照制造商对特定 DNA 聚合酶的建议，使用以下 PCR 反应混合物，通过 PCR 合成 LightR"Mega引物":
         5x DNA 聚合酶兼容缓冲液:10 μL
         100 μM 正向巨引物:0.5 μL
         100 μM 反向巨引物:0.5 μL
         10 nM dNTP 混合物:2 μL
         DNA 聚合酶 （2000 单位/mL）:1 μl （0.02 U/μL）
         50 ng 模板 DNA:1 μL
         PCR 级水:35 μL
         注:此处使用具有通用引物退火温度的高保真热启动 DNA 聚合酶。
      6. 通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的巨引物。产物长度约为 1000 个核苷酸。从琼脂糖凝胶中切除 megaprimer，并按照制造商的建议或使用类似技术使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
   2. 使用定点诱变插入 LightR 基因:插入 LightR，替换所需的氨基酸或一段氨基酸。模板质粒将是插入 LightR 结构域的质粒。如前所述²⁰ 使用以下混合物进行 PCR 反应。
      5x DNA 聚合酶兼容缓冲液:5 μL
      10 nM dNTP 混合物:1 μL
      DNA 聚合酶 （2000 单位/mL）:1 μL （0.02 U/μL）
      50 ng 目标模板 DNA:1 μL
      提取的 Megaprimer（计算质量）:10 μL
      DMSO:2.5 μL
      PCR 级水:2.5 μL
      注:大引物质量 （ng） = 所需的插入片段/载体摩尔比 x 载体质量 x 插入片段与载体长度的比值。所需的插入物/载体摩尔比为 3/1。
   3. PCR 反应完成后，加入 1 μL DpnI （2000 单位/mL） 酶，仅选择性消化过量和甲基化 DNA，并将混合物在 37 °C 下孵育 1-1.5 小时。这将显著提高修饰构建体的产量。
   4. 按照制造商的方案将 1-2 μL 的 PCR 反应物转化到 DH5α 感受态细胞中。
   5. 用适当的抗生素在 Luria Broth （LB） - 琼脂平板上接种转化的细菌以进行选择。将板在 37 °C 下孵育过夜或在室温 （RT; 25-30 °C） 下孵育 72 小时。
      注意:生长有菌落的 LB 板可以在 4 °C 下储存长达 1 个月，并且可以暂停方案。
   6. 菌落筛选 PCR
      1. 对于基于 PCR 的菌落筛选，设计在 LightR 插入片段中退火的引物并靶向 DNA，以产生大约 400-700 bp 的片段。
      2. 将 LB 板中的少量菌落添加到下面提供的 PCR 混合物中，然后按照制造商对特定 DNA 聚合酶的建议进行热循环。
         2x Taq RED 预混液:5 μL
         PCR 级水 : 5 μL
         100 μM 正向引物:0.5 μL
         100 μM 反向引物:0.5 μL
      3. 通过琼脂糖凝胶电泳检查阳性菌落。
      4. 挑选产生所需 PCR 产物大小的菌落，并将它们单独接种到 3 mL 含有抗生素的 LB 肉汤中，与质粒骨架中的抗生素耐药性相匹配。然后，在 37 °C 下孵育并摇动过夜。
      5. 按照质粒纯化试剂盒的制造商说明从液体培养物中提取质粒 DNA，用于质粒 DNA 提取，并通过测序验证插入片段的存在。
         注:克隆引物总结在 补充表 3 中。

2. LightR 酶活性的细胞接种和生化分析（图 2A）

1. 对于 LightR 激酶（LightR Src、FastLightR Src、LightR bRaf）的生化分析，每个实验组每 3.5 cm 细胞培养皿接种 1 x 10⁶ 个 LinXE 细胞。见 补充表 4。
2. 将细胞在 37 °C 和 5 % CO₂ 下孵育 16-18 小时。
3. 第二天，按照制造商的建议，使用合适的转染试剂，用选定的 DNA 构建体转染细胞（补充表 4）。
   注:最佳转染试剂取决于所用细胞的构建体、载体和类型。本研究使用转染试剂在 3.5 cm 培养皿中使用 2 μg DNA。应进行实证测试以确定最佳转染试剂。由于转染的构建体将表达受蓝光调节的蛋白质，因此处理转染细胞的所有后续步骤都必须在红光下进行。在将转染细胞放入培养箱之前，用铝箔包裹带有转染细胞的板，以防止意外照明。
4. 转染 16-18 小时后，将细胞暴露在蓝光下¹⁰。为此，在组织培养箱中放置一个 465 nm 发光二极管 （LED） 面板灯系统。在灯上方 10 cm 处放置一个穿孔有机玻璃面板，以获得 3 mW/cm² 的所需照明（补充文件 1）。需要一个多孔面板来保持培养箱中不间断的空气流通。将细胞照亮所需的时间。
5. 要激活 LightR-Src 和 LightR-bRaf，请使用连续照明。要连续照明，请手动打开和关闭 LED 面板。
6. 为了保持 FastLightR Src 的激活/停用周期，请使用手动控制或由微控制器控制的开/关周期。
   注意:可以使用多个软件工具包，这些工具包提供集成开发环境 （IDE） 来编写和上传所需的代码。这些工具包支持 C/C++ 编程，并提供通用输入/输出 （GPIO） 访问，这对于控制脉冲照明至关重要。 补充文件 1 中描述了用于这些目的的协议和代码的详细说明。
7. 在实验的相应时间点结束时（补充表 4），在安全的红灯下收获细胞。吸出培养基并用冷 PBS 洗涤细胞。
8. 为了分离蛋白质，用 500 μL 补充有 5% v/v 2-巯基乙醇的 2x Laemmli 样品缓冲液裂解细胞。将裂解物在 100 °C 下孵育 5 分钟。通过蛋白质凝胶电泳和 Western blotting 分析细胞裂解物²¹。
   注:2x Laemmli 缓冲液的成分如下:对于 500 mL:5.18 g Tris-HCL、131.5 mL 甘油、52.5 mL 20% SDS、0.5 g 溴酚蓝，最终 pH 值为 6.8。
9. 通过评估内源性 p130cas 在 Tyr249 上和桩蛋白在 TyrY118 上的磷酸化水平来评估 LightR-Src 活性 ^22,23（图 2）。通过评估 MEK1 在 Ser217/221 位点和 ERK1/2 位点对 TyrY202/204 位点的磷酸化水平来评估 LightR-bRaf^{活性 24,25}。

3. LightR-Cre 活性的功能分析

1. 对于 LightR-Cre 活性的功能分析，每 3.5 cm 细胞培养皿接种 1 x 10⁶ 个 LinXE 细胞。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 16-18 小时。
2. 按照第 2 节、 图 2A 和 补充表 5 中概述的方案转染细胞。共转染总共 2 μg DNA，以 1:9 的比例共转染 LightR-Cre-iRFP670 和报告基因质粒 Floxed-STOP-mCherry²。
3. 转染后 16-18 小时后，照射细胞。高效的 LightR-Cre 活化需要长时间的照明。因此，为避免光毒性，使用由微控制器控制的 465 nm LED 面板灯系统，使用 8 小时的脉冲照明，2 秒开和 20 秒关，如第 2 节和 补充文件 1 中所述。
4. 使用带有 20 倍空气物镜的落射荧光显微镜进行成像。对于 LightR-Cre-iRFP670 的可视化，请使用 Cy5 过滤器集，对于来自 Floxed-mCherry 表达的 mCherry 的可视化，请使用 RFP 过滤器集。
   注意:对于成像，使用配备 Cy5/RFP 光立方的落射荧光显微镜。

4. 活细胞成像样品的制备

1. 在细胞培养基中每 35 mm 组织培养皿接种 2 x 10^个 5 个 HeLa 细胞，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 2 小时。
2. 一旦细胞贴壁且汇合度约为 60%-70%，则使用以下混合物之一共转染 HeLa 细胞:（i） 0.85 μg FastLightR-Src-mCherry-myc/0.15 μg Stargazin-iRFP，或 （ii） 0.75 μg FastLightR-bRaf-Venus/0.25 μg mCherry-ERK2
   注:在 FastLightR-Src 实验中，Stargazin-iRFP 用于标记质膜以进行细胞扩散分析。如果需要更高的 FastLightR-Src 表达，可以省略 stargazin-iRFP，而可以使用 1 μg FastLightR-Src 代替。在这些情况下，应使用膜染料来观察细胞。质膜染色剂通常用于标记细胞膜。
3. 用铝箔盖住培养皿，以避免细胞意外照射，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 16-18 小时。
4. 在红光照明下完成以下所有步骤，以避免无意中激活构建体。暴露在白光下会诱导 LightR 激酶的激活，并可能影响后续结果。
5. 同一天，在 37 °C 下用 5 mg/L 纤连蛋白的 PBS 溶液包被 3 个圆形玻璃盖玻片（直径 25 mm，厚度 0.17 mm）过夜。
6. 转染后 16-18 小时用 PBS 冲洗盖玻片，并将 ~1 x 10⁵ 个转染的 HeLa 细胞接种到每个盖玻片上。在 37 °C 和 5% CO₂ 下在细胞培养基中孵育 2 小时。
   注意:低接种密度是必要的，以确保视野中的细胞不会相互接触。
7. 通过将 FBS 添加到 Levobitz 的 L-15 成像培养基中至最终浓度为 5% 来制备成像培养基。通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液并将其加热至 37 °C。
8. 将矿物油预热至 37 °C。
9. 用 PBS 洗涤含有细胞的盖玻片两次。如果使用膜染料，请在清洗盖玻片之前按照制造商的说明对细胞进行染色。
10. 小心地将盖玻片放入活细胞成像室中。向腔室中加入 1 mL 的 L-15 成像介质。
11. 在介质顶部添加 1 mL 矿物油，以防止成像过程中蒸发。
12. 将腔室在 37 °C 下避光，直到准备成像。

5. FastLightR-Src 的全局激活和成像（图 3）

1. 将蓝色 LED 显微镜环形灯连接到显微镜聚光镜上，将其放置在样品架上方约 1.5 cm 处。将环形灯的 AC/DC 控制继电器连接到显微镜计算机。
   注意:对于本研究中的实验，照明是通过成像软件的晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 接口来控制的。如果没有外部照明源，落射荧光照明也可用于全局激活 LightR 构建体。GFP 激发波长，例如 490/20 nm 激发滤光片，可有效激活 LightR。
2. 将腔室放在预热至 37 °C 的显微镜载物台上，并选择表达 FastLightR-Src-mCherry 和 Stargazin-iRFP（图 3B）或 FastLightR-bRaf-Venus 和 mCherry ERK-2（图 5B）的细胞。
3. 对于全局照明和成像实验的研究，请使用与显微镜兼容的高性能物镜 （40x），具有复消色差校正、平场校正和高数值孔径。
   1. 对于基于 Src 激酶的全局照明研究，使用 561/10 nm 激发和 595/40 nm 发射滤光片来可视化 FastLightR-Src-mCherry，并使用 640/20 nm 激发和 655LP 发射滤光片来可视化 stargazin-iRFP。
   2. 对于基于 bRaf 激酶的全局照明研究，使用 514/10 nm 激发和 540/21 nm 发射滤光片来可视化 FastLightR-bRaf-Venus，并使用 561/10 nm 激发和 595/40 nm 发射滤光片来可视化 mCherry-ERK-2。
   3. 在所有荧光成像通道中使用多波段多向色镜。
4. 根据实验条件，请考虑以下建议。
   1. 在照明前对细胞进行至少 10 分钟的成像，以确定细胞的基线活性。
      注:需要此基线来确定通过照明激活 FastLightR 激酶是否会诱导细胞行为或蛋白质定位的任何变化。还可以进行较长时间的基础成像以提供更大的统计意义。
   2. 由于 FastLightR 的快速失活动力学，包括许多用于成像的细胞可能会导致 Src/bRaf 在载物台位置之间失活，并可以减弱其反应。为避免此类错误，在所述方案中分析 FastLightR-Kinase 活性时，以 4 个细胞/分钟的速度成像，并每分钟对每个选定的细胞进行一次成像，总共 110 分钟（补充文件 2）。
   3. 在连续照明上使用脉冲照明，以减少蓝光的潜在光毒性作用。4 个细胞/分钟中的每一个细胞 12 秒的照明是有效的（补充文件 2， 图 3A）。
      注意:应根据经验确定不同结构和照明源类型的照明周期。
   4. 在细胞成像期间关闭 Illumination 以避免荧光通道渗漏。
      注意:一次对过多的细胞进行成像会减少样品可用的总照明时间，从而导致激活不足导致响应减弱。
5. 成像后，将电影另存为 。TIF 堆栈文件格式进行分析。
   注意:由于与环形光相比，GFP 落射荧光的照明不太均匀，因此使用 GFP 落射荧光的实验将需要更频繁的照明。这导致每次实验成像的细胞更少。

6. FastLightR-Src 的亚细胞活化和成像（图 4）

1. 将腔室放在预热至 37 °C 的显微镜载物台上，并选择同时表达 FastLightR-Src-mCherry 和 Stargazin-iRFP 的单个细胞。
2. 选择要照亮的细胞内的特定区域 （ROI）。本研究在所选细胞的外围选择一个小区域。
   注意:对于局部照明，使用由 TIRF 模块在 FRAP 模式下聚焦的 445 nm 激光器或通过成像软件通过 TTL 接口控制的微镜设备。任何图案照明系统都适用于这些实验。如果使用基于扫描的系统，请确定激光强度和均匀性，以便在不损坏细胞的情况下充分激活。
3. 在照明前以基础状态每分钟对所选细胞成像 20 分钟，局部照明时 50 分钟，然后在激活后 20 分钟，总共 90 分钟（补充文件 2）。
4. 对于激活和失活，请提供适合目标蛋白的适当时间，以允许 LightR 蛋白完全失活。对于 FastLightR-Src，允许至少 10 分钟的去活以使残余活性消融，并在演示的局部照明实验装置中允许 20 分钟去活。
5. 成像后，将电影另存为 。TIF 堆栈文件格式进行分析。

7. 细胞扩散分析

1. 准备用于数据处理和分析的图像。确保图像位于 .TIF 堆栈格式。直接从成像软件保存这些内容或使用开源程序进行转换。
2. 从补充数据压缩文件中下载 CellGeo 脚本包²⁶.
   注意:CellGeo 包包含几个不同的脚本。根据协议第 7-9 节中介绍的分析类型，从列表中选择所需的软件包。
3. 打开并运行名为 MovThresh 的脚本，以创建单元格的掩码。
   1. 选择 File > Import （.tif） 并选择单元格的 Stargazin-iRFP 图像。
   2. 使用左下角的滚动条扫描帧。如果建议的阈值合适，请转到步骤 7.4。
   3. 如果建议的阈值与单元格的行为不一致，请在 Curve Selection （曲线选择） 下选择平滑曲线或自定义曲线。通过滚动帧，然后调整窗口右侧的阈值来创建自定义曲线。
   4. 单击 Re-Threshold。
   5. 点击 文件 > 另存为蒙版， 更改文件的名称，然后使用 另存为 选项。
4. 在开源图像分析程序中打开新创建的堆栈文件。
5. 选择 图像 > 调整阈值 > > 应用。
6. 选择 Analyze > Analyze particles > Check display results -> OK。
7. 通过将任何给定时间的面积除以蓝光照射前同一细胞的平均面积来计算每个细胞的面积变化。
8. 将面积变化绘制为折线图或条形图。
9. 计算在相同条件下处理的所有细胞的每个时间点的平均值和 90% 置信区间。

8. 细胞边缘动力学分析

1. 使用协议第 7 节中描述的步骤准备堆栈文件。
2. 打开并运行标题为 ProActive 的脚本。
   1. 选择 "文件">"导入 > 遮罩 （.tif）， 然后选择通过 MovThresh 脚本创建的遮罩。
   2. 在右下角选择感兴趣的分析活动（Protrusive、Retractive 或 Total）。
   3. 选择规范化的类型。通常，面积归一化用于这些分析。
   4. 使用左侧的滑块选择参考的起始帧。右侧的滞后滑块将确定两个时间点之间的时间滞后，用于测量像元获得和丢失的面积。
   5. 如果所选帧数和滞后数加大于影片中的帧数，则不会显示预览图像。将这些值重置为等于小于帧总数。
3. 通过选中 Results 部分下的 Smooth Curve 复选框来修改突出或缩回的阈值。这将对特定时段内的阈值进行平均，从而解决将微小波动检测为活动的问题。
4. 选择 Run the Range 以计算 frame 和 lag 滑块指定的时间内的活动。
5. 通过选择 文件 > 另存为 > 结果 （.mat） 来保存数值数据，并使用它来确定平均伸出或回缩活动。
6. 确定每个时间点的 90% 置信区间。
   注意:这将保存一个包含多个不同值的数组。脚本附带的 "How to use ProActive" 文本文件详细描述了每个值所代表的内容以及如何确定它们²⁶.
7. 通过选择 File > Save As > Images （.tif） 来保存活动的可视化表示形式。

9. 质心偏移分析

1. 对于质心平移分析，请使用任何可以确定质心坐标的软件。
2. 在分析软件中，如协议第 7 节所述打开感兴趣细胞的遮罩图像堆栈。
3. 选择 Measure > Integrated Morphometry Analysis，然后单击 Preferences > Draw Centroid Mark > Check，然后选择 Measure。
   1. 在移动之前记录质心坐标 （A）。
   2. 在实验结束时记录质心坐标 （B）。
   3. 记录照明图案中心的坐标 （C）。
4. 现在已经收集了三个点，确定角度 BAC⁸。θ₁ 对应于角度 ABC，θ ₂ 对应于角度 CBA（图 4Cii）。使用以下公式执行此作:
   cosθ = cos（θ₁ - θ₂） = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   注意:计算器可用于直接从坐标确定角度和距离，以便于使用。
5. 通过将单元质心以像素为单位行进的距离乘以转换因子来确定质心位移，其中 1 个像素等于 0.4 μm。像素到距离的特定转换将取决于系统上的放大倍率和相机设置。
6. 确定质心偏移角度和距离后，打开能够生成极坐标图像的绘图软件。
7. 将质心移位角作为 θ 测量值，将行进距离作为半径。利用方差分析检验 95% 置信区间。
8. 绘制结果并保存图像。

结果

LightR-Src 是按照 图 1A、B 中描述的策略设计和生成的。LightR-Src 的生化分析在连续照明 60 分钟时响应蓝光，获得已知内源性 Src 底物 p130Cas （Y249）²² 和 paxillin （Y118）²³ 的磷酸化（图 2B）。值得注意的是，当 LightR-Src 仅在转染后 16-18 小时内在黑暗中表达时，未观察到 Src 激酶的背...

讨论

我们的研究提出了一种用于研究不同信号通路的光遗传学方法，并证明了其在解决不同生物学问题方面的广泛适用性。LightR 工具系统提供了几个基本优势:（1） 蛋白质活性的变构调节，（2） 对活性的严格时间控制，可以调整以实现不同的激活和失活动力学，（3） 亚细胞水平活性的空间分辨率，（4） 信号调节和生物活性的特异性，以及 （5） 对各种靶蛋白的广泛适用?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100