通过光遗传变构调控对蛋白质活性进行时空调控

摘要

该协议描述了工程蓝光激活变构开关 （LightR） 结构域的应用，用于蛋白质活性的可逆时空控制。利用 Src 酪氨酸激酶作为模型，本研究为开发和表征光调节 Src （LightR-Src） 提供了一种详细的方案。它证明了这种方法跨酶类别的多功能性。

摘要

光遗传学提供了模拟酶活性的复杂时空控制直至亚细胞分辨率的潜力。然而，大多数光遗传学方法在将多种功能集成到适用于各种靶蛋白的单个工具中时通常面临重大挑战。实现对 ON/OFF 动力学的精确控制，确保在黑暗中将泄漏降至最低，并以亚细胞精度在哺乳动物细胞中展示高效性能，是该领域面临的一些最常见挑战。一个有前途的解决方案在于应用合理设计的光敏结构域来变构控制蛋白质活性。使用该策略，我们生成了一种结合了所有所需特征的光遗传学方法。该方法涉及将光调节变构开关模块 （LightR） 掺入靶蛋白中，以使用蓝光 （465 nm） 光调节酶活性。LightR 结构域是通过连接两个 Vivid （VVD） 感光结构域产生的，从而形成一个光敏夹，该夹可以掺入酶催化结构域内的一个小柔性环中。在黑暗状态下，LightR 夹是打开的，从而扭曲了酶的催化结构域并将其灭活。暴露在蓝光下时，LightR 结构域关闭并恢复催化结构域的结构和酶活性。在这份手稿中，我们讨论了产生光调节蛋白激酶的设计策略，并证明了其通过蓝光、可逆性、动力学和亚细胞水平的精确调节来控制，从而实现严格的时空精度。利用 Src 酪氨酸激酶作为模型，我们展示了一种有效调节 LightR-Src 激酶活性的方案。我们还证明了 LightR 在不同酶类别中的适用性，扩展了该工具系统在解决不同疾病中信号通路的机制问题方面的效用。

引言

细胞解释外部信号并将其转化为生理或病理环境中特定反应的能力由专门的蛋白质组指导。任何蛋白质对此类复杂反应的贡献通常由其亚细胞位置、表达水平以及瞬时、持续或振荡激活的时间定义。剖析这些单个参数在信号调控中的作用需要能够在亚细胞水平上复制蛋白质活性的复杂时空控制的方法。基因作和小分子抑制剂等传统技术在这方面存在不足。相比之下，光遗传学技术有望通过纵或模拟生理和病理过程来解剖生物过程。然而，当前的工具通常缺乏广泛的适用性或亚细胞控制。几种现有的策略实现了对蛋白质定位和相互作用的严格调节;但缺乏对酶活性的直接控制 1,2,3,4。其他酶能够调节酶活性，但可能缺乏亚细胞控制或对不同酶类别的适用性有限 ^5,6,7,8,9。在这篇协议论文中，我们描述了一种新的蛋白质工程方法，该方法将光遗传学的优势结合到....

研究方案

1. LightR 的设计与开发（图 1）

1. 战略规划
   注意：LightR 结构域由来自 Neurospora crassa 的两个串联连接的 Vivid （VVD） 光感受器结构域组成^13,14,15,16.VVD 在光存在下同源二聚化，这种二聚化涉及构象变化，使一个 VVD 单体的 N 端紧挨着另一个 VVD 单体的 C 端 （图 1A).用柔性接头连接两个 VVD 结构域可创建一个钳状结构域，该结构域在黑暗中打开，在蓝光照射时关闭。将这种夹子整合到酶的催化结构域中可实现光介导的活性调节。在黑暗中，开放的夹子会扭曲结构域，使酶失活;蓝光照射会导致夹具闭合，恢复酶的活性 （图 1B).这个概念可以应用于各种家族的酶，包括蛋白激酶和 DNA 重组酶¹⁰ (

讨论

我们的研究提出了一种用于研究不同信号通路的光遗传学方法，并证明了其在解决不同生物学问题方面的广泛适用性。LightR 工具系统提供了几个基本优势：（1） 蛋白质活性的变构调节，（2） 对活性的严格时间控制，可以调整以实现不同的激活和失活动力学，（3） 亚细胞水平活性的空间分辨率，（4） 信号调节和生物活性的特异性，以及 （5） 对各种靶蛋白的广泛适用.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100