JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает применение сконструированного домена аллостерического переключателя (LightR), активируемого синим светом, для обратимого пространственно-временного контроля активности белка. Используя тирозинкиназу Src в качестве модели, это исследование предлагает тщательно разработанный протокол для разработки и определения характеристик светорегулируемой Src (LightR-Src). Это демонстрирует универсальность этого подхода для всех классов ферментов.

Аннотация

Оптогенетика предлагает возможности для имитации сложного пространственно-временного контроля активности ферментов вплоть до субклеточного разрешения. Тем не менее, большинство оптогенетических подходов часто сталкиваются со значительными проблемами при интеграции нескольких возможностей в одном инструменте, применимом к широкому спектру белков-мишеней. Достижение точного контроля кинетики ВКЛ/ВЫКЛ, обеспечение минимальной утечки в темноте и демонстрация эффективной работы в клетках млекопитающих с субклеточной точностью являются одними из наиболее распространенных проблем, с которыми сталкиваются в этой области. Многообещающее решение заключается в применении рационально спроектированных светочувствительных доменов для аллостерического контроля активности белков. Используя эту стратегию, мы создали оптогенетический метод, сочетающий в себе все желаемые особенности. Подход включает в себя включение модуля светорегулируемого аллостерического переключателя (LightR) в целевой белок для регуляции активности фермента с помощью синего (465 нм) света. Домен LightR генерируется путем связывания двух фоторецепторных доменов Vivid (VVD), создавая светочувствительный зажим, который может быть встроен в небольшую гибкую петлю в каталитическом домене фермента. В темном состоянии зажим LightR разомкнут, тем самым искажая каталитический домен фермента и инактивируя его. Под воздействием синего света домен LightR замыкается и восстанавливает структуру каталитического домена и активность фермента. В этой рукописи мы обсуждаем стратегии проектирования для генерации регулируемой светом протеинкиназы и демонстрируем контроль над ней с помощью синего света, обратимость, кинетику и точную регуляцию на субклеточном уровне, что обеспечивает высокую пространственно-временную точность. Используя тирозинкиназу Src в качестве модели, мы демонстрируем протокол для эффективной регуляции активности киназы LightR-Src. Мы также демонстрируем применимость LightR к различным классам ферментов, расширяя полезность системы инструментов для решения механистических вопросов сигнальных путей при различных заболеваниях.

Введение

Способность клетки интерпретировать внешние сигналы и преобразовывать их в специфические реакции в физиологическом или патологическом контексте управляется специальными группами белков. Вклад любого белка в такие сложные реакции часто определяется его субклеточным расположением, уровнем экспрессии и временем транзиторной, устойчивой или колебательной активации. Анализ роли этих отдельных параметров в регуляции передачи сигналов требует методов, способных воспроизвести сложное пространственно-временное управление активностью белка на субклеточном уровне. Традиционные методы, такие как генетические манипуляции и низкомолекулярные ингибиторы, не справляются с этой задачей. В противоположность этому, оптогенетические методы обещают потенциал для препарирования биологических процессов путем манипулирования или имитации физиологических и патологических процессов. Тем не менее, современные инструменты часто не имеют широкой применимости или субклеточного контроля. Несколько существующих стратегий обеспечивают жесткую регуляцию локализации и взаимодействия белков; но отсутствует прямой контроль над ферментативной активностью 1,2,3,4. Другие обеспечивают регуляцию ферментативной активности, но могут не иметь субклеточного контроля или иметь ограниченную применимость к различным классам ферментов 5,6,7,8,9. В этом протокольном документе мы описываем новый метод белковой инженерии, который сочетает в себе преимущества оптогенетики в одном инструменте: жесткая временная регуляция, настраиваемая кинетика, субклеточный контроль и широкаяприменимость ферментов. Мы сконструировали светорегулируемый (LightR) домен, который функционирует как аллостерический переключатель при вставке в целевой белок. Эта стратегия обеспечивает строгий пространственно-временной контроль активации и деактивации белка, представляющего интерес в живых клетках.

Здесь обсуждается разработка и стратегия применения оптогенетического инструмента LightR в нескольких классах ферментов. В этом исследовании предлагается пошаговый протокол для разработки, определения характеристик и применения светорегулируемой тирозинкиназы Src (LightR-Src). Исследование также демонстрирует возможность перестройки кинетики инактивации переключателя LightR. Медленно инактивирующий переключатель LightR может поддерживать активность ферментов с уменьшенной частотой освещения, в то время как версия с быстрым циклом, FastLightR, требует более частого включения для активации, но показывает быструю инактивацию при выключенном освещении. Активация/инактивация FastLightR-Src в живых клетках индуцирует циклы клеточного распространения и ретракции. Индуцированное FastLightR-Src распространение клеток согласуется с физиологической ролью Src-киназы11,12. Благодаря быстрой кинетике инактивации, FastLightR-Src также может регулироваться на субклеточном уровне, что приводит к стимуляции локальных выступов и поляризации клеток. Чтобы продемонстрировать применимость инструмента LightR к другим типам ферментов, мы кратко расскажем читателям об аналогичном успехе с помощью сконструированной светорегулируемой киназы bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) и сайт-специфичной рекомбиназы ДНК Cre (LightR-Cre). В целом, этот подход имеет потенциал для улучшения нашего понимания сложных сигнальных путей, формирующих патофизиологию различных заболеваний.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Проектирование и разработка LightR ( Рисунок 1)

  1. Стратегическое планирование
    Примечание: Домен LightR состоит из двух тандемно связанных фоторецепторных доменов Vivid (VVD) из Neurospora crassa13,14,15,16. VVD гомодимеризуются в присутствии света, и такая димеризация включает в себя конформационное изменение, в результате которого N-конец одного мономера VVD находится рядом с C-концом другого мономера VVD (Рисунок 1А). Соединение двух доменов VVD с помощью гибкого компоновщика создает зажимообразный домен, который будет открыт в темноте и закрыт при освещении синим светом. Интеграция этого зажима в каталитический домен фермента обеспечивает светоопосредованную регуляцию активности. В темноте открытый зажим искажает домен, деактивируя фермент; Подсветка синим светом приводит к тому, что зажим замыкается, восстанавливая активность фермента (Рисунок 1B). Эта концепция может быть применена к ферментам из различных семейств, включая протеинкиназы и ДНК-рекомбиназы10 (Рисунок 1С).
    1. Дизайн LightR
      1. Чтобы соединить две молекулы VVD, используйте гибкий 22-аминокислотный линкер (GGS)4G(GGS)3 между каждым мономером.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Линкер обеспечивает достаточную гибкость и длину для размещения ассоциации и диссоциации мономеров VVD.
      2. Добавьте компоновщики GPGGSGG и GSGGPG к N- и C-концам домена LightR соответственно.
        Примечание: Длина и состав линкеров могут нуждаться в корректировке для конкретного белка. Более короткие компоновщики GSG и одинарные компоновщики Gly обычно используются, когда требуется более жесткое регулирование. Размер контура вставки и его близость к каталитическим остаткам также влияют на динамический диапазон регулирования. Более короткие петли с большей вероятностью обеспечат более жесткое регулирование каталитической активности, но могут привести к снижению активности после освещения. Последовательность домена LightR представлена в дополнительной таблице 1.
    2. Вставка LightR
      Примечание: Подходящий сайт вставки LightR обеспечит жесткую регуляцию функции целевого домена, не блокируя его взаимодействия и не вызывая необратимых структурных изменений, которые повлияют на его биологическую роль. Кристаллическая структура белка-мишени является идеальным ориентиром в идентификации таких областей гибкой петли для введения LightR. При необходимости может быть достаточно кристаллической структуры близкого гомолога. Некоторые общие критерии, которые следует учитывать, приведены ниже.
      1. Убедитесь, что контур вставки структурно связан с критическими каталитическими элементами фермента. Убедитесь, что выбранная петля вставки не является существующим сайтом связывания белка и что вставка LightR потенциально не нарушает какие-либо функциональные взаимодействия из-за стерических эффектов.
      2. В качестве первоначальной стратегии замените одну аминокислоту в контуре вставки при введении LightR. Нацельтесь на середину петли введения, содержащую полярную или малую аминокислоту (например, Glu, Arg, Lys, Gly), подвергшуюся воздействию растворителя и не участвующую во внутримолекулярных взаимодействиях.
        Примечание: Если замена одной аминокислоты не приводит к созданию функционального белка, оптимизация конструкции LightR потребует замены нескольких аминокислот или всей петли вставки. Оцените функциональность нескольких мест вставки для LightR в рамках заданного цикла.
      3. Убедитесь, что целевой фермент функционирует независимо от эндогенной регуляции. Этого можно достичь, используя конститутивно активную мутантную версию фермента в качестве шаблона для вставки.
        Примечание: Ферменты дикого типа также могут быть использованы для создания конструкций LightR, но это может привести к созданию И-зависимой системы, которая будет регулироваться эндогенными механизмами и светом.
      4. Положительный и отрицательный контроль жизненно важны для анализа активности фермента LightR. Используйте конститутивно активные мутанты эндогенных белков в качестве положительного контроля и каталитически неактивные мутантные версии целевого фермента LightR в качестве отрицательного контроля.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе инактивирующих мутаций крайне важно убедиться, что мутация находится на достаточном расстоянии от места вставки LightR, чтобы избежать нарушения необратимости сворачивания фермента LightR. Основываясь на вышеуказанных критериях, сайт вставки LightR в киназе Src выбирается в гибкой петлевой области, которая структурно связана с высококонсервативным мотивом GXGXXG в АТФ-связывающей G-петле/богатой глицином области петли через бета-цепь. Важно отметить, что он расположен вдали от кармана связывания АТФ и области связывания субстрата10,17 (рисунок 1C (i)).
        Примечание: Из-за структурной гомологии между киназами, сайт вставки LightR в bRaf выбирается в той же структурной петле, что и сайт вставки в Src (рис. 1C (ii)).
        Примечание: В соответствии с принципами, изложенными в разделе 1.1.2, сайт вставки LightR в рекомбиназу Cre, некиназу, выбирают в одной из гибких петель, удаленных от каталитического ядра, т.е. сайта связывания ДНК. Тем не менее, инсерционная петля по-прежнему структурно связана с критическими каталитическими остатками в ДНК-связывающем домене через α-спираль для обеспечения успешной функциональности LightR-Cre (рис. 1C (iii)). Все сайты введения с положительным и отрицательным контролем для различных ферментов, описанные в настоящем протоколе, подробно описаны в дополнительной таблице 2.
    3. Разработка FastLightR.
      Примечание: Введение мутации I85V в оба VVD в LightR обеспечивает более быструю динамику активации-инактивации, что объясняется быстрым переходом мутанта в темное состояние18,19. Генерация FastLightR-Src и FastLightR-bRaf с быстрой кинетикой инактивации обеспечивает жесткий временной контроль активации и инактивации. Это позволяет достичь субклеточной регуляции LightR-Src в живых клетках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность Cre-рекомбиназы приводит к необратимой рекомбинации ДНК; следовательно, свойства обратимости LightR неприменимы.
      Примечание: Для упрощения идентификации конструкции LightR флуоресцентный белок или любая другая подходящая метка может быть прикреплена к N- или C-концу целевого белка. В этом исследовании использовали mCherry-myc для LightR-Src, Venus для LightR-bRaf и miRFP670 для рекомбиназы LightR-Cre.
  2. Стратегия клонирования
    Примечание: Подход к клонированию, в отличие от традиционных, основан на сайт-направленном мутагенезе, который не опирается на конкретные сайты рестрикции10,20.
    1. Создание "Мегагрунтовки"
      1. Кодон-оптимизация генов LightR для обеспечения стабильной экспрессии двух тандемных последовательностей ДНК VVD грибкового происхождения в клетках млекопитающих и для максимально различения последовательностей для безошибочного клонирования с помощью ПЦР. Для выполнения оптимизации кодонов выполните шаги 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Выровняйте аминокислотную последовательность VVD и выбранных линкеров рядом, чтобы создать теоретическую карту последовательностей LightR.
      3. Вставьте последовательность в любую онлайн-платформу для оптимизации кодонов, которая использует передовой алгоритм оптимизации кодонов, чтобы определить лучший вариант последовательности с минимальной сложностью. Убедитесь, что выбран целевой организм, сохранен кадр считывания и выбраны последовательности VVD для оптимизации.
      4. Получите ДНК LightR в виде специально синтезированного фрагмента (см. дополнительную таблицу 1) или из ранее опубликованной конструкции LightR10.
      5. Амплифицируйте ген LightR для получения «мегапраймера», используя ранее описанную стратегию20 , описанную на рисунке 1D. Синтезировать LightR "Megaprimer" методом ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя для конкретной ДНК-полимеразы и с использованием следующей реакционной смеси ПЦР:
        5x ДНК-полимераза, совместимый буфер: 10 мкл
        100 мкМ Форвардный мегапраймер: 0,5 мкл
        100 μM Обратный мегапраймер: 0,5 μл
        Смесь dNTP 10 нМ: 2 мкл
        ДНК-полимераза (2000 ед/мл): 1 мкл (0,02 ед/мкл)
        50 нг Матричная ДНК: 1 мкл
        Вода для ПЦР: 35 μл
        ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется высокоточная ДНК-полимераза с горячим стартом и универсальными температурами отжига праймера.
      6. Отделите полученный мегапраймер методом электрофореза в агарозном геле. Продукт будет иметь длину примерно 1000 нуклеотидов. Вырежьте мегапраймер из агарозного геля и очистите с помощью набора для экстракции геля, следуя рекомендациям производителя или используя аналогичную методику.
    2. Вставка гена LightR с использованием сайт-направленного мутагенеза: Вставьте LightR, заменив желаемую аминокислоту или длину аминокислот. Шаблон плазмиды будет тем, куда вставляется домен LightR. Проводят реакцию ПЦР, как описано ранее20 , используя следующую смесь.
      5x ДНК-полимераза, совместимый буфер: 5 μл
      10 нМ смесь dNTP: 1 μл
      ДНК-полимераза (2000 ед/мл): 1 мкл (0,02 ед/мкл)
      50 нг ДНК-мишень: 1 мкл
      Экстрагированный мегапраймер (расчетная масса): 10 мкл
      ДМСО: 2,5 мкл
      Вода для ПЦР: 2,5 мкл
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масса мегапраймера (нг) = желаемое молярное отношение вставки/вектора x масса вектора x отношение длины вставки к вектору. Желаемое соотношение вставки/векторного моляра составляет 3/1.
    3. После завершения ПЦР-реакции добавить 1 мкл фермента DpnI (2000 ЕД/мл) для селективного расщепления только избытка и метилированной ДНК и инкубировать смесь при 37 °С в течение 1-1,5 ч. Это значительно повысит выход модифицированного конструктива.
    4. Преобразуйте 1-2 мкл ПЦР-реакции в компетентные клетки DH5α в соответствии с протоколами производителя.
    5. Планшет трансформированных бактерий на бульоне Лурии (LB)-агаровой пластине с соответствующим антибиотиком для выбора. Инкубировать в чашке при температуре 37 °C в течение ночи или при комнатной температуре (RT; 25-30 °C) в течение 72 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты LB с выращенными на них колониями можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца, после чего протокол можно приостановить.
    6. ПЦР с колонийным экраном
      1. Для скрининга колоний на основе ПЦР разрабатывайте праймеры, которые отжигают во вставке LightR и нацеливают ДНК на получение фрагментов размером примерно 400-700.о.
      2. Добавьте небольшое количество колонии из LB-планшета в приведенную ниже смесь для ПЦР и приступайте к термоциклированию, следуя рекомендациям производителя для конкретной ДНК-полимеразы.
        2x Taq RED Master Mix: 5 мкл
        Вода для ПЦР: 5 μл
        100 μM Прямой праймер: 0,5 μл
        100 мкМ Обратный праймер: 0,5 мкл
      3. Проверьте наличие положительных колоний с помощью электрофореза в агарозном геле.
      4. Выберите колонии, которые генерировали желаемый размер продукта ПЦР, и инокулируйте их по отдельности в 3 мл бульона LB с антибиотиком, соответствующим устойчивости к антибиотикам в плазмидном скелете. Затем инкубируйте и встряхивайте при температуре 37 °C в течение ночи.
      5. Извлеките плазмидную ДНК из жидкой культуры, следуя инструкциям производителя на наборе для очистки плазмид для экстракции плазмидной ДНК и проверьте наличие вкладыша путем секвенирования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры для клонирования кратко изложены в Дополнительной таблице 3.

2. Нанесение покрытий на клетки и биохимический анализ активности фермента LightR (рис. 2А)

  1. Для биохимического анализа LightR-киназ (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf) планшет 1 x 106 клеток LinXE на 3,5 см в чашке для клеточной культуры для каждой опытной группы. Смотрите дополнительную таблицу 4.
  2. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5 %CO2 в течение 16-18 часов.
  3. На следующий день проведите трансфекцию клеток с помощью выбранной конструкции ДНК с использованием подходящего реагента для трансфекции в соответствии с рекомендациями производителя (Дополнительная таблица 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный реагент для трансфекции будет зависеть от конструкции, вектора и типа используемых клеток. В этом исследовании использовали 2 мкг ДНК в чашке размером 3,5 см с использованием трансфекционного реагента. Для определения оптимального реагента для трансфекции необходимо провести эмпирические испытания. Поскольку трансфицированные конструкции будут экспрессировать белки, регулируемые синим светом, все последующие шаги по работе с трансфицированными клетками должны выполняться под красным светом. Перед помещением в инкубатор оберните пластины с трансфицированными клетками алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить случайное освещение.
  4. Через 16-18 ч после трансфекции подвергайте клетки воздействию синего света10. Для этого поместите в инкубатор для культуры тканей панельную систему светодиодов (LED) с длиной волны волны 465 нм. Поместите перфорированную панель из плексигласа на 10 см выше лампы, чтобы получить желаемую освещенность 3 мВт/см2 (Дополнительный файл 1). Перфорированная панель нужна для поддержания бесперебойной циркуляции воздуха в инкубаторе. Подсвечивайте ячейки на нужный период.
  5. Для активации LightR-Src и LightR-bRaf используйте непрерывную подсветку. Для непрерывного освещения включайте и выключайте светодиодную панель вручную.
  6. Для поддержания цикла активации/деактивации FastLightR Src используйте циклы включения/выключения, управляемые вручную или с помощью микроконтроллера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать несколько наборов программных инструментов, которые предоставляют интегрированную среду разработки (IDE) для написания и загрузки необходимого кода. Эти наборы инструментов поддерживают программирование на C/C++ и обеспечивают доступ к вводу/выводу общего назначения (GPIO), что необходимо для управления импульсным освещением. Подробное описание протоколов и кода, используемых для этих целей, описано в Дополнительном файле 1.
  7. В конце соответствующих временных точек эксперимента (Дополнительная таблица 4) соберите клетки под безопасным красным светом. Отсадите среду и промойте клетки холодным PBS.
  8. Чтобы выделить белок, лизируйте клетки 500 мкл 2-кратного буфера для проб Laemmli с добавлением 5% v/v 2-меркаптоэтанола. Инкубировать лизат при 100 °C в течение 5 минут. Анализируйте клеточные лизаты с помощью электрофореза в белковом геле и вестерн-блоттинга21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав 2х Лаеммли буфера следующий: На 500 мл: 5,18 г Трис-HCL, 131,5 мл глицерина, 52,5 мл 20% SDS, 0,5 г бромфенолового синего, конечный pH 6,8.
  9. Оцените активность LightR-Src путем оценки уровня фосфорилирования эндогенного p130cas на Tyr249 и паксиллина на TyrY11822,23 (рис. 2). Оценивайте активность LightR-bRaf путем оценки уровня фосфорилирования MEK1 на Ser217/221 и ERK1/2 на TyrY202/20424,25.

3. Функциональный анализ активности LightR-Cre

  1. Для функционального анализа активности LightR-Cre в планшете 1 x 106 клеток LinXE на чашку для культивирования клеток размером 3,5 см. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 16-18 часов.
  2. Трансфектируйте клетки в соответствии с протоколом, описанным в разделе 2, рисунке 2А и в дополнительной таблице 5. Совместно трансфектируйте в общей сложности 2 мкг ДНК с соотношением 1:9 LightR-Cre-iRFP670 и репортерной плазмиды Floxed-STOP-mCherry2.
  3. Через 16-18 ч после трансфекции осветите клетки. Для эффективной активации LightR-Cre требуется длительное освещение. Поэтому, чтобы избежать фототоксичности, используйте импульсное освещение в течение 8 часов с циклами включения 2 с и выключения 20 с с использованием системы светодиодных панельных ламп с длиной волны 465 нм, управляемой микроконтроллером, как подробно описано в разделе 2 и дополнительном файле 1.
  4. Выполняйте визуализацию с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с 20-кратным воздушным объективом. Для визуализации LightR-Cre-iRFP670 используйте набор фильтров Cy5, а для визуализации mCherry из выражения Floxed-mCherry используйте набор фильтров RFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации используется эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный световыми кубами Cy5/RFP.

4. Подготовка образцов для визуализации живых клеток

  1. Планшет 2 x 105 клеток HeLa на 35 мм в чашке для культуры тканей в клеточных культуральных средах и инкубировать в течение 2 ч при 37 °C и 5%CO2.
  2. После того, как клетки прилипли и слияние составляет примерно 60%-70%, сотрансфектируйте клетки HeLa одной из следующих смесей: (i) 0,85 мкг FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 мкг Stargazin-iRFP, или (ii) 0,75 мкг FastLightR-bRaf-Venus/0,25 мкг mCherry-ERK2
    ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах FastLightR-Src Stargazin-iRFP используется для мечения плазматической мембраны для анализа распространения клеток. Если требуется более высокая экспрессия FastLightR-Src, можно не использовать stargazin-iRFP, а вместо него можно использовать 1 μg FastLightR-Src. В этих случаях для визуализации клеток следует использовать мембранный краситель. Красители на плазматических мембранах обычно используются для мечения клеточных мембран.
  3. Накройте чашку алюминиевой фольгой, чтобы избежать случайного освещения ячеек, и инкубируйте в течение 16-18 ч при 37 °C и 5% CO2.
  4. Выполните все следующие действия при освещении красным светом, чтобы избежать случайной активации конструкций. Воздействие белого света вызывает активацию LightR-киназ и может повлиять на последующие результаты.
  5. В тот же день покройте 3 круглые стеклянные покровные стекла (диаметром 25 мм, толщиной 0,17 мм) на ночь 5 мг/л фибронектина в PBS при 37 °C.
  6. Промойте покровные стекла PBS через 16-18 часов после трансфекции и нанесите ~1 x 105 трансфицированных клеток HeLa на каждый покровный лист. Инкубировать в питательных средах в течение 2 ч при 37 °C и 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая плотность посева необходима для того, чтобы клетки в поле зрения не соприкасались друг с другом.
  7. Подготовьте фильтрующий материал, добавив FBS в фильтрующий материал Levobitz L-15 до конечной концентрации 5%. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм и нагрейте его до 37 °C.
  8. Разогреть минеральное масло до 37 °C.
  9. Промойте покровные стекла, содержащие ячейки, PBS два раза. Если вы используете мембранный краситель, перед стиркой покровных стекол нанесите краску на ячейки, следуя инструкциям производителя.
  10. Осторожно поместите покровное стекло в камеру для визуализации живых клеток. Добавьте в камеру 1 мл среды для визуализации L-15.
  11. Добавьте 1 мл минерального масла поверх фильтрующего материала, чтобы предотвратить испарение во время процесса визуализации.
  12. Держите камеру в защищенном от света месте при температуре 37 °C до тех пор, пока она не будет готова к съемке.

5. Глобальная активация и визуализация FastLightR-Src (Рисунок 3)

  1. Прикрепите синий светодиодный кольцевой светильник для микроскопа к конденсатору микроскопа, расположив его примерно на 1,5 см выше держателя образца. Подключите реле управления переменным/постоянным током для кольцевой подсветки к компьютеру микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах в этом исследовании освещение контролировалось через интерфейс транзисторно-транзисторной логики (TTL) через программное обеспечение для визуализации. Эпифлуоресцентное освещение также может быть использовано для глобальной активации конструкций LightR, если внешний источник освещения недоступен. Длины волн возбуждения GFP, такие как фильтр возбуждения 490/20 нм, эффективны для активации LightR.
  2. Поместите камеру на предметный столик микроскопа, предварительно нагретый до 37 °C, и выберите клетки, экспрессирующие FastLightR-Src-mCherry и Stargazin-iRFP (рис. 3B) или FastLightR-bRaf-Venus и mCherry ERK-2 (рис. 5B).
  3. Для изучения экспериментов по глобальному освещению и визуализации используйте совместимые с микроскопами высокопроизводительные объективы (40x) с апохроматической коррекцией, коррекцией плоского поля и высокой числовой апертурой.
    1. Для исследований Src-киназы на основе глобального освещения, используйте фильтры возбуждения 561/10 нм и фильтры излучения 595/40 нм для визуализации FastLightR-Src-mCherry и используйте возбуждение 640/20 нм и фильтр излучения 655LP для визуализации stargazin-iRFP.
    2. Для исследований bRaf-киназы на основе глобального освещения, используйте фильтры возбуждения 514/10 нм и эмиссионные фильтры 540/21 нм для визуализации FastLightR-bRaf-Venus и используйте фильтры возбуждения 561/10 нм и эмиссионные фильтры 595/40 нм для визуализации mCherry-ERK-2.
    3. Используйте многополосное полихроичное зеркало во всех флуоресцентных каналах визуализации.
  4. В зависимости от условий эксперимента учитывайте следующие рекомендации.
    1. Визуализируйте клетки не менее чем за 10 минут до освещения, чтобы установить базовую активность клеток.
      Примечание: Этот базовый уровень необходим для определения того, вызывает ли активация киназы FastLightR при освещении какие-либо изменения в поведении клетки или локализации белка. Можно также проводить более длительные периоды базальной визуализации для обеспечения большей статистической значимости.
    2. Из-за быстрой инактивации кинетики FastLightR, включение многих клеток для визуализации может вызвать деактивацию Src/bRaf между позициями стадии и может ослабить его ответ. Чтобы избежать такой ошибки, при анализе активности FastLightR-киназы в описанном протоколе необходимо визуализировать 4 ячейки/мин и каждую выбранную ячейку каждую минуту в общей сложности 110 мин (Дополнительный файл 2).
    3. Используйте импульсное освещение вместо непрерывного, чтобы уменьшить потенциальное фототоксическое воздействие синего света. Освещение в течение 12 с для каждой из 4 ячеек/мин является эффективным (Дополнительный файл 2, Рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Циклы освещения должны быть определены эмпирически для различных конструкций и типов источников освещения.
    4. Отключите подсветку во время визуализации клетки, чтобы избежать просачивания во флуоресцентных каналах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременная визуализация слишком большого количества клеток уменьшит общее время освещения, доступное для образца, что приведет к ослаблению реакции из-за недостаточной активации.
  5. После создания образа сохраните видеоролики в формате . Формат файла стека TIF для анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за менее равномерного освещения при эпифлуоресценции GFP по сравнению с кольцевым светом, эксперименты с использованием эпифлуоресценции GFP потребуют более частого освещения. Это приводит к меньшему количеству изображений клеток за один эксперимент.

6. Субклеточная активация и визуализация FastLightR-Src (Рисунок 4)

  1. Поместите камеру на предметный столик микроскопа, предварительно нагретый до 37 °C, и выберите одну ячейку, экспрессирующую как FastLightR-Src-mCherry, так и Stargazin-iRFP.
  2. Выберите определенные области (ROI) в ячейке для подсветки. В этом исследовании выбирается небольшой участок на периферии выбранной клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для локального освещения используется лазер с длиной волны 445 нм, сфокусированный модулем TIRF в режиме FRAP, или микрозеркальное устройство, управляемое через интерфейс TTL через программное обеспечение для формирования изображений. Для этих экспериментов подойдет любая система подсветки с рисунком. Если используется система на основе сканирования, определите интенсивность и однородность лазера для достаточной активации без повреждения клетки.
  3. Визуализируйте выбранную ячейку каждую минуту в течение 20 минут в базальном состоянии до освещения, 50 минут при локальном освещении, затем через 20 минут после активации, всего 90 минут (Дополнительный файл 2).
  4. Для активации и деактивации предоставьте достаточное количество времени, подходящее для целевого белка, чтобы обеспечить полную деактивацию белка LightR. Для FastLightR-Src дайте не менее 10 минут на деактивацию для удаления остаточной активности и дайте 20 минут на деактивацию в продемонстрированной экспериментальной установке для локального освещения.
  5. После создания образа сохраните видеоролики как . Формат файла стека TIF для анализа.

7. Анализ распространения клеток

  1. Подготовка изображений к обработке и анализу данных. Убедитесь, что изображения находятся в формате . Формат стека TIF. Сохраните их непосредственно из программного обеспечения для обработки изображений или преобразуйте с помощью программы с открытым исходным кодом.
  2. Загрузите пакет скрипта CellGeo из архивированных файлов с дополнительными данными26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пакет CellGeo содержит несколько различных скриптов. Выберите нужный пакет из списка в зависимости от типа анализа, как описано в разделах 7-9 протокола.
  3. Откройте и запустите скрипт под названием MovThresh , чтобы создать маску ячейки.
    1. Выберите Файл > Импорт (.tif) и выберите изображения ячеек Stargazin-iRFP.
    2. Сканируйте кадры с помощью полосы прокрутки в левом нижнем углу. Если предложенный порог подходит, перейдите к шагу 7.4.
    3. Если предложенное пороговое значение не соответствует поведению ячейки, выберите сглаженные или пользовательские кривые в разделе «Выбор кривой». Создайте пользовательскую кривую, прокрутив фреймы, а затем отрегулировав порог в правой части окна.
    4. Нажмите кнопку Повторное пороговое значение.
    5. Нажмите Файл > Сохранить как маску, Изменить имя файла и сохраните его с помощью опции Сохранить как.
  4. Откройте только что созданный файл стека в программе анализа изображений с открытым исходным кодом.
  5. Выберите Изображение > Настроить пороговое значение > > Применить.
  6. Выберите Анализировать > Анализировать частицы > Проверить результаты отображения -> OK.
  7. Рассчитайте изменение площади для каждой клетки, разделив площадь в любой момент времени на среднюю площадь той же клетки до облучения синим светом.
  8. Нанесите изменение области на график в виде линейной или столбчатой диаграммы.
  9. Вычислите среднее значение и 90% доверительные интервалы для каждой временной точки всех ячеек, обрабатываемых в одинаковых условиях.

8. Анализ динамики краев клеток

  1. Подготовьте файлы стека, выполнив действия, описанные в разделе 7 протокола.
  2. Откройте и запустите скрипт под названием ProActive.
    1. Выберите Файл > Импорт > Маски (.tif) и выберите маску, созданную с помощью скрипта MovThresh.
    2. Выберите интересующее вас действие в анализе в правом нижнем углу («Выступающее», «Втягивающее» или «Итого»).
    3. Выберите тип нормализации. Как правило, для этих анализов используется нормализация площадей.
    4. Выберите начальную систему отсчета с помощью ползунка слева. Бегунок задержки справа определяет временную задержку между двумя временными точками, используемыми для измерения площади, полученной и потерянной ячейкой.
    5. Если выбранный кадр и число задержки суммарно больше, чем количество кадров в фильме, изображение предварительного просмотра не будет отображаться. Сбросьте эти значения так, чтобы они были меньше общего количества кадров.
  3. Измените пороговое значение выступа или втягивания, установив флажок «Сглаженная кривая » в разделе «Результаты ». Это позволяет усреднить пороговые значения за определенный период, что может решить проблемы, при которых незначительные колебания обнаруживаются как активность.
  4. Выберите «Запустить диапазон», чтобы рассчитать активность за время, указанное ползунками кадра и задержки.
  5. Сохраните числовые данные, выбрав «Файл» > «Сохранить как > результаты» (.mat), и используйте их для определения среднего выступающего или втягивающего действия.
  6. Определите 90% доверительные интервалы для каждой временной точки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этом будет сохранен массив из нескольких различных значений. Текстовый файл "How to use ProActive", включенный в состав скрипта, содержит подробное описание того, что представляет собой каждое значение и как они были определены.
  7. Сохраните визуальное представление действия, выбрав «Файл» > «Сохранить как > изображений (.tif)».

9. Анализ сдвига центроида

  1. Для анализа сдвига центроида используйте любое программное обеспечение, которое может определить координаты центроида.
  2. В программном обеспечении для анализа откройте стек замаскированных изображений интересующей клетки, как описано в разделе 7 протокола.
  3. Выберите «Измерение» > «Интегрированный морфометрический анализ», а затем нажмите «Настройки» > «Нарисовать отметку центроида > «Проверить», затем выберите «Измерить».
    1. Запишите координаты центроида перед движением (A).
    2. Запишите координаты центроида в конце эксперимента (B).
    3. Запишите координаты для центра диаграммы направленности (C).
  4. Теперь, когда три точки собраны, определим угол figure-protocol-31331BAC8. θ1 соответствует углу figure-protocol-31491ABC, а θ2 соответствует углу figure-protocol-31628CBA (рис. 4Cii). Сделайте это с помощью следующей формулы:
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Калькулятор может быть использован для определения углов и расстояний непосредственно по координатам для удобства использования.
  5. Определите смещение центроида путем умножения расстояния, которое прошел центроид ячейки в пикселях, на коэффициент преобразования, где 1 пиксель равен 0,4 мкм. Конкретное преобразование пикселей в расстояние будет зависеть от увеличения и настройки камеры в системе.
  6. После того, как угол смещения центроида и расстояние будут определены, откройте программное обеспечение для построения графиков, способное создавать изображения полярных координат.
  7. Вставьте угол смещения центроида в качестве измерения θ, а пройденное расстояние — в качестве радиуса. Используйте ANOVA для тестирования 95% доверительных интервалов.
  8. Отобразите результаты на графике и сохраните изображение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

LightR-Src разработан и сгенерирован в соответствии со стратегией, описанной на рисунках 1A, B. Биохимический анализ LightR-Src позволяет получить доступ к фосфорилированию известных эндогенных субстратов Src, p130Cas (Y249)22 и паксиллина (Y118)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В нашем исследовании представлен оптогенетический подход к изучению различных сигнальных путей и продемонстрирована его широкая применимость в решении различных биологических вопросов. Инструментальная система LightR обладает несколькими существенными преимуществ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность доктору Марку Шаайе за его вклад в разработку ферментов LightR и связанных с ними протоколов. pCAG-iCre был подарком от Уилсона Вонга (Addgene plasmid #89573), pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry был подарком от Mositoshi Sato (Addgene plasmid #122963), конструкция bRaf-Venus с мутацией V600E была подарком от доктора Джона О'Брайана (MUSC); Ген ERK2 из pCEFL-ERK2 (подарок из лаборатории доктора Ченнинга Дера, UNC) был клонирован в основу mCherry-C1 для получения плазмиды mCherry-ERK2; а pmiRFP670-N1 был подарком от Владислава Верхуши (плазмида Addgene #79987). Работа была поддержана грантами NIH R33CA258012, R35GM145318 и P01HL151327 AK. Эта работа была дополнительно поддержана учебной стипендией T32 VBST, T32HL144459 в Нидерланды.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm RoundWarner Instruments 64-0715 
1.5 mL Tubes USA Scientific cc7682-3394
2x Laemmli BufferFor 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBiorad4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
60 LED Microscope Ring LightBoli OpticsML46241324Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose GoldBiotechA-201
Anti-Erk 1/2 AntibodyCell Signaling9102
Anti-GAPDH AntibodyinvitrogenAM4300
Anti-GFPClontech632380
Anti-mCherry AntibodyinvitrogenM11217
Anti-MEKCell Signaling9122
Anti-p130CasBD Biosciences610271
Anti-paxillinCell Signaling2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 AntibodyCell Signaling9101
Anti-phospho-pY249 p130CasCell Signaling4014
Anti-phospho-Y118 PaxillinCell Signaling2541
Anto-phospho-S217/221 MEKCell Signaling9121
Arduino Compatable Power SupplyCorporate ComputerLJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎A000066
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered 
bRaf-V600E-VenusGift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA GoldBiotechA-420 
Carbenicillin (Disodium)Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dyeinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMix Genesee42-138
DH5a competent cells NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEBN04475
Dpn1 Enzyme NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents 
EGTAAcros 409910250
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent PromegaE2692Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain GoldBioG-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x NEBB7024A
GeneJET Gel extraction Kit Thermo Scientific K0692Gel Extraction Kit 
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Scientific K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL 
HEK 293T Cells ATCC CRL-11268
HeLa Cells ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Iot RelayDigital LoggersDLI 705020645490AC/DC control relay for illumination
Kanamycin MonosulfateGold BiotechnologyK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1xCorning 10-045-CV 
LB Agar FisherBP1425-2
LED Grow Light SystemHQRP884667106091218LED panel lamp system 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024aSoftware for running CellGEO Scripts
MetamorphMolecular DevicesImaging Analysis Software
MgCl2 Fisher ChemicalM33-500
Mineral OilSigma M5310
MiniPrep Kit Gene Choice 96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 wellBio-Rad4561085
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CV 
Multiband Polychroic Mirror89903BSChroma
NaCl Fisher ChemicalS271-3 
PBS w/o Ca and Mg Corning 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ERK2Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes labForce1149Z650.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps 
Phusion Plus DNA PolymeraseThermo Scientific F630S
pmiRFP670-N1Addgene#79987
Polygon 400 Patterned IlluminatorMightexDSI-G-00C
Primers IDT
PVDF MembranesBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches 
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodiumCorning 25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Fischer BP1332-1 For electrophoresis 
UPlanSApo 40x Microscope ObjectiveOlympus1-U2B828
USB TTL BoxNational Instruments6501For TTL interface
β-MercaptoethanolFisher Chemical O3446I-100

Ссылки

  1. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
  2. Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat Chem Biol. 12 (12), 1059-1064 (2016).
  3. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  4. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  5. Diaz, J. E., et al. A split-Abl kinase for direct activation in cells. Cell Chem Biol. 24 (10), 1250-1258.e4 (2017).
  6. Hongdusit, A., Zwart, P. H., Sankaran, B., Fox, J. M. Minimally disruptive optical control of protein tyrosine phosphatase 1B. Nat Commun. 11 (1), 788(2020).
  7. Wang, J., et al. Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature. 569 (7757), 509-513 (2019).
  8. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  9. Zhou, X. X., Fan, L. Z., Li, P., Shen, K., Lin, M. Z. Optical control of cell signaling by single-chain photoswitchable kinases. Science. 355 (6327), 836-842 (2017).
  10. Shaaya, M., et al. Light-regulated allosteric switch enables temporal and subcellular control of enzyme activity. Elife. 9, e60647(2020).
  11. Chu, P. H., et al. Engineered kinase activation reveals unique morphodynamic phenotypes and associated trafficking for Src family isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12420-12425 (2014).
  12. Kaplan, K. B., Swedlow, J. R., Morgan, D. O., Varmus, H. E. c-Src enhances the spreading of src-/- fibroblasts on fibronectin by a kinase-independent mechanism. Genes Dev. 9 (12), 1505-1517 (1995).
  13. Nihongaki, Y., Suzuki, H., Kawano, F., Sato, M. Genetically engineered photoinducible homodimerization system with improved dimer-forming efficiency. ACS Chem Biol. 9 (3), 617-621 (2014).
  14. Vaidya, A. T., Chen, C. H., Dunlap, J. C., Loros, J. J., Crane, B. R. Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci Signal. 4 (184), ra50(2011).
  15. Zoltowski, B. D., Crane, B. R. Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry. 47 (27), 7012-7019 (2008).
  16. Zoltowski, B. D., et al. Conformational switching in the fungal light sensor vivid. Science. 316 (5827), 1054-1057 (2007).
  17. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  18. Zoltowski, B. D., Vaccaro, B., Crane, B. R. Mechanism-based tuning of a LOV domain photoreceptor. Nat Chem Biol. 5 (11), 827-834 (2009).
  19. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: Design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. 53 (1), 14.13.1-14.13.16 (2011).
  20. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6 (1), 6256(2015).
  21. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Cunningham-Edmondson, A. C., Hanks, S. K. p130Cas substrate domain signaling promotes migration, invasion, and survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 1, 39-52 (2009).
  23. Sachdev, S., Bu, Y., Gelman, I. H. Paxillin-Y118 phosphorylation contributes to the control of Src-induced anchorage-independent growth by FAK and adhesion. BMC Cancer. 9, 12(2009).
  24. Cope, N., et al. Mechanism of BRAF activation through biochemical characterization of the recombinant full-length protein. ChemBioChem. 19 (18), 1988-1997 (2018).
  25. Singhal, A., Li, B. T., O'Reilly, E. M. Targeting KRAS in cancer. Nat Med. 30 (4), 969-983 (2024).
  26. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  27. Kaimachnikov, N. P., Kholodenko, B. N. Toggle switches, pulses and oscillations are intrinsic properties of the Src activation/deactivation cycle. FEBS J. 276 (15), 4102-4118 (2009).
  28. Burack, W. R., Shaw, A. S. Live cell imaging of ERK and MEK. J Biol Chem. 280 (5), 3832-3837 (2005).
  29. Baaske, J., et al. Dual-controlled optogenetic system for the rapid down-regulation of protein levels in mammalian cells. Sci Rep. 8 (1), 15024(2018).
  30. Dagliyan, O., et al. Computational design of chemogenetic and optogenetic split proteins. Nat Commun. 9 (1), 4042(2018).
  31. Harmer, Z. P., et al. Dynamic multiplexed control and modeling of optogenetic systems using the high-throughput optogenetic platform, Lustro. ACS Synth Biol. 13 (5), 1424-1433 (2024).
  32. Liu, Q., Tucker, C. L. Engineering genetically-encoded tools for optogenetic control of protein activity. Curr Opin Chem Biol. 40, 17-23 (2017).
  33. Morikawa, K., et al. Photoactivatable Cre recombinase 3.0 for in vivo mouse applications. Nat Commun. 11 (1), 2141(2020).
  34. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr Opin Chem Biol. 15 (6), 789-797 (2011).
  35. Wu, J., et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 11 (1), 3708(2020).
  36. Conlon, P., Gelin-Licht, R., Ganesan, A., Zhang, J., Levchenko, A. Single-cell dynamics and variability of MAPK activity in a yeast differentiation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), E5896-E5905 (2016).
  37. Jacquel, A., et al. Colony-stimulating factor-1-induced oscillations in phosphatidylinositol-3 kinase/AKT are required for caspase activation in monocytes undergoing differentiation into macrophages. Blood. 114 (17), 3633-3641 (2009).
  38. Kholodenko, B. N. Negative feedback and ultrasensitivity can bring about oscillations in the mitogen-activated protein kinase cascades. Eur J Biochem. 267 (6), 1583-1588 (2000).
  39. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 165-176 (2006).
  40. Li, Y., Roberts, J., Aghdam, Z. A., Hao, N. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) dynamics determine cell fate in the yeast mating response. J Biol Chem. 292 (50), 20354(2017).
  41. Maeda, M., et al. Periodic signaling controlled by an oscillatory circuit that includes protein kinases ERK2 and PKA. Science. 304 (5672), 875-878 (2004).
  42. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  43. Roche, S., Fumagalli, S., Courtneidge, S. A. Requirement for Src family protein tyrosine kinases in G2 for fibroblast cell division. Science. 269 (5230), 1567-1569 (1995).
  44. Klomp, J. E., et al. Mimicking transient activation of protein kinases in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 14976-14981 (2016).
  45. Karginov, A. V., et al. Dissecting motility signaling through activation of specific Src-effector complexes. Nat Chem Biol. 10 (4), 286-290 (2014).
  46. Cary, L. A., Klinghoffer, R. A., Sachsenmaier, C., Cooper, J. A. Src catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol. 22 (8), 2427-2440 (2002).
  47. Fu, P., et al. Sphingolipids signaling in lamellipodia formation and enhancement of endothelial barrier function. Curr Top Membr. 82, 1-31 (2018).
  48. Tian, X., Zhou, B. Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. J Biol Chem. 296, 100509(2021).
  49. Abremski, K., Hoess, R., Sternberg, N. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: Evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32 (4), 1301-1311 (1983).
  50. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259 (3), 1509-1514 (1984).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

LightRsrc

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены