Raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch optogenetische allosterische Regulation

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung einer technisch hergestellten Blue-Light-aktivierten allosterischen Schalterdomäne (LightR) zur reversiblen raumzeitlichen Kontrolle der Proteinaktivität. Unter Verwendung der Src-Tyrosinkinase als Modell bietet diese Studie ein ausgeklügeltes Protokoll zur Entwicklung und Charakterisierung von lichtreguliertem Src (LightR-Src). Es zeigt die Vielseitigkeit dieses Ansatzes über Enzymklassen hinweg.

Zusammenfassung

Die Optogenetik bietet das Potenzial, eine komplexe raumzeitliche Steuerung der Enzymaktivität bis hin zu einer subzellulären Auflösung nachzuahmen. Die meisten optogenetischen Ansätze stehen jedoch oft vor erheblichen Herausforderungen, wenn es darum geht, mehrere Fähigkeiten in einem einzigen Werkzeug zu integrieren, das auf eine Vielzahl von Zielproteinen anwendbar ist. Die präzise Kontrolle der EIN/AUS-Kinetik, die Gewährleistung minimaler Leckagen im Dunkeln und der Nachweis einer effizienten Leistung in Säugetierzellen mit subzellulärer Präzision sind einige der häufigsten Herausforderungen in diesem Bereich. Eine vielversprechende Lösung liegt in der Anwendung von rational gestalteten lichtempfindlichen Domänen zur allosterischen Kontrolle der Proteinaktivität. Mit dieser Strategie haben wir eine optogenetische Methode entwickelt, die alle gewünschten Merkmale kombiniert. Der Ansatz beinhaltet den Einbau des lichtregulierten allosterischen Schaltmoduls (LightR) in das Zielprotein, um die Enzymaktivität mit blauem (465 nm) Licht zu regulieren. Die LightR-Domäne wird durch die Verknüpfung von zwei Vivid-Photorezeptordomänen (VVD) erzeugt, wodurch eine lichtempfindliche Klemme entsteht, die in eine kleine flexible Schleife innerhalb der katalytischen Domäne eines Enzyms eingebaut werden kann. Im dunklen Zustand ist die LightR-Klemme offen, wodurch die katalytische Domäne des Enzyms verzerrt und inaktiviert wird. Bei Einwirkung von blauem Licht schließt sich die LightR-Domäne und stellt die Struktur und Enzymaktivität der katalytischen Domäne wieder her. In diesem Manuskript diskutieren wir Designstrategien zur Erzeugung einer lichtregulierten Proteinkinase und demonstrieren ihre Kontrolle durch blaues Licht, Reversibilität, Kinetik und präzise Regulation auf subzellulärer Ebene, was eine enge räumlich-zeitliche Präzision ermöglicht. Unter Verwendung der Src-Tyrosinkinase als Modell präsentieren wir ein Protokoll zur effektiven Regulierung der LightR-Src-Kinase-Aktivität. Wir demonstrieren auch die Anwendbarkeit von LightR über verschiedene Enzymklassen hinweg, was den Nutzen des Werkzeugsystems bei der Beantwortung mechanistischer Fragen der Signalwege bei verschiedenen Krankheiten erweitert.

Einleitung

Die Fähigkeit der Zelle, externe Signale zu interpretieren und sie in physiologischen oder pathologischen Kontexten in spezifische Reaktionen umzuwandeln, wird durch spezielle Gruppen von Proteinen gesteuert. Der Beitrag eines Proteins zu solch komplexen Reaktionen wird oft durch seine subzelluläre Lokalisation, das Expressionsniveau und den Zeitpunkt der vorübergehenden, anhaltenden oder oszillatorischen Aktivierung definiert. Um die Rolle dieser einzelnen Parameter bei der Regulation der Signalübertragung zu untersuchen, sind Methoden erforderlich, die in der Lage sind, eine komplexe raumzeitliche Kontrolle der Proteinaktivität auf ....

Protokoll

1. Design und Entwicklung von LightR ( Abbildung 1)

1. Strategische Planung
   HINWEIS: Die LightR-Domäne besteht aus zwei tandemartig verbundenen Vivid (VVD) Photorezeptordomänen von Neurospora crassa^13,14,15,16. VVDs homodimerisieren in Gegenwart von Licht, und eine solche Dimerisierung beinhaltet eine Konformationsänderung, die den N-Terminus eines VVD-Monomers neben den C-Terminus eines anderen VVD-Monomers bringt (

Diskussion

Unsere Studie stellt einen optogenetischen Ansatz zur Untersuchung verschiedener Signalwege vor und zeigt seine breite Anwendbarkeit bei der Beantwortung verschiedener biologischer Fragestellungen. Das LightR-Werkzeugsystem bietet mehrere wesentliche Vorteile: (1) Allosterische Regulation der Proteinaktivität, (2) Enge zeitliche Kontrolle der Aktivität, die abgestimmt werden kann, um unterschiedliche Kinetiken der Aktivierung und Inaktivierung zu erreichen, (3) Räumliche Auflösung de.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100