Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Özet

Bu protokol, protein aktivitesinin tersinir uzay-zamansal kontrolü için tasarlanmış bir mavi ışıkla aktive edilen allosterik anahtar (LightR) alanının uygulamasını açıklar. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanan bu çalışma, ışık regüle edilmiş Src'yi (LightR-Src) geliştirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşımın enzim sınıfları arasında çok yönlülüğünü göstermektedir.

Özet

Optogenetik, enzim aktivitesinin karmaşık uzay-zamansal kontrolünü hücre altı çözünürlüğe kadar taklit etme potansiyeli sunar. Bununla birlikte, çoğu optogenetik yaklaşım, çok çeşitli hedef proteinlere uygulanabilen tek bir araçta birden fazla yeteneği entegre etmede genellikle önemli zorluklarla karşı karşıyadır. AÇMA/KAPAMA kinetiği üzerinde hassas kontrol sağlamak, karanlıkta minimum sızıntı sağlamak ve memeli hücrelerinde hücre altı hassasiyetle verimli performans göstermek, bu alanda karşılaşılan en yaygın zorluklardan bazılarıdır. Umut verici bir çözüm, protein aktivitesini allosterik olarak kontrol etmek için rasyonel olarak tasarlanmış ışığa duyarlı alanların uygulanmasında yatmaktadır. Bu stratejiyi kullanarak, istenen tüm özellikleri birleştiren bir optogenetik yöntem oluşturduk. Yaklaşım, mavi (465 nm) ışık kullanarak enzim aktivitesini düzenlemek için Işık tarafından düzenlenen allosterik anahtar modülünün (LightR) hedef proteine dahil edilmesini içerir. LightR alanı, iki Canlı (VVD) fotoreseptör alanının birbirine bağlanmasıyla oluşturulur ve bir enzimin katalitik alanı içinde küçük esnek bir döngüye dahil edilebilen ışığa duyarlı bir kelepçe oluşturur. Karanlık durumda, LightR kelepçesi açıktır, böylece enzimin katalitik alanını bozar ve onu etkisiz hale getirir. Mavi ışığa maruz kaldığında, LightR alanı kapanır ve katalitik alanın yapısını ve enzim aktivitesini geri yükler. Bu el yazmasında, ışıkla regüle edilmiş bir protein kinaz oluşturmak için tasarım stratejilerini tartışıyoruz ve bunun mavi ışık, tersinirlik, kinetik ve subselüler düzeyde hassas regülasyon ile kontrolünü göstererek, sıkı uzay-zamansal hassasiyet sağlıyoruz. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanarak, LightR-Src kinaz aktivitesini etkin bir şekilde düzenlemek için bir protokol sergiliyoruz. Ayrıca, LightR'ın farklı enzim sınıfları arasında uygulanabilirliğini göstererek, farklı hastalıklardaki sinyal yollarının mekanik sorularını ele almada araç sisteminin faydasını genişletiyoruz.

Giriş

Hücrenin dış sinyalleri yorumlama ve bunları fizyolojik veya patolojik bağlamlarda belirli tepkilere dönüştürme yeteneği, özel protein grupları tarafından yönlendirilir. Herhangi bir proteinin bu tür karmaşık tepkilere katkısı genellikle hücre altı konumu, ekspresyon seviyesi ve geçici, sürekli veya salınımlı aktivasyonun zamanlaması ile tanımlanır. Sinyalleşmenin düzenlenmesinde bu bireysel parametrelerin rolünün incelenmesi, hücre altı düzeyde protein aktivitesinin karmaşık uzay-zamansal kontrolünü kopyalayabilen yöntemler gerektirir. Genetik manipülasyon ve küçük molekül inhibitörleri gibi geleneksel teknikler bu konuda yetersiz ka....

Protokol

1. LightR'nin tasarımı ve geliştirilmesi (Şekil 1)

1. Stratejik planlama
   NOT: LightR alanı, Neurospora crassa'dan iki tandem bağlantılı Vivid (VVD) fotoreseptör alanından oluşur^13,14,15,16. VVD'ler ışık varlığında homodimerize olur ve bu tür bir dimerizasyon, bir VVD monomerinin N-terminalini başka bir VVD monomerinin C-terminalinin yanına getiren konformasyonel bir değişikliği içerir (Şekil 1A). İki VVD....

Tartışmalar

Çalışmamız, çeşitli sinyal yollarının araştırılması için optogenetik bir yaklaşım sunmakta ve farklı biyolojik soruların ele alınmasında geniş uygulanabilirliğini göstermektedir. LightR araç sistemi birkaç önemli avantaj sağlar: (1) Protein aktivitesinin allosterik regülasyonu, (2) Farklı aktivasyon ve inaktivasyon kinetiği elde etmek için ayarlanabilen aktivitenin sıkı zamansal kontrolü, (3) Subselüler düzeyde aktivitenin uzamsal çözünürlüğü, (4.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100