JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, protein aktivitesinin tersinir uzay-zamansal kontrolü için tasarlanmış bir mavi ışıkla aktive edilen allosterik anahtar (LightR) alanının uygulamasını açıklar. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanan bu çalışma, ışık regüle edilmiş Src'yi (LightR-Src) geliştirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşımın enzim sınıfları arasında çok yönlülüğünü göstermektedir.

Özet

Optogenetik, enzim aktivitesinin karmaşık uzay-zamansal kontrolünü hücre altı çözünürlüğe kadar taklit etme potansiyeli sunar. Bununla birlikte, çoğu optogenetik yaklaşım, çok çeşitli hedef proteinlere uygulanabilen tek bir araçta birden fazla yeteneği entegre etmede genellikle önemli zorluklarla karşı karşıyadır. AÇMA/KAPAMA kinetiği üzerinde hassas kontrol sağlamak, karanlıkta minimum sızıntı sağlamak ve memeli hücrelerinde hücre altı hassasiyetle verimli performans göstermek, bu alanda karşılaşılan en yaygın zorluklardan bazılarıdır. Umut verici bir çözüm, protein aktivitesini allosterik olarak kontrol etmek için rasyonel olarak tasarlanmış ışığa duyarlı alanların uygulanmasında yatmaktadır. Bu stratejiyi kullanarak, istenen tüm özellikleri birleştiren bir optogenetik yöntem oluşturduk. Yaklaşım, mavi (465 nm) ışık kullanarak enzim aktivitesini düzenlemek için Işık tarafından düzenlenen allosterik anahtar modülünün (LightR) hedef proteine dahil edilmesini içerir. LightR alanı, iki Canlı (VVD) fotoreseptör alanının birbirine bağlanmasıyla oluşturulur ve bir enzimin katalitik alanı içinde küçük esnek bir döngüye dahil edilebilen ışığa duyarlı bir kelepçe oluşturur. Karanlık durumda, LightR kelepçesi açıktır, böylece enzimin katalitik alanını bozar ve onu etkisiz hale getirir. Mavi ışığa maruz kaldığında, LightR alanı kapanır ve katalitik alanın yapısını ve enzim aktivitesini geri yükler. Bu el yazmasında, ışıkla regüle edilmiş bir protein kinaz oluşturmak için tasarım stratejilerini tartışıyoruz ve bunun mavi ışık, tersinirlik, kinetik ve subselüler düzeyde hassas regülasyon ile kontrolünü göstererek, sıkı uzay-zamansal hassasiyet sağlıyoruz. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanarak, LightR-Src kinaz aktivitesini etkin bir şekilde düzenlemek için bir protokol sergiliyoruz. Ayrıca, LightR'ın farklı enzim sınıfları arasında uygulanabilirliğini göstererek, farklı hastalıklardaki sinyal yollarının mekanik sorularını ele almada araç sisteminin faydasını genişletiyoruz.

Giriş

Hücrenin dış sinyalleri yorumlama ve bunları fizyolojik veya patolojik bağlamlarda belirli tepkilere dönüştürme yeteneği, özel protein grupları tarafından yönlendirilir. Herhangi bir proteinin bu tür karmaşık tepkilere katkısı genellikle hücre altı konumu, ekspresyon seviyesi ve geçici, sürekli veya salınımlı aktivasyonun zamanlaması ile tanımlanır. Sinyalleşmenin düzenlenmesinde bu bireysel parametrelerin rolünün incelenmesi, hücre altı düzeyde protein aktivitesinin karmaşık uzay-zamansal kontrolünü kopyalayabilen yöntemler gerektirir. Genetik manipülasyon ve küçük molekül inhibitörleri gibi geleneksel teknikler bu konuda yetersiz kalmaktadır. Buna karşılık, optogenetik teknikler, fizyolojik ve patolojik süreçleri manipüle ederek veya taklit ederek biyolojik süreçlerin diseksiyonu potansiyelini vaat etmektedir. Bununla birlikte, mevcut araçlar genellikle geniş uygulanabilirlikten veya hücre altı kontrolden yoksundur. Mevcut birkaç strateji, protein lokalizasyonunun ve etkileşimlerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesini sağlar; ancak enzimatik aktivite üzerinde doğrudan kontrol eksikliğivardır 1,2,3,4. Diğerleri enzimatik aktivitenin düzenlenmesini sağlar, ancak hücre altı kontrolden yoksun olabilir veya farklı enzim sınıfları 5,6,7,8,9 arasında sınırlı uygulanabilirliğe sahip olabilir. Bu protokol belgesinde, optogenetiğin avantajlarını tek bir araçta birleştiren yeni bir protein mühendisliği yöntemini açıklıyoruz: sıkı zamansal düzenleme, ayarlanabilir kinetik, hücre altı kontrol ve geniş enzim uygulanabilirliği10. İlgilenilen hedef proteine yerleştirildiğinde allosterik bir anahtar olarak işlev gören Işık ayarlı (LightR) bir alan tasarladık. Bu strateji, canlı hücrelerde ilgilenilen bir proteinin aktivasyonunun ve deaktivasyonunun sıkı uzay-zamansal kontrolünü sağlar.

Burada, çeşitli enzim sınıflarında LightR optogenetik aracının tasarımı ve uygulama stratejisi tartışılmaktadır. Bu çalışma, ışık regüle tirozin kinaz Src'nin (LightR-Src) geliştirilmesi, karakterizasyonu ve uygulanması için adım adım bir protokol sunmaktadır. Çalışma ayrıca LightR anahtarı inaktivasyon kinetiğinin ayarlanabilirliğini göstermektedir. Yavaş inaktive eden LightR anahtarı, düşük aydınlatma frekansı ile enzim aktivitesini koruyabilirken, hızlı döngülü versiyon FastLightR, aktivasyon için daha sık aydınlatma gerektirir ancak aydınlatma kapatıldığında hızlı inaktivasyon gösterir. FastLightR-Src'nin canlı hücrelerde aktivasyonu/inaktivasyonu, hücre yayılma ve geri çekilme döngülerini indükler. FastLightR-Src ile indüklenen hücre yayılımı, Src kinaz 11,12'nin fizyolojik rolü ile uyumludur. Hızlı inaktivasyon kinetiği nedeniyle, FastLightR-Src hücre altı düzeyde de düzenlenebilir, bu da lokal çıkıntıların uyarılmasına ve hücre polarizasyonuna neden olur. LightR aracının diğer enzim türlerine uygulanabilirliğini göstermek için, okuyuculara tasarlanmış ışık regüle kinaz bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) ve bölgeye özgü bir DNA rekombinaz Cre (LightR-Cre) ile benzer başarıyı kısaca gösteriyoruz. Genel olarak, bu yaklaşım, çeşitli hastalıkların patofizyolojisini şekillendiren karmaşık sinyal yolakları hakkındaki anlayışımızı geliştirme potansiyeline sahiptir.

Protokol

1. LightR'nin tasarımı ve geliştirilmesi (Şekil 1)

  1. Stratejik planlama
    NOT: LightR alanı, Neurospora crassa'dan iki tandem bağlantılı Vivid (VVD) fotoreseptör alanından oluşur13,14,15,16. VVD'ler ışık varlığında homodimerize olur ve bu tür bir dimerizasyon, bir VVD monomerinin N-terminalini başka bir VVD monomerinin C-terminalinin yanına getiren konformasyonel bir değişikliği içerir (Şekil 1A). İki VVD alanını esnek bir bağlayıcı ile bağlamak, karanlıkta açılacak ve mavi ışıkla aydınlatıldığında kapanacak kelepçe benzeri bir alan oluşturur. Bu kelepçeyi bir enzimin katalitik alanına entegre etmek, aktivitenin ışık aracılı düzenlenmesini sağlar. Karanlıkta, açık kelepçe alanı bozarak enzimi devre dışı bırakır; Mavi ışıkla aydınlatma, kelepçenin kapanmasına neden olarak enzimin aktivitesini geri yükler (Şekil 1B). Bu kavram, protein kinazlar ve DNA rekombinazları dahil olmak üzere çeşitli ailelerden enzimlere uygulanabilir10 (Şekil 1C).
    1. LightR'ın Tasarımı
      1. İki VVD molekülünü bağlamak için, her monomer arasında esnek bir 22 amino asit bağlayıcı (GGS)4G(GGS)3 kullanın.
        NOT: Bağlayıcı, VVD monomerlerinin ilişkilendirilmesini ve ayrışmasını sağlamak için yeterli esneklik ve uzunluk sağlar.
      2. GPGGSGG ve GSGGPG bağlayıcılarını sırasıyla LightR etki alanının N ve C terminallerine ekleyin.
        NOT: Bağlayıcıların uzunluğunun ve bileşiminin belirli bir protein için ayarlanması gerekebilir. Daha kısa GSG ve tek Gly bağlayıcılar, daha sıkı düzenleme gerektiğinde rutin olarak kullanılır. Yerleştirme döngüsünün boyutu ve katalitik kalıntılara yakınlığı da dinamik düzenleme aralığını etkileyecektir. Daha kısa döngülerin katalitik aktivitenin daha sıkı düzenlenmesini sağlama olasılığı daha yüksektir, ancak aydınlatmadan sonra daha düşük aktiviteye neden olabilir. LightR etki alanının sırası Ek Tablo 1'de verilmiştir.
    2. LightR'ın Eklenmesi
      NOT: Uygun bir LightR yerleştirme bölgesi, etkileşimlerini sterik olarak engellemeden veya biyolojik rolünü etkileyecek geri dönüşü olmayan yapısal değişikliklere neden olmadan hedeflenen alan işlevinin sıkı bir şekilde düzenlenmesini sağlayacaktır. Hedef proteinin kristal yapısı, LightR'nin eklenmesi için bu tür esnek döngü bölgelerinin tanımlanmasında ideal bir kılavuzdur. Gerekirse, yakın bir homologun kristal yapısı yeterli olabilir. Dikkate alınması gereken bazı genel kriterler aşağıda verilmiştir.
      1. Yerleştirme döngüsünün, enzimin kritik katalitik elemanlarına yapısal olarak bağlı olduğundan emin olun. Seçilen ekleme döngüsünün protein için mevcut bir bağlanma bölgesi olmadığından ve LightR'nin eklenmesinin sterik etkiler nedeniyle herhangi bir fonksiyonel etkileşimi potansiyel olarak bozmadığından emin olun.
      2. İlk strateji olarak, LightR'yi yerleştirirken yerleştirme döngüsündeki bir amino asidi değiştirin. Çözücüye maruz kalan ve molekül içi etkileşimlerde yer almayan polar veya küçük bir amino asit (örneğin, Glu, Arg, Lys, Gly) içeren yerleştirme döngüsünün ortasını hedefleyin.
        NOT: Bir amino asit replasmanı fonksiyonel bir proteinle sonuçlanmadığında, LightR yapısının optimizasyonu, birden fazla amino asidin veya tüm ekleme döngüsünün değiştirilmesini gerektirecektir. Tanımlanan döngü içinde LightR için birden çok ekleme sitesinin işlevselliğini değerlendirin.
      3. Hedef enzimin endojen regülasyondan bağımsız olarak çalıştığından emin olun. Bunu, yerleştirme şablonu için enzimin yapısal olarak aktif bir mutant versiyonunu kullanarak başarın.
        NOT: Vahşi tip enzimler, LightR yapıları oluşturmak için de kullanılabilir, ancak bu, endojen mekanizmalar ve ışık tarafından düzenlenecek bir AND kapılı sistemle sonuçlanabilir.
      4. Pozitif ve negatif kontroller, LightR enzim aktivite analizi için hayati önem taşır. Endojen proteinlerin yapısal olarak aktif mutantlarını pozitif kontroller olarak ve hedeflenen LightR enziminin katalitik olarak aktif olmayan mutant versiyonlarını negatif kontroller olarak kullanın.
        NOT: İnaktive edici mutasyonları seçerken, LightR enzimi katlanmasının geri dönüşümsüzlüğünü bozmamak için mutasyonun LightR yerleştirme bölgesinden yeterince aralıklı olduğundan emin olmak çok önemlidir. Yukarıdaki kriterlere dayanarak, Src kinazdaki LightR yerleştirme bölgesi, bir beta-iplik aracılığıyla ATP bağlayıcı G-döngüsü/glisin açısından zengin döngü bölgesindeki yüksek oranda korunmuş GXGXXG motifine yapısal olarak bağlanan esnek bir döngü bölgesinde seçilir. Daha da önemlisi, ATP bağlanma cebinden ve substrat bağlama bölgesinden10,17 uzağa konumlandırılmıştır (Şekil 1C (i)).
        NOT: Kinazlar arasındaki yapısal homoloji nedeniyle, bRaf'taki LightR yerleştirme bölgesi, Src'deki yerleştirme bölgesi ile aynı yapısal döngüde seçilir (Şekil 1C (ii)).
        NOT: Bölüm 1.1.2.'de belirtilen ilkelere dayanarak, kinaz olmayan Cre rekombinaz içindeki LightR yerleştirme bölgesi, katalitik çekirdekten, yani DNA bağlanma bölgesinden uzaktaki esnek döngülerden birinde seçilir. Bununla birlikte, ekleme döngüsü, LightR-Cre işlevselliğinin başarısını sağlamak için bir α-sarmal aracılığıyla DNA bağlanma alanı içindeki kritik katalitik kalıntılara hala yapısal olarak bağlanmıştır (Şekil 1C (iii)). Mevcut protokolde tarif edilen farklı enzimler için pozitif ve negatif kontrollere sahip tüm yerleştirme bölgeleri Ek Tablo 2'de detaylandırılmıştır.
    3. FastLightR'ın Geliştirilmesi.
      NOT: LightR'de her iki VVD'ye I85V mutasyonunun eklenmesi, mutantın karanlık duruma hızlı dönüşümüneatfedilen daha hızlı bir aktivasyon-inaktivasyon dinamiği sağlar 18,19. Hızlı inaktivasyon kinetiğine sahip FastLightR-Src ve FastLightR-bRaf nesli, aktivasyon ve inaktivasyonun sıkı zamansal kontrolünü sağlar. Canlı hücrelerde LightR-Src'nin hücre altı regülasyonunun sağlanmasına izin verir.
      NOT: Cre rekombinaz aktivitesi geri dönüşümsüz DNA rekombinasyonuna neden olur; bu nedenle, LightR'nin tersinirlik özellikleri geçerli değildir.
      NOT: LightR yapısının tespitini basitleştirmek için, hedef proteinin N veya C terminaline bir floresan proteini veya başka herhangi bir uygun etiket eklenebilir. Bu çalışmada LightR-Src için mCherry-myc, LightR-bRaf için Venüs ve LightR-Cre rekombinaz için miRFP670 kullanılmıştır.
  2. Klonlama Stratejisi
    NOT: Klonlama yaklaşımı, geleneksel yaklaşımlardan farklı olarak, belirli kısıtlama bölgelerine dayanmayan, bölgeye yönelik mutajeneze dayanmaktadır10,20.
    1. Bir "Megaprimer" Üretimi
      1. Memeli hücrelerinde mantar kökenli iki tandem VVD DNA dizisinin kararlı ekspresyonunu sağlamak ve PCR kullanarak hatasız klonlama için dizileri mümkün olduğunca farklı hale getirmek için LightR genlerini kodon-optimize eder. Kodon optimizasyonunu gerçekleştirmek için 1.2.1.2-1.2.1.3 adımlarını izleyin.
      2. LightR'nin teorik dizi haritasını oluşturmak için VVD'lerin amino asit dizisini ve seçilen bağlayıcıları yan yana hizalayın.
      3. Diziyi, minimum karmaşıklıkla en iyi dizi seçeneğini belirlemek için kodon optimizasyonu için gelişmiş bir algoritma kullanan herhangi bir çevrimiçi kodon optimizasyon platformuna yapıştırın. Hedef organizmanın seçildiğinden, okuma çerçevesinin korunduğundan ve optimizasyon için VVD dizilerinin seçildiğinden emin olun.
      4. LightR DNA'sını özel sentezlenmiş bir parça olarak ( Bkz. Ek Tablo 1) veya daha önce yayınlanmış bir LightR yapısından10 elde edin.
      5. Şekil 1D'de özetlenen daha önce açıklanan20 stratejiyi kullanarak "Megaprimer" oluşturmak için LightR genini çoğaltın. LightR "Megaprimer"ı, üreticinin spesifik DNA polimeraz için tavsiyelerini izleyerek ve aşağıdaki PCR reaksiyon karışımını kullanarak PCR yoluyla sentezleyin:
        5x DNA Polimeraz uyumlu tampon: 10 μL
        100 μM İleri megaprimer: 0,5 μL
        100 μM Ters megaprimer: 0,5 μL
        10 nM dNTP karışımı: 2 μL
        DNA polimeraz (2000 birim/mL): 1 μl (0,02 U/μL)
        50 ng Şablon DNA: 1 μL
        PCR sınıfı su: 35 μL
        NOT: Burada, üniversal primer tavlama sıcaklıklarına sahip yüksek kaliteli, sıcak başlangıçlı DNA polimeraz kullanılmıştır.
      6. Elde edilen megaprimeri agaroz jel elektroforezi ile ayırın. Ürün yaklaşık 1000 nükleotid uzunluğunda olacaktır. Megaastarı agaroz jelden çıkarın ve üreticinin tavsiyelerine uyarak veya benzer bir teknik kullanarak bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın.
    2. Bölgeye yönelik mutajenez kullanılarak LightR geninin eklenmesi: İstenen bir amino asidi veya bir amino asit uzunluğunu değiştirerek LightR'yi yerleştirin. Şablon plazmidi, LightR etki alanının eklendiği yer olacaktır. Aşağıdaki karışımı kullanarak daha önce20 tarif edildiği gibi PCR reaksiyonu gerçekleştirin.
      5x DNA Polimeraz uyumlu tampon: 5 μL
      10 nM dNTP karışımı: 1 μL
      DNA polimeraz (2000 birim/mL): 1 μL (0,02 U/μL)
      50 ng Hedef Şablon DNA'sı: 1 μL
      Ekstrakte edilen Megaprimer (hesaplanan kütle): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      PCR sınıfı su: 2,5 μL
      NOT: Megaprimer kütlesi (ng) = istenen kesici uç/vektör molar oranı x vektör kütlesi x kesici ucun vektör uzunluklarına oranı. Kullanılan istenen kesici uç/vektör molar oranı 3/1'dir.
    3. PCR reaksiyonunun tamamlanmasından sonra, sadece fazla ve metillenmiş DNA'yı seçici olarak sindirmek için 1 μL DpnI (2000 birim / mL) enzimi ekleyin ve karışımı 37 ° C'de 1-1.5 saat inkübe edin. Bu, değiştirilmiş yapının verimini önemli ölçüde artıracaktır.
    4. PCR reaksiyonunun 1-2 μL'sini üretici protokollerini izleyerek DH5α yetkin hücrelere dönüştürün.
    5. Luria Broth (LB)-agar plakası üzerindeki plaka, seçim için uygun antibiyotik ile bakterileri dönüştürdü. Plakayı gece boyunca 37 °C'de veya oda sıcaklığında (RT; 25-30 °C) 72 saat inkübe edin.
      NOT: Üzerinde koloniler yetiştirilen LB plakaları 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir ve protokol duraklatılabilir.
    6. Koloni ekranı PCR
      1. PCR tabanlı koloni taraması için, LightR ekinde tavlanan ve yaklaşık 400-700 bp fragmanı oluşturmak için DNA'yı hedefleyen primerler tasarlayın.
      2. LB plakasından aşağıda verilen PCR karışımına az miktarda koloni ekleyin ve spesifik DNA polimeraz için üreticinin tavsiyelerine göre termosiklasyona devam edin.
        2x Taq RED Master Karışımı: 5 μL
        PCR sınıfı su : 5 μL
        100 μM İleri astar : 0.5 μL
        100 μM Ters astar: 0,5 μL
      3. Agaroz jel elektroforezi ile pozitif kolonileri kontrol edin.
      4. İstenen PCR ürün boyutunu oluşturan kolonileri seçin ve bunları plazmid omurgasındaki antibiyotik direncine uygun olarak antibiyotikle birlikte 3 mL LB suyuna ayrı ayrı aşılayın. Daha sonra inkübe edin ve gece boyunca 37 °C'de çalkalayın.
      5. Plazmit DNA ekstraksiyonu için plazmit saflaştırma kitinin üreticisinin talimatlarını izleyerek sıvı kültürden plazmit DNA'yı çıkarın ve dizileme ile ekin varlığını doğrulayın.
        NOT: Klonlama primerleri Ek Tablo 3'te özetlenmiştir.

2. Hücre kaplaması ve LightR enzim aktivitesinin biyokimyasal analizi (Şekil 2A)

  1. LightR-kinazların (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf) biyokimyasal analizi için, her deney grubu için 3,5 cm hücre kültürü kabı başına 1 x 106 LinXE hücresi yerleştirin. Ek Tablo 4'e bakın.
  2. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 16-18 saat inkübe edin.
  3. Ertesi gün, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak, seçilen DNA yapısına sahip hücreleri transfekte edin (Ek Tablo 4).
    NOT: Optimal transfeksiyon reaktifi, kullanılan hücrelerin yapısına, vektörüne ve tipine bağlı olacaktır. Bu çalışmada, bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak 3,5 cm'lik bir tabakta 2 μg DNA kullanılmıştır. Optimal transfeksiyon reaktifini belirlemek için ampirik test yapılmalıdır. Transfekte edilmiş yapılar mavi ışıkla düzenlenen proteinleri eksprese edeceğinden, transfekte edilmiş hücreleri işleyen sonraki tüm adımlar kırmızı ışık altında gerçekleştirilmelidir. Yanlışlıkla aydınlatmayı önlemek için inkübatöre yerleştirmeden önce plakaları transfekte edilmiş hücrelerle alüminyum folyo ile sarın.
  4. 16-18 saat transfeksiyondan sonra hücreleri mavi ışığamaruz bırakın 10. Bunu gerçekleştirmek için, doku kültürü inkübatörüne 465 nm ışık yayan diyot (LED) panel lamba sistemi yerleştirin. İstenilen 3 mW/cm2 aydınlatmayı elde etmek için lambanın 10 cm yukarısına delikli bir pleksiglas panel yerleştirin (Ek Dosya 1). İnkübatörde kesintisiz hava sirkülasyonu sağlamak için delikli bir panele ihtiyaç vardır. Hücreleri istenen süre boyunca aydınlatın.
  5. LightR-Src ve LightR-bRaf'ın etkinleştirilmesi için sürekli aydınlatma kullanın. Sürekli aydınlatma için LED paneli manuel olarak açıp kapatın.
  6. FastLightR Src'nin etkinleştirme/devre dışı bırakma döngüsünü sürdürmek için, manuel olarak veya bir mikro denetleyici tarafından kontrol edilen AÇMA/KAPAMA döngülerini kullanın.
    NOT: Gerekli kodu yazmak ve yüklemek için bir Entegre Geliştirme Ortamı (IDE) sağlayan çeşitli yazılım araç setleri kullanılabilir. Bu araç kitleri, C/C++ programlamayı destekler ve darbeli aydınlatmayı kontrol etmek için gerekli olan genel amaçlı giriş/çıkış (GPIO) erişimi sunar. Bu amaçlar için kullanılan protokollerin ve kodun ayrıntılı bir açıklaması Ek Dosya 1'de açıklanmıştır.
  7. Deneyin ilgili zaman noktalarının sonunda (Ek Tablo 4), hücreleri güvenli kırmızı ışıklar altında hasat edin. Ortamı aspire edin ve hücreleri soğuk PBS ile yıkayın.
  8. Proteini izole etmek için, hücreleri %5 v/v 2-Merkaptoetanol ile desteklenmiş 500 μL 2x Laemmli numune tamponu ile parçalayın. Lizatı 100 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Protein jel elektroforezi ve Western blotting ile hücre lizatlarını analiz edin21.
    NOT: 2x Laemmli tamponunun bileşimi aşağıdaki gibidir: 500 mL için: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL gliserol, 52.5 mL %20 SDS, 0.5 g bromofenol mavisi, nihai pH 6.8.
  9. Tyr249 22,23 üzerindeki endojen p130ca'ların ve TyrY118 22,23'teki paxillin'in fosforilasyon seviyesini değerlendirerek LightR-Src aktivitesini değerlendirin. Ser1/217'de MEK221'in ve TyrY1/202'te ERK202/204'in fosforilasyon seviyesini değerlendirerek LightR-bRaf aktivitesini değerlendirin24,25.

3. LightR-Cre aktivitesinin fonksiyonel analizi

  1. LightR-Cre aktivitesinin fonksiyonel analizi için, 3,5 cm'lik hücre kültürü kabı başına 1 x 106 LinXE hücresi ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 16-18 saat inkübe edin.
  2. Bölüm 2, Şekil 2A ve Ek Tablo 5'te belirtilen protokolü izleyerek hücreleri transfekte edin. 1:9 oranında LightR-Cre-iRFP670 ve bir Reporter plazmid Floxed-STOP-mCherry2 ile toplam 2 μg DNA'yı birlikte transfekte edin.
  3. Transfeksiyondan 16-18 saat sonra hücreleri aydınlatın. Verimli bir LightR-Cre aktivasyonu için uzun süreli aydınlatma gerekir. Bu nedenle, fototoksisiteyi önlemek için, bölüm 8 ve Ek Dosya 2'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir mikrodenetleyici tarafından kontrol edilen 20 nm LED panel lamba sistemi kullanarak 2 s AÇIK ve 2 s KAPALI döngüleri ile 1 saat boyunca darbeli aydınlatma kullanın.
  4. 20x hava objektifi ile epifloresan mikroskobu kullanarak görüntüleme yapın. LightR-Cre-iRFP670'in görselleştirilmesi için Cy5 filtre setini kullanın ve Floxed-mCherry ifadesinden mCherry'nin görselleştirilmesi için RFP filtre setini kullanın.
    NOT: Görüntüleme için, Cy5/RFP ışık küpleri ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanılır.

4. Canlı hücre görüntüleme için numunelerin hazırlanması

  1. Plaka 2 x 10 Hücre kültürü ortamında 35 mm doku kültürü kabı başına5 HeLa hücresi ve 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 2 saat inkübe edin.
  2. Hücreler bağlandıktan ve birleşme yaklaşık% 60 -% 70 olduğunda, HeLa hücrelerini aşağıdaki karışımlardan biriyle birlikte geçirin: (i) 0.85 μg FastLightR-Src-mCherry-myc / 0.15 μg Stargazin-iRFP veya (ii) 0.75 μg FastLightR-bRaf-Venüs / 0.25 μg mCherry-ERK2
    NOT: FastLightR-Src deneylerinde, Stargazin-iRFP, hücre yayılma analizi için plazma zarını etiketlemek için kullanılır. Daha yüksek FastLightR-Src ifadesi isteniyorsa, stargazin-iRFP atlanabilir ve bunun yerine 1 μg FastLightR-Src kullanılabilir. Bu durumlarda, hücreleri görselleştirmek için bir zar boyası kullanılmalıdır. Plazma zarı lekeleri, hücre zarlarını etiketlemek için rutin olarak kullanılır.
  3. Hücrelerin yanlışlıkla yanmasını önlemek için çanağı alüminyum folyo ile örtün ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 16-18 saat inkübe edin.
  4. Yapıların yanlışlıkla etkinleştirilmesini önlemek için aşağıdaki tüm adımları kırmızı ışık aydınlatması altında tamamlayın. Beyaz ışığa maruz kalmak, LightR-kinazların aktivasyonunu indükler ve sonraki sonuçları etkileyebilir.
  5. Aynı gün, 3 yuvarlak cam lamel (25 mm çap, 0,17 mm kalınlık) gece boyunca 37 ° C'de PBS'de 5 mg / L fibronektin ile kaplayın.
  6. Lamelleri transfeksiyondan 16-18 saat sonra PBS ile durulayın ve her bir lamel üzerine ~ 105 transfekte edilmiş HeLa hücrelerini plakalayın. Hücre kültürü ortamında 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 2 saat inkübe edin.
    NOT: Düşük tohumlama yoğunluğu, görüş alanındaki hücrelerin birbirine değmemesini sağlamak için gereklidir.
  7. FBS'yi Levobitz'in L-15 görüntüleme ortamına %5'lik bir nihai konsantrasyona ekleyerek görüntüleme ortamını hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden süzün ve 37 °C'ye ısıtın.
  8. Mineral yağı 37 °C'ye ısıtın.
  9. Hücreleri içeren lamelleri PBS ile iki kez yıkayın. Membran boyası kullanıyorsanız, lamelleri yıkamadan önce üreticinin talimatlarına göre hücreleri boyayın.
  10. Lameli dikkatlice canlı bir hücre görüntüleme odasına yerleştirin. Hazneye 1 mL L-15 görüntüleme ortamı ekleyin.
  11. Görüntüleme işlemi sırasında buharlaşmayı önlemek için ortamın üzerine 1 mL mineral yağ ekleyin.
  12. Görüntüye hazır olana kadar hazneyi 37 °C'de ışıktan koruyun.

5. FastLightR-Src'nin küresel aktivasyonu ve görüntülenmesi (Şekil 3)

  1. Mikroskop kondansatörüne mavi bir LED mikroskop halkası ışığı takın ve numune tutucunun yaklaşık 1.5 cm üzerine yerleştirin. Halka ışığı için AC/DC kontrol rölesini mikroskop bilgisayarına bağlayın.
    NOT: Bu çalışmadaki deneyler için aydınlatma, görüntüleme yazılımı aracılığıyla bir Transistör-Transistör Mantığı (TTL) arayüzü aracılığıyla kontrol edilmiştir. Epifloresan aydınlatma, harici bir aydınlatma kaynağı mevcut olmadığında LightR yapılarını küresel olarak etkinleştirmek için de kullanılabilir. 490/20 nm uyarma filtresi gibi GFP uyarma dalga boyları, LightR'yi aktive etmede etkilidir.
  2. Odayı önceden 37 ° C'ye ısıtılmış bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve FastLightR-Src-mCherry ve Stargazin-iRFP (Şekil 3B) veya FastLightR-bRaf-Venüs ve mCherry ERK-2 (Şekil 5B) eksprese eden hücreleri seçin.
  3. Küresel aydınlatma ve görüntüleme deneylerinin incelenmesi için, apokromatik düzeltme, düz alan düzeltmesi ve yüksek sayısal diyafram açıklığı ile mikroskop uyumlu, yüksek performanslı objektifler (40x) kullanın.
    1. Src kinazın küresel aydınlatma tabanlı çalışmaları için, FastLightR-Src-mCherry'yi görselleştirmek için 561/10 nm uyarma ve 595/40 nm emisyon filtreleri kullanın ve stargazin-iRFP'yi görselleştirmek için 640/20 nm uyarma ve 655LP emisyon filtresi kullanın.
    2. bRaf kinazın küresel aydınlatma tabanlı çalışmaları için, FastLightR-bRaf-Venus'ü görselleştirmek için 514/10 nm uyarma ve 540/21 nm emisyon filtreleri kullanın ve mCherry-ERK-2'yi görselleştirmek için 561/10 nm uyarma ve 595/40 nm emisyon filtreleri kullanın.
    3. Tüm floresan görüntüleme kanallarında çok bantlı bir polikroik ayna kullanın.
  4. Deneysel koşullara bağlı olarak, aşağıdaki önerileri göz önünde bulundurun.
    1. Hücrelerin temel aktivitesini belirlemek için hücreleri aydınlatmadan en az 10 dakika önce görüntüleyin.
      NOT: Bu taban çizgisi, FastLightR kinazın aydınlatma ile aktivasyonunun hücre davranışında veya protein lokalizasyonunda herhangi bir değişikliğe neden olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Daha fazla istatistiksel anlamlılık sağlamak için daha uzun bazal görüntüleme periyotları da gerçekleştirilebilir.
    2. FastLightRs'ın hızlı inaktivasyon kinetiği nedeniyle, görüntüleme için birçok hücrenin dahil edilmesi, aşama pozisyonları arasında Src / bRaf'ın devre dışı bırakılmasına neden olabilir ve yanıtını azaltabilir. Bu tür bir hatayı önlemek için, açıklanan protokolde FastLightR-Kinaz aktivitesini analiz ederken 4 hücre/dk görüntüleyin ve seçilen her hücreyi toplam 110 dakika boyunca her dakika görüntüleyin (Ek Dosya 2).
    3. Mavi ışığın potansiyel fototoksik etkilerini azaltmak için sürekli aydınlatma yerine darbeli aydınlatma kullanın. 4 hücre/dk'nın her biri için 12 sn aydınlatma etkilidir (Ek Dosya 2, Şekil 3A).
      NOT: Aydınlatma döngüleri, farklı yapılar ve aydınlatma kaynağı türleri için ampirik olarak belirlenmelidir.
    4. Floresan kanallarında sızıntıyı önlemek için hücre görüntüleme sırasında Aydınlatmayı kapatın.
      NOT: Aynı anda çok fazla hücrenin görüntülenmesi, numune için mevcut olan toplam aydınlatma süresini azaltacak ve yetersiz aktivasyondan kaynaklanan zayıflatılmış bir yanıta yol açacaktır.
  5. Görüntülemeden sonra, filmleri bir . Analiz için TIF yığın dosya biçimi.
    NOT: Halka ışığına kıyasla GFP epifloresan ile daha az homojen aydınlatma nedeniyle, GFP epifloresan kullanan deneyler daha sık aydınlatma gerektirecektir. Bu, deney başına daha az hücrenin görüntülenmesine neden olur.

6. FastLightR-Src'nin hücre altı aktivasyonu ve görüntülenmesi (Şekil 4)

  1. Odayı önceden 37 °C'ye ısıtılmış bir mikroskop sahnesine yerleştirin ve hem FastLightR-Src-mCherry hem de Stargazin-iRFP'yi ifade eden tek bir hücre seçin.
  2. Aydınlatmak için hücre içindeki belirli bölgeleri (ROI) seçin. Bu çalışma, seçilen hücrenin çevresinde küçük bir alan seçer.
    NOT: Yerel aydınlatma için, FRAP modunda bir TIRF modülü tarafından odaklanan 445 nm'lik bir lazer veya görüntüleme yazılımı aracılığıyla TTL arayüzü aracılığıyla kontrol edilen mikro ayna cihazı kullanılır. Bu deneyler için herhangi bir desenli aydınlatma sistemi çalışacaktır. Tarama tabanlı bir sistem kullanılıyorsa, hücreye zarar vermeden yeterli aktivasyon için lazer yoğunluğunu ve homojenliğini belirleyin.
  3. Seçilen hücreyi aydınlatmadan önce bazal durumda 20 dakika, yerel olarak aydınlatırken 50 dakika, ardından aktivasyondan 20 dakika sonra toplam 90 dakika boyunca her dakika görüntüleyin (Ek Dosya 2).
  4. Aktivasyon ve deaktivasyon için, LightR proteininin tamamen deaktivasyonuna izin vermek için hedef protein için uygun bir süre sağlayın. FastLightR-Src için, artık aktivitenin azalması için en az 10 dakikalık devre dışı bırakmaya izin verin ve yerel aydınlatma için gösterilen deney kurulumunda 20 dakikalık devre dışı bırakmaya izin verin.
  5. Görüntülemeden sonra filmleri farklı kaydedin. Analiz için TIF yığın dosya biçimi.

7. Hücre yayılma analizi

  1. Veri işleme ve analiz için görüntüleri hazırlayın. Görüntülerin bir . TIF yığın biçimi. Bunları doğrudan görüntüleme yazılımından kaydedin veya açık kaynaklı bir program kullanarak dönüştürün.
  2. CellGeo komut dosyası paketini ek veri sıkıştırılmış dosyalarındanindirin 26.
    NOT: CellGeo paketi birkaç farklı komut dosyası içerir. Protokol bölümleri 7-9'da ele alınan analiz türüne göre listeden istediğiniz paketi seçin.
  3. Hücrenin maskesini oluşturmak için MovThresh adlı betiği açın ve çalıştırın.
    1. Dosya > İçe Aktar'ı (.tif) seçin ve hücrelerin Stargazin-iRFP görüntülerini seçin.
    2. Sol alt köşedeki kaydırma çubuğunu kullanarak çerçeveleri tarayın. Önerilen eşik uygunsa, adım 7.4'e gidin.
    3. Önerilen eşik hücrenin davranışıyla uyumlu değilse, Eğri Seçimi'nin altında düzleştirilmiş veya özel eğrileri seçin. Çerçeveler arasında kaydırarak ve ardından pencerenin sağ tarafındaki eşiği ayarlayarak özel eğriyi oluşturun.
    4. Yeniden Eşik'i tıklayın.
    5. Dosya > Maske olarak kaydet'i tıklatın, Dosyanın adını değiştirin ve Farklı kaydet seçeneğini kullanarak kaydedin.
  4. Yeni oluşturulan yığın dosyasını açık kaynaklı bir görüntü analiz programında açın.
  5. Görüntüyü seçin > > eşiğini ayarlayın > uygulayın.
  6. Analiz et > Parçacıkları analiz et > Görüntü sonuçlarını kontrol et -> Tamam'ı seçin.
  7. Mavi ışık ışınlamasından önce herhangi bir zamanda alanı aynı hücrenin ortalama alanına bölerek her hücre için alandaki değişikliği hesaplayın.
  8. Alan değişikliğini bir çizgi veya çubuk grafik olarak çizin.
  9. Aynı koşullar altında işlem gören tüm hücrelerin her bir zaman noktası için ortalama değeri ve %90 güven aralıklarını hesaplayın.

8. Hücre kenar dinamiği analizi

  1. Protokol bölüm 7'de açıklanan adımları kullanarak yığın dosyalarını hazırlayın.
  2. ProActive adlı betiği açın ve çalıştırın.
    1. Dosya > > Maskelerini İçe Aktar'ı (.tif) seçin ve MovThresh komut dosyası aracılığıyla oluşturulan maskeyi seçin.
    2. Sağ alt köşede analiz etmek için ilgilendiğiniz etkinliği seçin (Çıkıntılı, Geri Çekme veya Toplam).
    3. Normalleştirme türünü seçin. Tipik olarak, bu analizler için alan normalizasyonu kullanılır.
    4. Soldaki kaydırıcıyı kullanarak başlangıç referans çerçevesini seçin. Sağdaki gecikme kaydırıcısı, hücre tarafından kazanılan ve kaybedilen alanı ölçmek için kullanılan iki zaman noktası arasındaki zaman gecikmesini belirleyecektir.
    5. Seçilen kare ve gecikme sayısı filmdeki kare sayısından farklı olarak büyükse, önizleme görüntüsü görüntülenmez. Bu değerleri, toplam kare sayısından daha az olacak şekilde sıfırlayın.
  3. Sonuçlar bölümünün altındaki Düzgün Eğri kutusunu işaretleyerek çıkıntı veya geri çekme eşiğini değiştirin. Bu, belirli bir penceredeki eşiklerin ortalamasını alır ve bu da küçük dalgalanmaların etkinlik olarak algılandığı sorunları çözebilir.
  4. Çerçeve ve gecikme kaydırıcıları tarafından belirtilen süre boyunca etkinliği hesaplamak için Aralığı Çalıştır'ı seçin.
  5. Dosya > Farklı Kaydet > Sonuçları (.mat) seçerek sayısal verileri kaydedin ve ortalama çıkıntılı veya geri çekmeli etkinliği belirlemek için kullanın.
  6. Her zaman noktası için %90 güven aralıklarını belirleyin.
    NOT: Bu, birkaç farklı değerden oluşan bir diziyi kaydedecektir. Komut dosyasıyla birlikte verilen "ProActive nasıl kullanılır" metin dosyası, her bir değerin neyi temsil ettiğine ve bunların nasıl belirlendiğine dair ayrıntılı bir açıklama sağlar26.
  7. Dosya > Farklı Kaydet > Görüntüler (.tif) seçerek etkinliğin görsel temsilini kaydedin.

9. Centroid kayma analizi

  1. Centroid kayma analizi için, centroid koordinatlarını belirleyebilen herhangi bir yazılım kullanın.
  2. Analiz yazılımında, protokol bölüm 7'de açıklandığı gibi ilgilenilen hücrenin maskelenmiş görüntü yığınını açın.
  3. Ölç > Entegre Morfometri Analizi'ni seçin ve ardından Tercihler'e tıklayın > Centroid İşareti Çiz > Kontrol Et'e tıklayın, ardından Ölç'ü seçin.
    1. Hareketten önce merkez koordinatlarını kaydedin (A).
    2. Deneyin sonunda merkez koordinatlarını kaydedin (B).
    3. Aydınlatma düzeninin (C) merkezinin koordinatlarını kaydedin.
  4. Artık üç nokta toplandığına göre, BAC8 açısını figure-protocol-29728 belirleyin. θ1, ABC açısına figure-protocol-29865 karşılık gelir ve θ2, CBA açısına figure-protocol-30008 karşılık gelir (Şekil 4Cii). Bunu aşağıdaki denklemi kullanarak yapın:
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    NOT: Kullanım kolaylığı için açıları ve mesafeleri doğrudan koordinatlardan belirlemek için bir hesap makinesi kullanılabilir.
  5. Hücre sentroidinin piksel cinsinden kat ettiği mesafeyi, 1 pikselin 0,4 μm'ye eşit olduğu dönüştürme faktörü ile çarparak merkez yer değiştirmesini belirleyin. Piksellerin mesafeye özel dönüşümü, sistemdeki büyütme ve kamera kurulumuna bağlı olacaktır.
  6. Merkez kayma açısı ve mesafesi belirlendikten sonra, kutupsal koordinatların görüntülerini üretebilen bir grafik yazılımı açın.
  7. Merkez kayma açısını θ ölçümü olarak ve kat edilen mesafeyi yarıçap olarak ekleyin. %95 güven aralıklarını test etmek için ANOVA'yı kullanın.
  8. Sonuçları çizin ve görüntüyü kaydedin.

Sonuçlar

LightR-Src, Şekil 1A,B'de açıklanan stratejiye göre tasarlanmış ve üretilmiştir. LightR-Src'nin biyokimyasal analizi, 60 dakikalık sürekli aydınlatmada mavi ışığa yanıt olarak bilinen endojen Src substratlarının, p130Cas (Y249)22 ve paxillin (Y118)23'ün fosforilasyonuna erişir (Şekil 2B). Özellikle, LightR-Src, transfeksiyondan sonra 16-18 saa...

Tartışmalar

Çalışmamız, çeşitli sinyal yollarının araştırılması için optogenetik bir yaklaşım sunmakta ve farklı biyolojik soruların ele alınmasında geniş uygulanabilirliğini göstermektedir. LightR araç sistemi birkaç önemli avantaj sağlar: (1) Protein aktivitesinin allosterik regülasyonu, (2) Farklı aktivasyon ve inaktivasyon kinetiği elde etmek için ayarlanabilen aktivitenin sıkı zamansal kontrolü, (3) Subselüler düzeyde aktivitenin uzamsal çözünürlüğü, (4...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, LightR enzimlerinin ve ilgili protokollerin geliştirilmesine yaptığı katkılardan dolayı Dr. Mark Shaaya'ya teşekkür eder. pCAG-iCre, Wilson Wong'dan (Addgene plazmid #89573) bir hediyeydi, pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry, Mositoshi Sato'dan (Addgene plazmid #122963) bir hediyeydi, V600E mutasyonu taşıyan bRaf-Venüs yapısı, Dr. John O'Bryan'dan (MUSC) bir hediyeydi; pCEFL-ERK2'den (Dr. Channing Der'in laboratuvarından bir hediye, UNC) ERK2 geni, mCherry-ERK2 plazmidi elde etmek için mCherry-C1 omurgasına klonlandı; ve pmiRFP670-N1, Vladislav Verkhusha'dan (Addgene plazmid # 79987) bir hediyeydi. Çalışma, AK'ye R33CA258012, R35GM145318 ve P01HL151327 NIH hibeleri ile desteklendi. Bu çalışma, NL'ye T32HL144459 T32 VBST eğitim bursu tarafından daha da desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm RoundWarner Instruments 64-0715 
1.5 mL Tubes USA Scientific cc7682-3394
2x Laemmli BufferFor 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBiorad4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
60 LED Microscope Ring LightBoli OpticsML46241324Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose GoldBiotechA-201
Anti-Erk 1/2 AntibodyCell Signaling9102
Anti-GAPDH AntibodyinvitrogenAM4300
Anti-GFPClontech632380
Anti-mCherry AntibodyinvitrogenM11217
Anti-MEKCell Signaling9122
Anti-p130CasBD Biosciences610271
Anti-paxillinCell Signaling2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 AntibodyCell Signaling9101
Anti-phospho-pY249 p130CasCell Signaling4014
Anti-phospho-Y118 PaxillinCell Signaling2541
Anto-phospho-S217/221 MEKCell Signaling9121
Arduino Compatable Power SupplyCorporate ComputerLJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎A000066
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered 
bRaf-V600E-VenusGift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA GoldBiotechA-420 
Carbenicillin (Disodium)Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dyeinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMix Genesee42-138
DH5a competent cells NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEBN04475
Dpn1 Enzyme NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents 
EGTAAcros 409910250
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent PromegaE2692Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain GoldBioG-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x NEBB7024A
GeneJET Gel extraction Kit Thermo Scientific K0692Gel Extraction Kit 
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Scientific K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL 
HEK 293T Cells ATCC CRL-11268
HeLa Cells ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Iot RelayDigital LoggersDLI 705020645490AC/DC control relay for illumination
Kanamycin MonosulfateGold BiotechnologyK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1xCorning 10-045-CV 
LB Agar FisherBP1425-2
LED Grow Light SystemHQRP884667106091218LED panel lamp system 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024aSoftware for running CellGEO Scripts
MetamorphMolecular DevicesImaging Analysis Software
MgCl2 Fisher ChemicalM33-500
Mineral OilSigma M5310
MiniPrep Kit Gene Choice 96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 wellBio-Rad4561085
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CV 
Multiband Polychroic Mirror89903BSChroma
NaCl Fisher ChemicalS271-3 
PBS w/o Ca and Mg Corning 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ERK2Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes labForce1149Z650.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps 
Phusion Plus DNA PolymeraseThermo Scientific F630S
pmiRFP670-N1Addgene#79987
Polygon 400 Patterned IlluminatorMightexDSI-G-00C
Primers IDT
PVDF MembranesBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches 
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodiumCorning 25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Fischer BP1332-1 For electrophoresis 
UPlanSApo 40x Microscope ObjectiveOlympus1-U2B828
USB TTL BoxNational Instruments6501For TTL interface
β-MercaptoethanolFisher Chemical O3446I-100

Referanslar

  1. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
  2. Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat Chem Biol. 12 (12), 1059-1064 (2016).
  3. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  4. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  5. Diaz, J. E., et al. A split-Abl kinase for direct activation in cells. Cell Chem Biol. 24 (10), 1250-1258.e4 (2017).
  6. Hongdusit, A., Zwart, P. H., Sankaran, B., Fox, J. M. Minimally disruptive optical control of protein tyrosine phosphatase 1B. Nat Commun. 11 (1), 788 (2020).
  7. Wang, J., et al. Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature. 569 (7757), 509-513 (2019).
  8. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  9. Zhou, X. X., Fan, L. Z., Li, P., Shen, K., Lin, M. Z. Optical control of cell signaling by single-chain photoswitchable kinases. Science. 355 (6327), 836-842 (2017).
  10. Shaaya, M., et al. Light-regulated allosteric switch enables temporal and subcellular control of enzyme activity. Elife. 9, e60647 (2020).
  11. Chu, P. H., et al. Engineered kinase activation reveals unique morphodynamic phenotypes and associated trafficking for Src family isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12420-12425 (2014).
  12. Kaplan, K. B., Swedlow, J. R., Morgan, D. O., Varmus, H. E. c-Src enhances the spreading of src-/- fibroblasts on fibronectin by a kinase-independent mechanism. Genes Dev. 9 (12), 1505-1517 (1995).
  13. Nihongaki, Y., Suzuki, H., Kawano, F., Sato, M. Genetically engineered photoinducible homodimerization system with improved dimer-forming efficiency. ACS Chem Biol. 9 (3), 617-621 (2014).
  14. Vaidya, A. T., Chen, C. H., Dunlap, J. C., Loros, J. J., Crane, B. R. Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci Signal. 4 (184), ra50 (2011).
  15. Zoltowski, B. D., Crane, B. R. Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry. 47 (27), 7012-7019 (2008).
  16. Zoltowski, B. D., et al. Conformational switching in the fungal light sensor vivid. Science. 316 (5827), 1054-1057 (2007).
  17. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  18. Zoltowski, B. D., Vaccaro, B., Crane, B. R. Mechanism-based tuning of a LOV domain photoreceptor. Nat Chem Biol. 5 (11), 827-834 (2009).
  19. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: Design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. 53 (1), 14.13.1-14.13.16 (2011).
  20. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6 (1), 6256 (2015).
  21. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Cunningham-Edmondson, A. C., Hanks, S. K. p130Cas substrate domain signaling promotes migration, invasion, and survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 1, 39-52 (2009).
  23. Sachdev, S., Bu, Y., Gelman, I. H. Paxillin-Y118 phosphorylation contributes to the control of Src-induced anchorage-independent growth by FAK and adhesion. BMC Cancer. 9, 12 (2009).
  24. Cope, N., et al. Mechanism of BRAF activation through biochemical characterization of the recombinant full-length protein. ChemBioChem. 19 (18), 1988-1997 (2018).
  25. Singhal, A., Li, B. T., O'Reilly, E. M. Targeting KRAS in cancer. Nat Med. 30 (4), 969-983 (2024).
  26. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  27. Kaimachnikov, N. P., Kholodenko, B. N. Toggle switches, pulses and oscillations are intrinsic properties of the Src activation/deactivation cycle. FEBS J. 276 (15), 4102-4118 (2009).
  28. Burack, W. R., Shaw, A. S. Live cell imaging of ERK and MEK. J Biol Chem. 280 (5), 3832-3837 (2005).
  29. Baaske, J., et al. Dual-controlled optogenetic system for the rapid down-regulation of protein levels in mammalian cells. Sci Rep. 8 (1), 15024 (2018).
  30. Dagliyan, O., et al. Computational design of chemogenetic and optogenetic split proteins. Nat Commun. 9 (1), 4042 (2018).
  31. Harmer, Z. P., et al. Dynamic multiplexed control and modeling of optogenetic systems using the high-throughput optogenetic platform, Lustro. ACS Synth Biol. 13 (5), 1424-1433 (2024).
  32. Liu, Q., Tucker, C. L. Engineering genetically-encoded tools for optogenetic control of protein activity. Curr Opin Chem Biol. 40, 17-23 (2017).
  33. Morikawa, K., et al. Photoactivatable Cre recombinase 3.0 for in vivo mouse applications. Nat Commun. 11 (1), 2141 (2020).
  34. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr Opin Chem Biol. 15 (6), 789-797 (2011).
  35. Wu, J., et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 11 (1), 3708 (2020).
  36. Conlon, P., Gelin-Licht, R., Ganesan, A., Zhang, J., Levchenko, A. Single-cell dynamics and variability of MAPK activity in a yeast differentiation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), E5896-E5905 (2016).
  37. Jacquel, A., et al. Colony-stimulating factor-1-induced oscillations in phosphatidylinositol-3 kinase/AKT are required for caspase activation in monocytes undergoing differentiation into macrophages. Blood. 114 (17), 3633-3641 (2009).
  38. Kholodenko, B. N. Negative feedback and ultrasensitivity can bring about oscillations in the mitogen-activated protein kinase cascades. Eur J Biochem. 267 (6), 1583-1588 (2000).
  39. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 165-176 (2006).
  40. Li, Y., Roberts, J., Aghdam, Z. A., Hao, N. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) dynamics determine cell fate in the yeast mating response. J Biol Chem. 292 (50), 20354 (2017).
  41. Maeda, M., et al. Periodic signaling controlled by an oscillatory circuit that includes protein kinases ERK2 and PKA. Science. 304 (5672), 875-878 (2004).
  42. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  43. Roche, S., Fumagalli, S., Courtneidge, S. A. Requirement for Src family protein tyrosine kinases in G2 for fibroblast cell division. Science. 269 (5230), 1567-1569 (1995).
  44. Klomp, J. E., et al. Mimicking transient activation of protein kinases in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 14976-14981 (2016).
  45. Karginov, A. V., et al. Dissecting motility signaling through activation of specific Src-effector complexes. Nat Chem Biol. 10 (4), 286-290 (2014).
  46. Cary, L. A., Klinghoffer, R. A., Sachsenmaier, C., Cooper, J. A. Src catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol. 22 (8), 2427-2440 (2002).
  47. Fu, P., et al. Sphingolipids signaling in lamellipodia formation and enhancement of endothelial barrier function. Curr Top Membr. 82, 1-31 (2018).
  48. Tian, X., Zhou, B. Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. J Biol Chem. 296, 100509 (2021).
  49. Abremski, K., Hoess, R., Sternberg, N. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: Evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32 (4), 1301-1311 (1983).
  50. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259 (3), 1509-1514 (1984).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Uzay zamansal KontrolProtein AktivitesiOptogenetikEnzim Reg lasyonuAllosterik KontrolI k Ayarl Allosterik AnahtarLightRCanl Fotoresept r AlanlarMavi I kSrc Tirozin KinazKatalitik AlanH cre Alt HassasiyetSinyal YolaklarMekanistik Sorular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır