Contrôle spatio-temporel de l’activité des protéines par la régulation allostérique optogénétique

Résumé

Ce protocole décrit l’application d’un domaine d’interrupteur allostérique activé par la lumière bleue (LightR) pour un contrôle spatio-temporel réversible de l’activité protéique. En utilisant la tyrosine kinase Src comme modèle, cette étude propose un protocole élaboré pour développer et caractériser la Src régulée par la lumière (LightR-Src). Il démontre la polyvalence de cette approche dans toutes les classes d’enzymes.

Résumé

L’optogénétique offre la possibilité d’imiter un contrôle spatio-temporel complexe de l’activité enzymatique jusqu’à une résolution subcellulaire. Cependant, la plupart des approches optogénétiques sont souvent confrontées à des défis importants lorsqu’il s’agit d’intégrer plusieurs capacités dans un seul outil applicable à un large éventail de protéines cibles. Obtenir un contrôle précis de la cinétique ON/OFF, garantir une fuite minimale dans l’obscurité et démontrer des performances efficaces dans des cellules de mammifères avec une précision subcellulaire sont quelques-uns des défis les plus courants rencontrés dans ce domaine. Une solution prometteuse réside dans l’application de domaines sensibles à la lumière conçus de manière rationnelle pour contrôler allostériquement l’activité des protéines. En utilisant cette stratégie, nous avons généré une méthode optogénétique combinant toutes les caractéristiques souhaitées. L’approche implique l’incorporation du module de commutation allostérique régulé par la lumière (LightR) dans la protéine cible pour réguler l’activité enzymatique à l’aide de la lumière bleue (465 nm). Le domaine LightR est généré en liant deux domaines photorécepteurs Vivid (VVD), créant ainsi une pince sensible à la lumière qui peut être incorporée dans une petite boucle flexible au sein du domaine catalytique d’une enzyme. Dans son état sombre, la pince LightR est ouverte, déformant ainsi le domaine catalytique de l’enzyme et l’inactivant. Lors de l’exposition à la lumière bleue, le domaine LightR se ferme et restaure la structure et l’activité enzymatique du domaine catalytique. Dans ce manuscrit, nous discutons de stratégies de conception pour générer une protéine kinase régulée par la lumière et démontrons son contrôle par la lumière bleue, la réversibilité, la cinétique et la régulation précise au niveau subcellulaire, permettant une précision spatio-temporelle serrée. En utilisant la tyrosine kinase Src comme modèle, nous présentons un protocole pour réguler efficacement l’activité de la kinase LightR-Src. Nous démontrons également l’applicabilité de LightR à différentes classes d’enzymes, élargissant ainsi l’utilité du système d’outils pour répondre aux questions mécanistes des voies de signalisation dans différentes maladies.

Introduction

La capacité de la cellule à interpréter les signaux externes et à les convertir en réponses spécifiques dans des contextes physiologiques ou pathologiques est dirigée par des groupes de protéines dédiés. La contribution de toute protéine à des réponses aussi complexes est souvent définie par son emplacement subcellulaire, son niveau d’expression et le moment de l’activation transitoire, soutenue ou oscillatoire. Disséquer le rôle de ces paramètres individuels dans la régulation de la signalisation exige des méthodes capables de reproduire un contrôle spatio-temporel complexe de l’activité des protéines au niveau subcellulaire. Les tec....

Protocole

1. Conception et développement de LightR (Figure 1)

1. Planification stratégique
   REMARQUE : Le domaine LightR est composé de deux domaines photorécepteurs Vivid (VVD) connectés en tandem de Neurospora crassa^13,14,15,16. Les VVD s’homodimérisent en présence de lumière, et une telle dimérisation implique un changement de conformation qui amène l’extrémité N-terminale d’un monomère VVD à côté de l’extrémité C-terminale d’un autre monomè....

Discussion

Notre étude présente une approche optogénétique pour l’étude de diverses voies de signalisation et démontre sa large applicabilité pour répondre à différentes questions biologiques. Le système d’outils LightR offre plusieurs avantages essentiels : (1) Régulation allostérique de l’activité protéique, (2) Contrôle temporel serré de l’activité qui peut être ajusté pour obtenir différentes cinétiques d’activation et d’inactivation, (3) Résolution spatiale d.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100